Juan Manuel Pinos Rodríguez. Medico Veterinario Zootecnista, Maestro y Doctor en Ciencias en Nutrición de Rumiantes. Investigador Nacional. Profesor Investigador del Instituto de Investigación de Zonas Desérticas de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí, México. Dirección: Altair 200, Fracc. del Llano. C.P. 78377. San Luis Potosí, S.L.P. México. e-mail:jmpr@starmedia.com

Sergio Segundo González Muñoz y Germán David Mendoza Martínez. Doctores en Ciencias, Especialidad en Ganadería. Investigadores Nacionales y Profesores Investigadores del Colegio de Postgraduados, Montecillo, México.

Ángel Martínez Garza. Doctor en Ciencias, Especialidad en Estadística. Investigador Nacional y Profesor Investigador del Colegio de Postgraduados, Montecillo, México.

Se usaron cuatro modelos estadísticos para analizar un experimento de degradación in vitro de la MS de heno de alfalfa y de ballico utilizando la primera fase de Tilley y Terry a las 48h, por duplicado (incubaciones) y con tres tubos (repetición) por incubación/forraje (seis tubos por forraje). Se aplicaron los siguientes modelos: 1) medias de cada incubación, con dos repeticiones por forraje; 2) cada tubo fue una repetición, con seis repeticiones por forraje; 3) como el modelo 2, pero con el término incubación en el modelo que no se usó como un término de error; 4) cada tubo fue una submuestra y con incubación x forraje como criterio de error en el modelo. Con los tres primeros modelos hubo diferencias (P<0,05) en la digestibilidad de los forrajes; el modelo 1 tiene 2 grados de libertad para el error, pero en los modelos 2 y 3 hay 10 y 8 grados de libertad, respectivamente. Los modelos 2 y 3 no consideran la variabilidad de condiciones experimentales de la digestibilidad in vitro, y hay una probabilidad mayor de obtener resultados no repetibles. El análisis de la varianza con el modelo 4 (la interacción incubación x forraje como término de error experimental) no muestra diferencias (P>0,05) para forraje. Al repetir el experimento, la probabilidad de que los resultados puedan repetirse es menor. Según estos resultados, el modelo 4 sería más apropiado para analizar los estudios de digestibilidad in vitro, porque considera la variabilidad de condiciones experimentales in vitro y determina la repetibilidad de los resultados.

Four statistical designs were used to analyze data from an in vitro DM degradation of alfalfa and rye-grass hay using the first phase technique of Tilley and Terry at 48h, duplicated (two runs) and three tubes (repetitions) for each forage (six tubes for each forage). The following models were used: 1) means from each incubation, and two repetitions for each forage; 2) each tube was a repetition, with six repetitions for each forage; 3) same as model 2 and the term incubation in the model, which was not used as an error term; 4) each tube was a subsample and incubation x forage was an error term in the model. Forage digestibility was different (P<0.05) with the first three models; model 1 has only two degrees of freedom to estimate error, whereas for model 2 and 3 there are 10 and 8 degrees of freedom, respectively. However, models 2 and 3 do not take into account the variability of experimental conditions which are found on in vitro digestibility trials and, as a consequence, there is a higher probability of obtaining non-repeatable results. Analysis of variance done with model 4, which used interaction incubation x forage as an error term, did not show differences (P>0.05) for the forage. Therefore, if the experiment is repeated, there is a lower probability that the results can be repeated also. These results suggest that model 4 would be more appropriate to analyze in vitro digestibility trials because it takes into account the variability of experimental conditions which are found on in vitro digestibility and determines the repeatability of the experiment.

Foram usados quatro modelos estatísticos para analisar um experimento de degradação in vitro da MS de feno de alfafa e de gramínea utilizando a primeira fase de Tilley e Terry às 48h, por duplicado (incubações) e com três tubos (repetição) por incubação/forragem (seis tubos por forragem). Procederam à aplicação dos seguintes modelos: 1) meias de cada incubação, com duas repetições por forragem; 2) cada tubo foi uma repetição, com seis repetições por forragem; 3) como o modelo 2, mas com o termo incubação no modelo que não foi usado como um termo de erro; 4) cada tubo foi uma subamostra e com incubação x forragem como critério de erro no modelo. Com os três primeiros modelos houve diferenças (P<0,05) na digestão das forragens; o modelo 1 tem 2 graus de liberdade para o erro, mas nos modelos 2 e 3 há 10 e 8 graus de liberdade, respectivamente. Os modelos 2 e 3 não consideram a variabilidade de condições experimentais da digestão in vitro, e há uma probabilidade maior de obter resultados não repetidos. A análise da variança com o modelo 4 (a interação incubação x forragem como termo de erro experimental) não mostra diferenças (P>0,05) para forragem. Ao repetir o experimento, a probabilidade de que os resultados possam repetir-se é menor. Segundo, estes resultados, o modelo 4 seria mais apropriado para analisar os estudos de digestão in vitro, porque considera a variabilidade de condições experimentais in vitro e determina a repetição dos resultados.

Los modelos estadísticos para el análisis de los experimentos in vitro son variados y se encuentran aquellos que incluyen el uso de cada tubo como una repetición con una sola incubación (Hunt et al., 1995; Feng et al., 1996), medias de cada incubación (corrida) como repetición, uso del término incubación en el modelo pero sin incluirlo como un término de error, uso de la incubación x tratamiento como un criterio posible de error experimental (Cleale et al., 1987; Mabjeesh et al., 2000), e incluso hay algunos que aunque utilizan varios duplicados o corridas no detallan la metodología de análisis estadístico.

Algunos de los problemas mayores en los métodos in vitro que emplean fluido ruminal son el número limitado de muestras por incubación (corrida) y los errores relativamente grandes dentro de y entre incubaciones. Estos factores complican la labor de investigación, ya que por el elevado grado de error es necesario emplear una alta cantidad de repeticiones. Además, las posibles variaciones entre incubaciones hacen deseable el completar un experimento con una sola incubación, limitando el tamaño máximo de cada experimento (Alexander, 1967). Sin embargo, la repetición de la incubación es necesaria, ya que con la variabilidad de las condiciones de los procesos de incubación se corre el riesgo de obtener resultados no repetibles.

Los factores que contribuyen a causar errores en los experimentos in vitro son diversos y han sido estudiados y revisados por otros autores (Johnson, 1962; Clary et al., 1988). Como resultado de diversos estudios, lo apropiado de los sistemas de control de errores incluidos en el método puede probarse midiendo los errores dentro de incubaciones y errores entre incubaciones, los cuales también reciben el nombre de error de muestreo y error experimental, respectivamente (Alexander, 1967).

Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue analizar y comparar, estadística y biológicamente, diferentes modelos estadísticos para analizar pruebas de digestibilidad in vitro usando líquido ruminal.

Los datos utilizados para el presente estudio fueron tomados de un experimento hecho por Pinos (1999) en el cual se usó alfalfa (Medicago sativa) y pasto ballico (Lolium perenne), los cuales fueron cortados a los 28 días de rebrote y henificados a la intemperie. Se efectuó la primera fase de la técnica de Tilley y Terry (1963) para cuantificar la desaparición ruminal in vitro de MS de los henos de alfalfa y de ballico, para lo cual se colectó fluido ruminal de un novillo Holstein (460kg de PV) con cánula ruminal y alimentado ad libitum con alfalfa. Las muestras de heno de alfalfa o heno de ballico (500mg) se colocaron en tubos de polipropileno y se incubaron con una mezcla de saliva de McDougall + fluido ruminal (4:1) durante 48h a temperatura y pH similares a los del rumen (39ºC y 6,8 respectivamente). El residuo fue recuperado a través de papel filtro 541 (poro de 10mm) y secado a 55°C.

Se utilizaron tres tubos (repetición) para cada forraje y la prueba de digestibilidad se efectuó en dos incubaciones o corridas, lo que proporcionó un total de seis tubos por cada forraje (Tabla I). El análisis de varianza y la comparación de medias se efectuaron utilizando el procedimiento ANOVA y la prueba de Tukey, respectivamente (SAS, 1985). La metodología de análisis y los modelos estadísticos utilizados fueron los siguientes:

Los resultados de la Tabla II indican que con los modelos 1, 2 y 3 se obtienen diferencias significativas (P<0,005) para la variable forraje, es decir que el porcentaje de digestibilidad de MS es mayor (P<0,005) en la alfalfa que en el ballico. A pesar de que con los tres primeros modelos se encontraron diferencias significativas (P<0,05), en el modelo 1 la F calculada para la variable forraje fue menor (235,63) en comparación con el modelo 2 y el 3 (415,92 y 514,52, respectivamente). Además, en el modelo 1 únicamente hay dos grados de libertad para estimar el error, mientras que en el modelo 2 y 3 hay 10 y 8 grados de libertad, respectivamente, para estimar el error experimental. Steel y Torrie (1986) mencionan que a medida que el número de repeticiones aumenta, las estimaciones de las medias de las poblaciones, esto es, las medias observadas de los tratamientos, se hacen más precisas. Además, estos autores indican que un mayor número de repeticiones por lo general mejora la precisión y aumenta el poder de las pruebas estadísticas, características que generalmente se buscan en las pruebas in vitro. Lo anterior sugiere que a pesar de que con el modelo 1 se encontraron diferencias significativas entre forrajes, se pierde sensibilidad en la prueba, como resultado del reducido número de grados de libertad para estimar el error, es decir, el empleo de la media de cada incubación como repetición disminuye la sensibilidad de la prueba al perder grados de libertad para estimar el error experimental.

De acuerdo a lo expuesto, los modelos 2 y 3 tienen mayores ventajas que el modelo 1; sin embargo, no es raro encontrar que en muchos experimentos in vitro, el ensayo se repite en un período de tiempo. La razón es obvia, ya que las condiciones varían con el tiempo y es importante conocer el efecto de éstas sobre las diferencias entre los tratamientos. De la misma manera, se usan diversos medios, sustratos y bacterias, entre otros, para evaluar los tratamientos en las diferentes condiciones experimentales. Tanto las repeticiones en el tiempo como las diferencias de las condiciones experimentales pueden considerarse como repetición (Steel y Torrie, 1986).

En estudios de laboratorio, un objetivo importante es aumentar el alcance de la inferencia, es decir, que el experimento completo se repita varias veces, de preferencia por distintos investigadores o en condiciones experimentales diferentes, con el propósito de estimar si los resultados de los tratamientos se repiten en diversas condiciones experimentales. De acuerdo a lo anterior, los modelos 2 y 3 no contemplan esta variabilidad de condiciones experimentales, lo que hace necesaria la inclusión de la repetición de incubación, ya que de otra forma se corre el riesgo de obtener resultados que no se repiten, debido a la gran variación de las condiciones de los procesos de incubación in vitro. A pesar de ello, en los modelos 3 y 4 no se encontraron diferencias (P>0,05) entre las incubaciones (corridas) que se realizaron en el presente experimento.

Bajo las condiciones del modelo 4, al probar una hipótesis sobre las medias de tratamientos, el divisor apropiado para F es el cuadrado medio del error de la interacción incubación * forraje que incluyó la variación proveniente de todas las fuentes y contribuyó a la variabilidad de las medias de los tratamientos con la finalidad de obtener resultados que se puedan repetir, incluso en condiciones experimentales diferentes. Así, al utilizar el modelo 4 con la interacción incubación * forraje como el término de error experimental, el análisis de la varianza (Tabla II) no demuestra diferencias significativas (P>0,05) para la variable forraje; en este caso el porcentaje de digestibilidad de la MS de la alfalfa es estadísticamente igual que la del pasto ballico. Estos resultados sugieren que en las condiciones experimentales descritas, la digestibilidad ruminal in vitro de la MS de alfalfa y ballico no son diferentes. Por tanto, la probabilidad de que al repetir el experimento los resultados puedan repetirse, es menor. Además, la diferencia honesta significativa (DHS) en los modelos 1, 2 y 3 fue de 8,24; 3,21 y 2,99 respectivamente, en tanto que en el modelo 4 fue de 33,52, lo cual sugiere principalmente que la prueba se vuelve mucho más estricta.

La variabilidad de las pruebas de digestibilidad in vitro atribuida a medios, sustratos y bacterias, hace necesario evaluar el efecto de los tratamientos en las diferentes condiciones experimentales. La inclusión del termino incubación x forraje como un criterio de error experimental, como se hizo con el modelo 4, es una herramienta estadística útil para estimar mejor la probabilidad de que se repitan los resultados obtenidos en experimentos de digestibilidad in vitro para forrajes. Lo anterior incrementa los grados de libertad, lo cual ayuda a mejorar la sensibilidad de detección de diferencias en las pruebas de digestibilidad in vitro.

REFERENCIAS