0378-1844/02/01/028-05

Recibido: 27/08/2001. Modificado: 20/11/2001. Aceptado: 14/12/2001

EFECTO DE ENZIMAS FIBROLÍTICAS EXÓGENAS EN LA

DIGESTIBILIDAD IN VITRO DE LA PARED CELULAR DE HENO DE

ALFALFA (Medicago sativa) O DE BALLICO (Lolium perenne)

Juan Manuel Pinos-Rodríguez, Sergio Segundo González Muñoz,

Germán David Mendoza Martínez, Ricardo Bárcena Gama y Mario Cobos Peralta

PALABRAS CLAVE / Enzimas Fibrolíticas / Digestibilidad in vitro / Ballico / Alfalfa / Pared Celular /

Juan Manuel Pinos Rodríguez. Medico Veterinario Zootecnista, Maestro y Doctor en Ciencias en Nutrición de Rumiantes. Investigador Nacional. Profesor Investigador del Instituto de Investigación de Zonas Desérticas de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí, México. Dirección: Altair 200, Fracc. del Llano. C.P. 78377. San Luis Potosí, S.L.P. México. e-mail: jmpr@starmedia.com

Sergio Segundo González Muñoz, Germán David Mendoza Martínez, Ricardo Bárcena Gama y Mario Cobos Peralta. Doctores en Ciencias, Especialidad en Ganadería. Investigadores Nacionales y Profesores Investigadores Titulares del Colegio de Postgraduados, Montecillo, México.

Resumen

Se midió la degradación in vitro de enzimas fibrolíticas exógenas y su efecto en la degradación in vitro de FDN y FDA de heno de alfalfa o ballico. Se usó la primera fase de Tilley y Terry (0, 3, 6, 12, 24, 48 y 72h) con saliva McDougall (S) sola o con líquido ruminal (LR). La desaparición de la enzima (E) fue constante de 0 a 6h, y aumentó de 12 a 72h. La concentración de N-NH4 fue constante de 0 a 24h y su mayor valor fue a las 72h. La desaparición de FDN de los forrajes se incrementó de 6 a 72h con la E y de 24 a 72h con E + LR. Además, E aumentó la desaparición de FDA de alfalfa de 3 a 72h y la del ballico de 3 a 12h; pero E + LR no cambió la desaparición de FDA. La E con LR aumentó la desaparición neta de FDN de ambos forrajes a las 48 y 72h, pero redujo la desaparición neta de FDA del ballico a las 12h, en tanto que no hubo diferencias para la FDA de la alfalfa. En las primeras 12h no se digirieron las enzimas del producto enzimático, el cual tiene un efecto positivo importante en la digestibilidad in vitro de la pared celular del heno de alfalfa y de ballico, aún en presencia de microorganismos ruminales.

Summary

This study was done to evaluate in vitro degradation of exogenous fibrolytic enzymes and its effects on in vitro degradation of NDF and ADF of alfalfa or rye grass hay. First phase of Tilley and Terry (0, 3, 6, 12, 24, 48 and 72h) was carried out using McDougall saliva alone (S) or with rumen fluid (RF). Enzyme (E) disappearance was constant from 0 to 6h, then increased from 12 to 72h. Concentration of N-NH4 was constant during the first 24h and its highest value was reached at 72h. Forages NDF disappearance was increased from 6 to 72h by E, and from 24 to 72h by E + RF. Besides, E increased ADF disappearance from 3 to 72h for alfalfa and from 3 to 12h for rye grass; however, E + RF did not change ADF disappearance. The effect of E + RF was to increase NDF net disappearance of both forages at 48 and 72h, and to reduce ADF net disappearance of rye grass at 12h, without changing that of alfalfa. For the first 12h there was no digestion of the enzymes of the exogenous fibrolytic enzymatic product, which has an important positive effect on in vitro cell wall digestibility of alfalfa and rye grass, even when ruminal microorganisms are present.

Resumo

Foi medida a degradação in vitro de enzimas fibrolíticas exógenas e seu efeito na degradação in vitro de FDN e FDA de heno de alfafa ou gramínea. Foi usada a primera fase de Tilley e Terry (0, 3, 6, 12, 24, 48 e 72 h) com saliva McDougall (S) só ou com líquido ruminal (LR). O desaparecimento da enzima (E) foi constante de 0 a 6h, e aumentou de 12 a 72h. A concentração de N-NH4 foi constante de 0 a 24h e seu maior valor foi às 72h. O desaparecimento de FDN das forragens se incrementou de 6 a 72h com a E e de 24 a 72h com E + LR. Além de, E aumentou o desaparecimento de FDA de alfafa de 3 a 72h e a da gramínea de 3 a 12h; mas E + LR não mudou o desaparecimento de FDA. A E com LR aumentou o desaparecimento líquido de FDN de ambas forragens às 48 e 72h, mas reduz o desaparecimento líquido de FDA da gramínea às 12h, no entanto não houve diferenças para a FDA da alfafa. Nas primeiras 12h não se digeriram as enzimas do produto enzimático, o qual tem um efeito positivo importante na digestibilidade in vitro da parede celular do feno de alfalfa e da gramínea, ainda em presença de microorganismos ruminais.

 

Introducción

En la mayoría de los países latinoamericanos y del mundo, los forrajes constituyen aproximadamente 80% del alimento consumido por los rumiantes durante toda su vida productiva, siendo así la base de su alimentación (González, 1993). La pared celular es el mayor constituyente orgánico de los forrajes, ya que comprende del 40 al 80% de la materia seca y está constituida por polisacáridos estructurales como celulosa, hemicelulosa y pectina. En el rumen del 40 al 80% de esos polímeros son fermentados por diversas especies de microorganismos, pero el 20 al 60% restante no es utilizado (Van Soest, 1994). Las enzimas fibrolíticas exógenas asperjadas a los forrajes se han utilizado para incrementar la digestibilidad de la pared celular (Feng et al., 1996; Beauchemin et al., 1997; Jeremiah et al., 1998; Krause et al., 1998). Sin embargo, la adición directa de estos aditivos a la dieta de los rumiantes ha sido poco investigada (Lewis et al., 1996; Tricarico et al., 1998) y con resultados inconsistentes, lo cual se atribuye principalmente a su potencial degradación por los microorganismos ruminales (Chesson, 1993). En los últimos años, grupos de enzimas en los extractos de la fermentación de hongos (Aspergillus niger y Trichoderma viride) han sido protegidos mediante glucosilación para disminuir su digestibilidad y prolongar su viabilidad en el rumen (Howes et al., 1998). El objetivo de este experimento fue medir la degradación in vitro de enzimas fibrolíticas exógenas glucosiladas y su efecto en la digestibilidad de la pared celular de henos de alfalfa (Medicago sativa) y pasto ballico (Lolium perenne) en presencia o ausencia de fluido ruminal.

 

Materiales y Métodos

De un novillo Holstein (460kg peso vivo) con cánula ruminal y alimentado ad libitum a las 8:00 a.m. con heno de alfalfa (Medicago sativa), se colectaron muestras de líquido ruminal 1h antes de la alimentación. El forraje fue heno de alfalfa o pasto ballico (Lolium perenne) cortados y henificado a la intemperie. En el producto enzimático fibrolítico exógeno (enzima) y henos (Tabla I) se midió la materia seca (MS), materia orgánica (MO), proteína cruda (PC) y cenizas (AOAC, 1990), así como la fibra detergente neutro (FDN) y ácido (FDA) por la técnica de Goering y Van Soest (1970). La digestibilidad in vitro (0, 3, 6, 12, 24, 48 y 72h) se hizo con la primera fase de la técnica de Tilley y Terry (1963) para la cual se mezcló saliva de McDougall (1948) y líquido ruminal en una relación 4:1. El producto enzimático (Fibrozyme Alltech, Nicholasville, KY) es un polvo granular que contiene una combinación de extractos de la fermentación de Aspergillus niger y Trichoderma viride y fermentos solubles, protegidos mediante glucosilación, con una actividad xilanásica de 100U×g-1 (una unidad xilanásica es la cantidad de enzima necesaria para liberar un µmol de xilosa).

Los datos se analizaron como un diseño completamente al azar usando SAS (1985) y la prueba de medias de Tukey (Steel y Torrie, 1986), con la interacción tratamiento x corrida como un criterio de error ya que las digestibilidades se efectuaron dos veces.

Fase 1

Se midió la desaparición in vitro de MS de la enzima y la concentración de NH4 para evaluar la degradación de proteína enzimática (NRC, 1985; Cleale et al., 1987) en el Laboratorio de Microbiología Ruminal de la Especialidad de Ganadería del Colegio de Postgraduados. Para la digestibilidad in vitro (Tilley y Terry, 1963) se usaron 0 ó 500mg de la enzima (50U xilanásicas) en tubos de polipropileno y se mezclaron con dos medios: a) 100% saliva de McDougall (S); b) 80% saliva de McDougall + 20% líquido ruminal (LR). De los tubos de incubación (0, 3, 6, 12, 24, 48 y 72h), se colectaron 10ml de líquido y se colocaron en tubos con 0,5ml de HCl al 50%. Esta mezcla se centrifugó (3500g por 25 min) y el sobrenadante se colocó en frascos de 20ml que contenían 1ml de buffer para medir la concentración de NH4 usando un potenciómetro (Orion 710A) con electrodo selectivo para ión amonio.

Los datos se analizaron según un diseño completamente al azar con un arreglo factorial 2 x 2 x 6 (medio S y LR; enzima 0 y 500; seis tiempos de incubación). También se analizó el efecto lineal y cuadrático de la desaparición de MS de la enzima y la concentración de NH4 (SAS, 1985).

Fase 2

En esta fase se midió el efecto de la enzima en la digestibilidad in vitro de la FDN y FDA de henos de alfalfa o ballico, usando 500mg de substrato en tubos de polipropileno con 100mg de la enzima (10U xilanásicas por cada 500mg de sustrato). Como medios se usó la mezcla de saliva de McDougall + líquido ruminal (LR) ó saliva de McDougall (S) para evaluar la actividad de la enzima sin los microorganismos del líquido ruminal. Para medir y comparar el efecto de la enzima con los medios, se calculó la desaparición neta de los substratos como la diferencia del porcentaje de desaparición de los substratos con y sin enzima. La metodología para la digestibilidad in vitro y tiempos (seis) de incubación se describió en la Fase 1.

Los substratos de FDN y FDA de alfalfa y ballico se prepararon moliendo los forrajes en un molino (malla de 1mm), se colocaron 500g de las muestras en una bolsa de poliseda (tamaño de poro 52 ±10µm) y se pusieron en un recipiente con 12 litros de una solución detergente neutro o ácido (Goering y Van Soest, 1970) durante 1h a 90°C. Luego las bolsas y los residuos insolubles en el detergente ácido o neutro se lavaron y secaron en una estufa de aire forzado a 55°C. En las muestras se midió FDA y FDN (Goering y Van Soest, 1970) de los forrajes y residuos de FDN y FDA.

El diseño experimental fue completamente al azar con un arreglo factorial 2 x 2 x 6 (enzima 0 y 500; forraje, alfalfa y ballico; seis tiempos de incubación) para el efecto de la enzima en los forrajes; y fue 2 x 2 x 6 (medios S y LR; forraje, alfalfa y ballico; seis tiempos de incubación) para estimar la diferencia entre medios y forrajes. Los datos se analizaron con el procedimiento GLM de SAS (1985).

 

Resultados y Discusión

Fase 1

La enzima tuvo mayor degradación (P<0,0001) en el medio con fluido ruminal (LR) comparado con el medio con saliva (S), debido a la actividad de fermentación que hacen los microorganismos ruminales (Tabla II). La desaparición de la enzima fue constante (44,1 a 42,6%) en las primeras 6h de incubación in vitro con LR, pero cuando la incubación llegó a 12h la desaparición aumentó y permaneció constante hasta las 72h (51,6%), lo cual representa la fracción soluble asociada al contenido celular (58,2%); además, conforme se incrementó la incubación de 3 a 72h, la respuesta de desaparición de la enzima (Tabla II) fue cuadrática (P<0,02).

Durante toda la incubación, para la enzima con LR hubo mayor (P<0,0001) concentración de NH4, cuyo nivel fue constante de 0 a 48h pero se incrementó significativamente a las 72h, lo cual se puede atribuir a la degradación de la enzima. La concentración de NH4 de la enzima incubada con S fue lineal de las 3 a las 72h, es decir, esta variable aumentó linealmente con el tiempo de incubación; pero con LR la concentración de NH4 tuvo una respuesta cuadrática (Figura 1). Estos resultados indican que las enzimas del producto enzimático no se disuelven ni digieren durante las primeras 12h de incubación in vitro. Morgavi et al. (2001) en estudios in vitro encontraron que enzimas fibrolíticas exógenas en presencia de líquido ruminal permanecen estables y activas el tiempo necesario para llevar acabo su acción sobre los sustratos. Asimismo, Tricarico et al. (1998) encontraron que enzimas exógenas incrementaron la digestibilidad in vitro de festuca (Festuca arundinaceae) en las primeras 12h, pero después de 18h de incubación no hubo cambios en la digestibilidad, posiblemente como resultado de su degradación por las proteasas de las bacterias ruminales.

Fase 2

La desaparición de FDA a las 3, 6, 12, 24 y 48h fue mayor en el heno de alfalfa que en el de ballico en ausencia del fluido ruminal; asimismo, la desaparición de FDA del heno de alfalfa a las 3, 6, 12 y 24h de incubación fue significativamente mayor que el heno de ballico, aunque a las 48 y 72h fue significativamente menor. Por su parte, la desaparición de FDN del heno de ballico a las 48 y 72h de incubación con fluido ruminal fue mayor que la FDN del heno de alfalfa, pero la desaparición de FDA fue similar para ambos henos. Galyean y Goetsch (1993) mencionaron que la digestibilidad de MS y MO son generalmente mayores en las leguminosas que en los pastos, pero la digestibilidad de la pared celular puede ser menor a causa del mayor contenido de lignina en las leguminosas, aunque también indicaron que en ciertas ocasiones la digestión de la pared celular es similar para ambos forrajes.

La desaparición de FDN de alfalfa y ballico se incrementó significativamente por efecto de la enzima de las 6 a las 72h de incubación (Tabla III), pero en presencia de fluido ruminal (Tabla IV) aumentó la desaparición de FDN a partir de las 24h de incubación. Por otro lado, la enzima aumentó la desaparición de FDA (Tabla V) de la alfalfa a las 3, 12, 24, 48 y 72h de incubación, mientras que la desaparición de FDA de ballico aumentó de las 3 a las 12h; sin embargo, la enzima y el líquido ruminal no tuvieron efectos en la desaparición de FDA en ambos forrajes (Tabla VI). Los resultados anteriores sugieren que las enzimas fibrolíticas exógenas necesarias para degradar la celulosa contenida en la FDA de los forrajes pueden ser digeridas por las proteasas de los microorganismos ruminales. La desaparición neta de FDN (Tabla VII) de ambas especies forrajeras causada por la enzima en presencia del fluido ruminal, se incrementó (P<0,05) a las 48 y 72h de incubación comparada con la desaparición neta en ausencia del fluido ruminal. La desaparición neta de FDA (Tabla VII) del ballico causada por la enzima disminuyó a las 12h en presencia del fluido ruminal comparada con aquella donde el fluido no estaba presente en el medio, aunque la desaparición neta de FDA de alfalfa fue similar. Lo anterior sugiere que las enzimas fibrolíticas exógenas (celulasas y hemicelulasas) pueden ser degradadas en tiempos diferentes por los microorganismos ruminales. Además, las diferencias en la capacidad de las enzimas para degradar los componentes de la fibra de alfalfa y ballico pueden estar relacionadas con las diferencias en la estructura y composición de la pared celular de ambos henos.

Tricarico et al. (1998) encontraron que la digestibilidad in vitro de MS de la festuca (Festuca arundinaceae) y la tasa de utilización de hexosa se incrementaron por efecto de enzimas fibrolíticas en las primeras 12h de incubación, sin ningún efecto después de las 18h; por tanto, estas enzimas podrían, mejorar la digestibilidad de forrajes a través de la modificación de la actividad de los microorganismos ruminales. Al medir la tasa inicial de desaparición in vitro de FDN por efecto de las bacterias contenidas en líquido ruminal con preparaciones enzimáticas, se encontró que los incrementos en la digestibilidad de la fibra están asociados con el aumento de la tasa inicial de desaparición de la fibra (Dawson y Tricarico, 1999).

Los resultados obtenidos en el presente experimento demuestran que las enzimas fibrolíticas exógenas incrementaron la digestibilidad in vitro de FDN de los forrajes cuando los tiempos de incubación se extendieron hasta las 72h en presencia de microorganismos ruminales, lo que concuerda con las observaciones hechas por Titi et al. (1998) quienes encontraron que enzimas fibrolíticas asperjadas a heno de alfalfa aumentaron la digestibilidad in vitro de MS de las 0 hasta las 36h de incubación.

 

Conclusiones

Las enzimas fibrolíticas glucosiladas del producto enzimático no fueron digeridas durante las primeras 12h de incubación in vitro. Las enzimas exógenas incrementaron la desaparición in vitro de FDN de ambos forrajes y la desaparición de FDA de alfalfa (3 a 72h) y de ballico (3 a 12h) sin líquido ruminal (LR). La desaparición de FDN de los forrajes indica que las enzimas fibrolíticas exógenas tiene un efecto similar con o sin líquido ruminal en las primeras 12h de incubación. Sin embargo, estas enzimas en tiempos de incubación prolongados (mayores a 24h) y en presencia de fluido ruminal incrementaron la desaparición de FDN del heno de la alfalfa y del ballico. En consecuencia, de acuerdo a las condiciones experimentales descritas, estas enzimas fibrolíticas exógenas glucosiladas tienen efectos positivos importantes en la degradación in vitro de los componentes de la pared celular del heno de alfalfa y de ballico, lo cual podría ser de gran utilidad en experimentos in vivo. Es necesario investigar los posibles mecanismos sinergicos por los cuales las enzimas de los microorganismos ruminales y las enzimas fibrolíticas exógenas mejoran la desaparición de FDN del heno de alfalfa y ballico.

 

 

REFERENCIAS

 

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