NUTRICIÓN MINERAL Y ESTRÉS OXIDATIVO POR METALES EN ESPINACA Y LECHUGA, EN COMPARACIÓN CON DOS MALEZAS ASOCIADAS, EN CULTIVOS SEMI-URBANOS

Elizabeth Olivares, Eder Peña y Guillermina Aguiar

Elizabeth Olivares. Licenciada en Biología, Universidad Central de Venezuela (UCV). M.Sc. y Ph.Sc. en Biología, mención Ecología, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC). Investigador, Laboratorio de Ecofisiología Vegetal, Centro de Ecología, IVIC. Dirección: Centro de Ecología, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas. Apartado 21827, Caracas 1020A. Venezuela. e-mail: eolivare@oikos.ivic.ve

Eder Peña. Licenciado en Biología, UCV. Profesional Asociado a la Investigación, Laboratorio de Ecofisiología Vegetal, Centro de Ecología, IVIC.

Guillermina Aguiar. Licenciada en Educación, mención Química, Instituto Pedagógico de Caracas. M.Sc. en Química, IVIC. Profesional Asociado a la Investigación, Laboratorio de Ecofisiología Vegetal, Centro de Ecología, IVIC.

Resumen

Se evaluó la concentración de metales y la de compuestos orgánicos foliares que pudiesen verse afectadas por el estrés causado por los primeros. Concentraciones fitotóxicas de metales pueden producir senescencia o inducir un proceso de desintoxicación. Se estudió la composición del suelo y, en las raíces y hojas se determinaron los nutrientes y las actividades de la fosfatasa ácida (AFA) y la nitrato reductasa (ANR). Se compararon dos plantas de cultivo, lechuga (L) y espinaca (S) con sus malezas asociadas Ageratum conyzoides (A) y A. houstonianum (H), en dos cultivos localizados en sitios cercanos a Caracas, San Antonio (Sitio 1) y San Pedro (Sitio 2). Los suelos en el Sitio 2 resultaron más ricos en K, Ca, P, Mg, Mn y Zn, más pobres en Ni, menos ácidos y más arenosos que los del Sitio 1. Las concentraciones de Al, Fe y Ca fueron altas en A y H, en comparación a plantas de cultivo, y el Cr resultó alto en H. Las hojas de A presentaron el mayor contenido de fenoles totales. Los valores más altos de clorofila, carotenoides y peroxidación de lípidos se encontraron en H. Las mayores concentraciones de K, Mg, Mn, Cu y Zn las presentó S. Las concentraciones de Ni, Co, Pb y Cd resultaron bajas o no detectables en las cuatro especies de los dos sitios estudiados. En L se evaluaron también muestras procedentes de un cultivo hidropónico comercial, donde se observó una mejor nutrición que en las muestras cultivadas en suelo. Se concluye que las malezas presentaron mayores concentraciones de metales y de compuestos asociados al estrés oxidativo que las dos especies de cultivo.

Summary

The concentration of metals and foliar organic compounds affected by the stress produced by them were evaluated. Phytotoxic concentrations of metals may produce senescence or induce a detoxification process. Soil composition was studied, and nutrients and acid phosphatase (PAA) and nitrate reductase (NRA) activities were evaluated in roots and leaves. Crop species such as lettuce (L), and spinach (S) were compared with their associated weeds Ageratum conyzoides (A) and A. houstonianum (H) in two cultivation sites located in towns near Caracas, San Antonio (Site 1) and San Pedro (Site 2). The soils in Site 2 were richer in K, Ca, P, Mg, Mn and Zn, showed lower concentrations of Ni, higher pH and percent of sand, than those in Site 1. The concentration of Al, Fe and Ca was very high in the weeds compared to the crop species, and Cr was high in H. The leaves of A showed the highest concentration of total phenols. The highest values of chlorophyll, carotenoids and lipid peroxidation were found in H. The highest concentration of K, Mg, Mn, Cu and Zn were found in S. The concentration of Ni, Co, Pb and Cd were low or undetectable in the four species from the two studied sites. Lettuce from a commercial hydroponic crop showed better nutrition than those from soils. It is concluded that the weeds showed higher concentrations of metals and compounds associated to the oxidative stress than the two crop species.

Resumo

Avaliou-se a concentração de metais e a de compostos orgânicos foliares que pudessem ver-se afetadas pelo estresse causado pelos primeiros. Concentrações fitotóxicas de metais podem produzir senescência ou induzir um processo de desintoxicação. Estudou-se a composição do solo e, nas raízes e folhas se determinaram os nutrientes e as atividades da fosfatasa ácida (AFA) e a nitrato redutasa (ANR). Compararam-se duas plantas de cultivo, Alface (L) e espinafre (S) com seus arbustos associados Ageratum conyzoides (A) e A. houstonianum (H), em dois cultivos localizados em áreas próximas a Caracas, San Antonio (Área 1) e San Pedro (Área 2). Os solos na Área 2 resultaram mais ricos em K, Ca, P, Mg, Mn y Zn, mais pobres em Ni, menos ácidos e mais arenosos que os da Área 1. As concentrações de Al, Fe y Ca foram altas em A y H, em comparação a plantas de cultivo, e o Cr resultou alto em H. As folhas de A apresentaram o maior conteúdo de fenóis totais. Os valores mais altos de clorofila, carotenóides e peroxidação de lipídios se encontraram em H. A maior concentração de K, Mg, Mn, Cu e Zn as apresentou S. As concentrações de Ni, Co, Pb e Cd resultaram baixas o não detectáveis nas quatro espécies das duas áreas estudadas. Em L se avaliaram também amostras procedentes de um cultivo hidropônico comercial, onde se observou uma melhor nutrição que nas amostras cultivadas em solo. Conclui-se que os arbustos apresentaram maiores concentrações de metais e de compostos associados ao estresse oxidativo que as duas espécies de cultivo.

PALABRAS CLAVE / Ageratum / Aluminio / Asteraceae / Espinaca / Lechuga / Malezas / Metales /

Recibido: 30/04/2002. Modificado: 18/07/2002. Aceptado: 31/07/2002

 

La acidez frecuente de los suelos tropicales determina una alta disponibilidad de algunos metales, tales como Al, Fe y Mn, en el suelo (Foy et al, 1978). Los metales son una fuente potencial de estrés oxidativo porque propician la producción de especies reactivas de oxígeno y radicales hidroxilos. El oxígeno molecular se fotorreduce en los cloroplastos (reacción de Mehler) produciéndose el radical superóxido (O2-). La dismutación de este anión produce peróxido de hidrógeno (H2O2) y la reacción del superóxido y el peróxido pueden crear radicales hidroxilo (OH-). Estos radicales causan inactivación de enzimas, blanqueo de pigmentos, peroxidación de lípidos y degradación de proteínas. Un mecanismo de protección del daño potencial que producen esos radicales libres son sistemas que atrapan estos compuestos, como es el caso de los polifenoles y los flavonoides (derivados de la vía del chiquimato). Se ha propuesto que los fenoles, principalmente los taninos hidrolizables y polifenoles derivados del ácido gálico y tánico participan en la desintoxicación de metales en algunas plantas acuáticas (Lavid et al., 2001).

En respuesta a la alta concentración de metales se han observado síntomas de estrés tales como disminución del contenido de clorofila (Ewais, 1997; Xiong, 1997; Kastori et al., 1998; Fargašová, 2001), carotenoides (Fargašová, 2001; Zeid, 2001), proteinas (Kevresan et al., 2001) y de la actividad de la nitrato reductasa (Singh et al., 1997/98; Kevresan et al., 2001), e incremento en la peroxidación de lípidos (Cakmak y Horst, 1991; Gallego et al., 1999; Pereira et al., 1999; Baryla et al., 2000; Hartley-Whitaker et al., 2001; Sandalio et al., 2001; Shah et al., 2001) y la actividad de las fosfatasas ácidas (Gabbrielli et al., 1989; van Assche and Clijsters, 1990).

Se evaluó la concentración de nutrientes en cultivos y malezas de dos localidades de los Altos Mirandinos, cercanas a Caracas, que eran diferentes en fertilización, siendo el cultivo localizado en San Pedro más rico en insumos que el de San Antonio, lo que se verificó con análisis de suelos.

La contaminación por metales traza, entre ellos Co, Cr, Pb y Cd, está incrementando en el ambiente debido a la industrialización y otras actividades del hombre, tales como producción de fertilizantes, pesticidas y otras (Prasad, 1997). Por lo tanto, se evaluaron estos elementos.

Los suelos tropicales pueden contener concentraciones muy altas de metales que pueden producir estrés oxidativo en las plantas. Por otra parte, las prácticas de cultivo tradicionales (fertilizantes químicos, herbicidas, etc.) pueden incorporar metales al suelo. Resulta por lo tanto interesante conocer la concentración de metales de las plantas que se utilizan en alimentación, comparar si las malezas tienen concentraciones de metales semejantes a las especies de cultivo y si hay diferencias en la concentración de los metabolitos implicados en la desintoxicación en ambos grupos, los cuales podrían utilizarse como indicadores bioquímicos de concentraciones fitotóxicas de metales. Este conocimiento puede tener aplicaciones en las prácticas de cultivo. Así, si se conoce que una maleza puede fitoextraer un metal no requerido por la planta, como Al, Cd, Pb, etc., pudiese la maleza ser provechosa para el cultivo al reducir la disponibilidad del elemento potencialmente nocivo, por lo que se debería dejar que acompañase al cultivo.

Conocer la distribución del metal en hojas y raíces es importante porque permite identificar a las hiperacumuladoras de metales, caracterizadas por una mayor concentración del metal en la biomasa aérea que en la subterránea, siendo la concentración en las hojas 1 a 3 órdenes de magnitud mayor a lo normal. La tolerancia a metales se logra por compartamentalización y/o secuestro del metal con compuestos orgánicos (péptidos, ácidos orgánicos y aminoácidos). Sin embargo las hiperacumuladoras representan solo <0,2% de las angiospermas (McGrath et al., 2001).

Las plantas hiperacumuladoras se utilizan en fitoremediación, una técnica económica y amigable con el ambiente, en la que se limpia el suelo de contaminantes a través de especies vegetales (Salt et al., 1998). También se utilizan plantas no hiperacumuladoras en fitoremediación, en cuyo caso se utilizan especies con biomasa grande, capaces de crecer rápidamente en cultivos densos y tolerantes a metales. Es importante conocer la capacidad fitoextractora de metales de las malezas, las cuales generalmente son de crecimiento rápido.

Los objetivos de este trabajo fueron:

i) Conocer las concentraciones de los metales (Fe, Mn, Cu, Zn, Ni, Al, Co, Cr, Pb y Cd) en plantas de dos zonas agrícolas de los alrededores de la ciudad de Caracas.

ii) En el caso de aquellos metales que estuviesen en concentraciones altas, en comparación con la información de la literatura, estudiar su efecto en el metabolismo de las plantas, haciendo énfasis en algunos metabolitos como los fenoles totales que protegen a las plantas del estrés oxidativo y algunos efectos del estrés oxidativo (lipoxidación y disminución del contenido de la clorofila), así como el efecto en la incorporación de nutrientes: N (total, ANR y proteínas), P (total y AFA) y otros macronutrientes (Ca, K y Mg).

iii) Localizar el órgano donde ocurre la mayor incorporación de los metales pesados (hojas o raíces).

iv) Comparar los resultados en las especies de cultivo y las malezas.

Materiales y Métodos

Material vegetal

Se estudiaron las especies Spinacia oleracea L. (Chenopodiaceae) y Lactuca sativa L. (Asteraceae), cultivadas comúnmente en zonas urbanas y semiurbanas, y Ageratum conyzoides L. y Ageratum houstonianum Miller (Asteraceae), malezas abundantes en los cultivos.

Sitios de muestreo

Las muestras se obtuvieron en El Amarillo, zona rural cercana a San Antonio de los Altos (Sitio 1) a 10º 21’ N, 66º 56’ W, y en Villa Manzanares Arriba, en la vía a San Pedro de los Altos (Sitio 2) a 10º 22’ N, 67º 05´ W. Estas dos localidades proveen a Caracas de hortalizas. Los cultivos hidropónicos comerciales de lechuga sirvieron como un control, ya que en ellos se les proporciona a las plantas los micronutrientes en concentraciones óptimas para su crecimiento y no se les suministra metales tales como Al, Cd o Pb.

 

Figura 1. Contenido de elementos minerales, pH en agua o KCl y textura en suelos de San Antonio (1) y San Pedro (2) a profundidades de 0-10cm (a) y 10-20cm (b).

Colección de muestras de plantas y suelos en el campo

Se utilizaron plantas y hojas adultas. En el caso de lechuga y espinaca se hizo el muestreo en plantas que ya habían culminado su crecimiento, pero que aún no tenían flores y frutos. Los cultivos eran regados diariamente por aspersión. En el caso de las malezas, éstas tenían flores.

Los suelos se colectaron por quintuplicado en los dos sitios de muestreo con un horadador de 21,5cm de largo y 8cm de diámetro, separando las muestras de dos profundidades (0-10 y 10-20cm) en cada caso.

Secado de las muestras

Las plantas fueron secadas en una estufa Memmert con ventilación forzada a 60ºC hasta peso constante. Las hojas y raíces fueron molidas. Los suelos se secaron al aire en un cuarto caliente (37ºC) hasta peso constante.

Número de réplicas

En cada uno de los dos sitios de muestreo y en el cultivo hidropónico se colectaron 15 plantas de las especies de cultivo y aproximadamente 50 plantas de las malezas, con la finalidad de tener suficiente peso seco para los análisis químicos. Para éstos se hicieron 5 muestras compuestas de hojas y raíces por separado, de las que se hicieron a su vez duplicados en el caso de nutrientes y metales. Se analizaron patrones certificados comerciales de tomate y durazno (National Bureau of Standards, U.S.A.), que indicaron la confiabilidad de los análisis.

Métodos

Análisis de suelos

Las muestras de suelo se tamizaron a <2mm. Los análisis de textura se realizaron con el método del hidrómetro (Anderson e Ingram, 1993). Se hicieron determinaciones de pH en agua destilada y en KCl 1N. Los cationes, metales y fósforo totales fueron determinados con la misma metodología que en plantas.

Metales y nutrientes en suelos y plantas

El contenido de los metales se determinó mediante espectrofotometría de absorción atómica de llama con un equipo Varian Spectra AA 55 B (Victoria, Australia) en digeridos hechos en una mezcla de ácido nítrico y perclórico (Miller, 1998), utilizando 500mg de material seco. El P total se determinó según Murphy y Riley (1962) en los mismos digeridos, diluidos apropiadamente, y el N se determinó por el método de Kjeldahl (Jackson, 1970) en digeridos hechos con ácido sulfúrico en muestras de 100mg de material seco.

Actividades enzimáticas en hojas y raíces

Se determinó la actividad de la nitrato reductasa in vivo según Lindblad y Guerrero (1993). La actividad de las fosfatasas ácidas se determinó en muestras de 1g de material vegetal macerados a 4°C en buffer acetato 0,1M y pH 5,8, por el método de Tabatabai y Bremner (1969), consistente en la determinación colorimétrica del p-nitrofenol liberado al incubar el material vegetal con una solución de p-nitrofenilfosfato.

Pigmentos fotosintéticos, proteínas y aminoácidos en hojas

La clorofila, xantofilas y carotenos se determinaron en extractos alcohólicos utilizando las fórmulas de Lichtenthaler y Wellburn (1983). Las proteínas se determinaron colorimétricamente en macerados en agua (Bradford, 1976).

Figura 2. Contenido de metales (mg·kg-1) en suelos de San Antonio (1) y San Pedro (2) a profundidades de 0-10cm (a) y 10-20cm (b).

Metabolitos implicados en el estrés oxidativo en hojas

La peroxidación de lípidos se determinó por producción de malondialdehido con ácido tiobarbitúrico (van Hasselt et al., 1996). Los fenoles totales se determinaron en extractos alcohólicos por un método colorimétrico que utiliza solución Folin-Ciocalteu (Amorim et al., 1977). Los flavonoides totales y fenoles relacionados fueron estimados a 300nm en extractos con metanol acidificado (Day y Demchik, 1996).

Suculencia

Se calculó la relación peso fresco / peso seco de las hojas y raíces. Muestras de cuatro discos de hojas frescas de 1,41cm2 de diámetro cada uno fueron secados hasta peso constante. Se calculó el peso foliar específico (PFE) con el peso seco de los discos por unidad de área foliar.

Análisis estadísticos

Se hicieron pruebas "t" para comparar los dos sitios de muestreo con el programa Sigma Plot 2001 (7.0), el cual se utilizó para realizar gráficos de caja donde se indica la media dentro de la caja y los percentiles 25 y 75 en sus extremos, mientras los percentiles 10 y 90 se señalan con barras. Se muestran también los puntos que se salen de la media.

Se utilizó el programa Statistica for Windows, versión 4.5 (Statsoft, Inc., 1993) para determinar si existían diferencias significativas en las variables nutricionales y bioquímicas de lechuga de San Antonio, San Pedro e hidropónicas. Se realizó análisis de varianza (ANOVA) a las variables que cumplían con los supuestos del modelo: homogeneidad de varianza, distribución normal e independencia entre los grupos. Luego se realizó la prueba post-hoc de Tukey para determinar cuáles localidades eran diferentes entre sí. Aquellos datos que no cumplieron con los supuestos del modelo fueron analizados mediante la prueba no paramétrica Kruskal-Wallis.

Análisis de Componentes Principales: Los valores de concentración de las diferentes variables fueron promediados por especie y por localidad. Debido a las diferencias entre los órdenes de magnitud de los valores se intentó estandarizarlos transformándolos en raíz cuadrada. Igualmente se procedió con las concentraciones de los elementos mayoritarios (K, Ca, Mg, N, P, Fe y Al), porcentajes de arena y arcilla y pH de los suelos. Las variables bioquímicas fueron transformadas mediante logaritmos con base 10 debido a las diferentes unidades y órdenes de magnitud. Se utilizó el programa XLStat 4.0 para el análisis de la matriz de correlaciones entre las variables, que puede ser de utilidad para identificar las variables que diferencian las malezas de las especies de cultivo y los suelos de los dos sitios.

Resultados

Comparación de los suelos en los dos sitios de estudio

En San Antonio (Sitio 1) se obtuvieron valores más altos (Figuras 1 y 2) en la capa superficial (0-10cm), en comparación con la capa profunda (10-20cm) para Al y Zn (p<0,01), K (p<0,05), y Ni (p< 0,001), mientras que fueron más bajos para el Co (p< 0,01). En San Pedro (Sitio 2) no se observaron diferencias en nutrientes, metales y pH al comparar las dos profundidades. Si se comparan los suelos de los dos sitios, aquellos de San Pedro resultaron más ricos en K, Ca y P (Figura 1), menos ácidos y más arenosos que los de San Antonio. Su contenido de Mg, Mn y Zn resultó también mayor (Figura 2), mientras que su contenido de Ni fue menor.

 

Figura 3. Contenido de macronutrientes (mg·g-1peso seco) en hojas y raíces de lechuga (L), espinaca (S), Ageratum conyzoides (A) y A. houstonianum (H) en San Antonio (1) y San Pedro (2). La línea de rayas representa el promedio en vástagos suficiente para un crecimiento adecuado (Marschner, 1995). La línea de puntos representa el promedio máximo en vástagos (Larcher, 1995). Significado de las diferencias entre sitios para cada especie: ns= no significativo, * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.

Comparación en las especies de cultivo y sus malezas en los dos sitios de estudio

Macronutrientes. Con fines de comparación con otras plantas, en la Figura 3 se muestra el promedio del nutriente en vástagos, adecuado para que la planta crezca normalmente (Marschner, 1995) y el promedio máximo en vástagos (Larcher, 1995). La concentración de N en hojas se encontró dentro de los promedios normales reportados en plantas (Figura 3). El P en A. conyzoides de San Pedro (Sitio 2) está en el límite superior del promedio, mientras que el K resultó bajo en A. conyzoides y A. houstonianum en el Sitio 1. Las mayores concentraciones de K y Mg las presentó la espinaca (S) en San Pedro. En las malezas (A y H) el Ca resultó por encima del límite superior normal, con valores mayores que en las plantas de cultivo.

En concordancia con lo encontrado para K, Ca y Mg en suelos, se observó que en el Sitio 2 las hojas y raíces de las dos especies de cultivo, así como las dos especies de malezas acompañantes, presentaron generalmente mayor contenido de estos elementos minerales y de N que en el Sitio 1. Sin embargo se presentan varios casos donde las diferencias no son significativas o donde son las plantas de San Antonio las que tienen el mayor contenido del elemento mineral. Para el P ocurre este patrón sólo en A. conyzoides, es decir, las muestras de San Pedro presentaron mayores valores que las de San Antonio. Por su parte, las raíces presentaron menores concentraciones de N, Ca y Mg que las hojas.

Micronutrientes. En la Figura 4 se indican, con fines de comparación, los valores típicos para plantas contaminadas reportados por Ross (1994). La concentración de Fe en hojas resultó mayor o igual al límite superior promedio en A. conyzoides de San Pedro (A2) y A. houstonianum de San Antonio y San Pedro (H1 y H2). El Mn fue bajo en lechuga (L1 y L2) y en A. conyzoides de San Pedro (A2). El Cu resultó alto en espinaca (S1) y A. houstonianum de San Antonio (H1), y en A. conyzoides de San Pedro (A2).

Los mayores valores de Mn, Cu y Zn fueron encontrados en espinaca de San Antonio (S1). Las raíces presentaron contenidos mayores de Fe en San Antonio que en San Pedro en las cuatro especies. Esto también se encontró en raíces para Mn y Cu, exceptuando en lechuga. En las hojas, en cambio, las concentraciones de Fe y Zn fueron mayores en San Pedro, con excepción de espinaca.

Figura 4. Contenido de micronutrientes (mg·g-1peso seco) en hojas y raíces de lechuga (L), espinaca (S), Ageratum conyzoides (A) y A. houstonianum (H) en San Antonio (1) y San Pedro (2). La línea de rayas representa el promedio en vástagos suficiente para un crecimiento adecuado (Marschner, 1995). La línea continua representa valores típicos de plantas contaminadas (Ross, 1994). Para Fe no se tiene esta información y se muestra con una línea de puntos el promedio máximo en vástagos (Larcher, 1995). Significado de las diferencias entre sitios para cada especie: ns= no significativo, * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.

Las raíces presentaron mayores concentraciones de Fe, Cu, Zn y Ni que las hojas. Las concentraciones de Ni fueron mayores en San Antonio que en San Pedro en hojas y raíces, a excepción de las hojas de A. houstonianum, lo que se correspondió con lo encontrado en suelos.

Otros metales. Los mayores valores de Al y Cr foliares se encontraron en A. houstonianum (Figura 5). El Al estuvo por encima del límite superior en A. conyzoides de San Pedro (A2) y A. houstonianum de San Antonio y San Pedro (H1 y H2). Los niveles de Al en las hojas y raíces fueron muy altos, especialmente en las malezas. Los contenidos de Ni, Co, Pb y Cd resultaron bajos.

Los mayores valores de Cr en raíces ocurrieron en A1. Las hojas de espinaca no presentaron concentraciones apreciables de Co y Pb, y lo mismo ocurrió en hojas de lechuga para Cr y Cd. Las raíces de las cuatro especies no presentaron Cd y lo mismo ocurrió con el Pb, a excepción de A. houstonianum. Sólo las hojas de espinaca en San Pedro (S2) presentaron Cd, pero en concentraciones muy bajas. Las raíces presentaron concentraciones de Al y Cr más elevados que las hojas.

Las raíces de las plantas de San Antonio presentaron concentraciones más elevadas de Al que las de San Pedro. Sin embargo ésto no se observó en las hojas, con la excepción de espinaca.

Compuestos orgánicos. Debido a las diferencias encontradas en las concentraciones de metales se esperaría un efecto en los metabolitos orgánicos, especialmente en aquellas moléculas asociadas al estrés oxidativo. A. houstonianum presentó los mayores valores de clorofila, carotenoides y (Figura 6).

Suculencia y actividades enzimáticas

No se encontraron diferencias entre los sitios de muestreo en la relación peso fresco / peso seco de las hojas y raíces de lechuga y las malezas, con la excepción de espinaca de San Pedro (S2) que resultó más suculenta que la de San Antonio (Figura 7).

Las actividades de nitrato reductasa y fosfatasas ácidas fueron mayores en hojas que en raíces, lo que indica que los valores de nitrato y fosfato en el suelo no eran limitantes. Los mayores valores de actividad de fosfatasas ácidas se encontraron en hojas de lechuga de San Pedro (L2).

Análisis de componentes principales

Se separaron (Figura 8a) los suelos de San Antonio y de San Pedro en el eje o Componente Principal CP1, por un mayor porcentaje de arena así como mayor pH y concentración de P, Ca, Mg y K. Los suelos de San Antonio presentaron una alta correlación con Al. Se observó una correlación altamente negativa entre Fe y Al. Las diferencias en los contenidos de N no resultaron significativas.

Figura 5. Contenido de metales (mg·kg-1peso seco) en hojas y raíces de lechuga (L), espinaca (S), Ageratum conyzoides (A) y A. houstonianum (H) en San Antonio (1) o San Pedro (2). La línea continua representa valores típicos de plantas contaminadas (Ross, 1994). Para Al no se tiene esta información y se muestra con una línea de puntos el promedio máximo en vástagos (Larcher, 1995). Significado de las diferencias entre sitios para cada especie: ns= no significativo, * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.

Para las hojas el CP1 separó (Figura 8b) las malezas de lechuga y espinaca, debido a la mayor presencia de metales como Ca, Al y Fe, así como una mayor cantidad de P, mientras que las plantas de cultivo presentaron mayor cantidad de K, Zn y Mn. El CP2 mostró que los contenidos de N en A. houstonianum y espinaca de ambas localidades eran mayores que en las otras especies.

Para las raíces (Figura 8c) los ejes 1 y 2 mostraron la heterogeneidad de los valores nutricionales de las malezas. Analizando el CP1 se apreció que A. houstonianum era significativamente diferente a espinaca en ambas localidades, mientras que las raíces de lechuga y A. conyzoides eran similares. Dicha diferencia pudiera estar marcada por la presencia de K y Mg en espinaca y la de Al, Fe Ni y Cr, entre otros metales, en A. houstonianum.

Para las variables bioquímicas el CP 1 distingue las diferencias entre las plantas de cultivo y las malezas, no así entre localidades (Figura 8d). En espinaca se encontraron valores altos de proteínas y peso foliar específico. En A. houstonianum y lechuga de ambas localidades se observaron valores altos de la ANR y la relación peso fresco / peso seco en raíces. El CP2 establece diferencias marcadas entre A. conyzoides y lechuga debido a la alta correlación de A. conyzoides con fenoles totales y la relación clorofila a/b, mientras que los valores de ANR y AFA en las raíces, y la relación peso fresco / peso seco de hojas son altos en lechuga. Variables tales como peroxidación de lípidos, clorofila, fenoles totales, flavonoides y carotenoides se correlacionan positivamente con las malezas, mientras que la relación peso fresco / peso seco de las hojas y el peso foliar específico lo hacen con las especies de cultivo.

Lechuga en suelos de San Antonio y San Pedro, comparado con cultivos con fertilización óptima (hidroponia)

Las lechugas hidropónicas comerciales presentaron una mejor nutrición (N, P, K, Ca y Mg) que las de suelos de ambos sitios. También presentaron mayor concentración de Mn. Sus raíces tuvieron menores concentraciones de Fe, Cu y Ni, pero mayor de Zn.

Los menores valores de Al (hojas y raíces) se encontraron en las hidropónicas, las cuales presentaron mayor concentración de clorofila, carotenoides y fenoles totales, y los valores más bajos de peroxidación de lípidos. Sus raíces fueron más suculentas y en ellas la AFA fue mayor.

Se encontraron diferencias significativas para los macronutrientes, micronutrientes y otros metales en hojas y raíces, a excepción del Fe en hojas (Tabla I). Las lechugas no presentaron Cd en hojas o raíces, ni Pb en raíces. También se observó que las plantas de San Antonio diferían de las hidropónicas en contenido clorofila, relación clorofila a/b y carotenos, y las plantas de San Pedro en clorofila y peroxidación de lípidos. Las plantas de las tres localidades eran diferentes en flavonoides y fenoles totales.

Figura 6. Contenido de clorofila, relación clorofila a/b, contenido de carotenoides, compuestos que absorben a 300nm, fenoles totales, complejo malondialdehido-ácido tiobarbitúrico, proteínas solubles en agua y peso foliar específico de hojas de lechuga (L), espinaca (S), Ageratum conyzoides (A) y A. houstonianum (H) en San Antonio (1) y San Pedro (2). Significado de las diferencias entre sitios para cada especie: ns= no significativo, * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.

Discusión

Las concentraciones de Cr y Pb en los suelos no fueron tóxicas y las de Cu fueron muy altas. Ross (1994) señala concentraciones tóxicas en suelo de Cr 75-100 mg·kg-1, Pb 100-400 mg·kg-1 y Cu 60-125 mg·kg-1. Pueden alcanzarse niveles tóxicos de Cu por aplicación de fungicidas que lo contienen y por la aplicación de desechos avícolas y de porcinos. Sin embargo, en suelos ferrolíticos y ferroginosos es frecuente la deficiencia de Cu. Concentraciones tóxicas de hierro disminuyen la toxicidad por cobre en espinaca (Ouzounidou et al., 1998). En espinaca encontramos concentraciones muy altas de Cu, pero relativamente bajas de Fe.

Se ha reportado tolerancia al Pb en la maleza cosmopolita Sonchus oleraceus (Asteraceae), la cual ha sido propuesta como fitorremediadora (Xiong, 1997). En el presente trabajo las malezas presentaron mayor concentración de metales que los cultivos, por lo cual pudiesen ser competitivas en suelos con concentraciones de metales altas y pudiesen estar actuando en la fitoremediación del suelo en relación a los metales. En este caso particular la práctica de desmalezar a mano, antes de la siembra siguiente, sería más conveniente que la del uso de herbicidas, porque se estaría eliminando la entrada del metal y fenoles al suelo a través de la biomasa muerta. De este trabajo se desprende además que es importante, en este caso, extraer la planta completa, ya que son las raíces las que acumularon mayores contenidos de metales.

 

En A. houstonianum se encontraron los mayores valores de clorofila y carotenoides, asociado a los mayores valores de N, y también presentó los valores más altos de peroxidación de lípidos, lo que se asoció a sus niveles muy altos de Al. Los niveles de Ca también fueron los más altos. Cakmak y Horst (1991) y Pereira et al. (1999) reportaron un incremento de la peroxidación de lípidos en respuesta al Al, lo que también se observó que en respuesta al Cu (Baryla et al., 2000; Hartley-Whitaker et al., 2001) y al Cd (Gallego et al., 1999, Sandalio et al., 2001; Shah et al., 2001).

Existen reportes de disminución de clorofila y carotenoides por efecto de Cr en Phaseolus vulgaris (Zeid, 2001), así como de clorofila y ocasionalmente de la relación clorofila a/b en Empetrum nigrum por Cu y Ni (Monni et al., 2001), lo que no fue observado en A. houstonianum, a pesar de su mayor contenido de Al, Fe y Cr.

Se esperaba encontrar concentraciones de Pb, Cd, Ni y Zn mayores en San Pedro que en San Antonio, por estar las plantas más expuestas a los contaminantes producidos por el tráfico automotor, por ser una zona con mayor tránsito. Sin embargo, las concentraciones de estos metales en las plantas analizadas resultaron por debajo de lo normal en los dos sitios de estudio.

Las hojas presentaron mayor concentración de N, Ca, Mg y Mn que las raíces, en las que la concentración de Fe, Cu, Zn, Al y Cr fue mayor. Chatterjee y Chatterjee (2000) reportaron mayor contenido de Co, Cr y Cu en raíces que en hojas de Brassica oleracea cuando estos elementos estaban en exceso. Brun et al. (2001) llaman la atención de la poca disponibilidad en la literatura de información sobre concentración de metales en las raíces, ya que en el caso del Cu proveniente de funguicidas la acumulación en raíces es mucho mayor que en hojas. Para el Pb, Wierzbicka (1999) también encontró un patrón de distribución similar en varias especies, es decir el Pb contenido en la raíz constituía del 54,1 a 99,7% del total presente en la planta, cuando se le suministraba una solución rica en Pb por 7 días. Las plantas no hiperacumuladoras no trasladan muy eficientemente los metales pesados desde las raíces a los vástagos (McGrath et al., 2001). La concentración de algunos metales como el Fe, Zn y Al, fue muy alta en las hojas de las malezas, pero mucho menor a la concentración encontrada en las raíces, por lo que sigue el patrón de las plantas no hiperacumuladoras.

Se esperaban grandes diferencias entre los contenidos de metales del cultivo de lechuga en suelo y el hidropónico, debido a las características de los suelos de los alrededores de Caracas (suelos ácidos) y a las prácticas de cultivo que se han aplicado por muchos años, tales como uso de fertilizantes químicos y de desechos avícolas (ricos en Cu), uso de herbicidas y plaguicidas, quema, etc. Se encontró, en efecto, una mejor nutrición en las lechugas hidropónicas que en las cultivadas en suelos, lo que se reflejó en mayor contenido de clorofila y carotenoides. Las lechugas hidropónicas también tenían mayor concentración de fenoles totales en hojas y actividad de fosfatasas ácidas en raíces.

Debido a las grandes diferencias de la relación peso fresco / peso seco en hojas y raíces entre las especies estudiadas, se prefirió expresar todos los valores por unidad de peso seco. Sin embargo en la literatura es común encontrar las actividades enzimáticas expresadas por peso fresco. Así, la ANR de espinaca crecida en invernadero puede tener 3,9 ±1,8µmol NO2-·g-1·PF·,-1 después de 1h de oscuridad y puede alcanzar 15,6 ±0,8µmol NO2-·g-1·PF·h-1 después de 1h de luz y 1h de oscuridad (Glaab y Kaiser, 1999). El uso de fungicidas como Kresoxim-methyl produce un incremento en estos valores dependiendo del pH, alcanzándose la actividad máxima a un pH externo de 4,8, por lo que parece que la acidificación del citosol juega un papel importante en la modulación de la nitrato reductasa. La ANR máxima puede ser muy alta en relación a la actual (20,3 ±4,3µmol NO2-·g-1·PF·h-1 con 1h de luz, y 24,0 ±1,0 con 1h de luz y 1h de oscuridad). Kaiser et al. (2000) reportan una ANR actual de 12,3 ±3,5µmol NO2-·g-1·PF·h-1 y una ANR máxima de 21,5 ±5,0µmol NO2-·g-1·PF·h-1.

Figura 7. Relación peso fresco / peso seco, actividad de nitrato reductasa y fosfatasas ácidas en hojas y raíces de lechuga (L), espinaca (S), Ageratum conyzoides (A) y A. houstonianum (H) en San Antonio (1) y San Pedro (2). Significado de las diferencias entre sitios para cada especie: ns= no significativo, * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.

El Cu a 37µM inhibió la ANR en trigo (Luna et al., 1997) en un 61%. Huber y Huber (1995) reportan una inhibición del 80 a 85% de la ANR por Mg. Encontraron ANR desde 1,6 a 11,0µmol NO2-·g-1·PF·h-1. Sin embargo por preincubación con Pi, KCl o 5’-AMP la inhibición por Mg fue sólo de 33, 12 o 17%, respectivamente. Kandlbinder et al. (2000) reportaron una inhibición de 35% de la ANR máxima por oscuridad, siendo ésta de 25µmol NO2-·g-1·PF·h-1. Singh et al. (1997/98) reportaron en raíces de Vigna radiata disminución de la ANR por efecto del Pb, pero en las hojas encontraron un incremento. Kevresan et al. (2001) reportaron disminución de la ANR en plántulas de Pisum sativum por efecto del Ni, Cd y Pb.

En este trabajo las muestras a las que se les determinó ANR no fueron pre-iluminadas ni se desalinizaron los extractos, por lo que no sorprende que nuestros valores resulten muy bajos si se comparan con los valores anteriores. En espinaca se obtuvo 5,1 ±1,8mmol NO2-·g-1 ·PS·h-1, que corresponde a 0,4 ±0,1µmol NO2-·g-1·PF·h-1.

Aunque los mayores valores de AFA expresados por materia seca se encontraron en hojas de lechuga de San Pedro (1,4±0,1µmol·g-1·PS·min-1), si los valores se expresaban por peso fresco, los máximos correspondieron a hojas de A. houstonianum. Gabbrielli et al. (1989) reportaron una disminución de AFA en raíces de Alyssum saxatile por efecto del Ni y Mg, con AFA comprendidas entre 12 y 30µmol·g-1·PS·min-1, las cuales son actividades más altas que las encontradas en este trabajo. En A. bertolonii, especie endémica de los suelos ultramáficos de La Toscana, aunque estos autores encontraron una estimulación de la AFA al cultivar las plántulas a bajas concentraciones de Ni (<0,01mM) o Mg (<0,5mM), también encontraron una disminución por efecto de concentraciones mayores de estos metales, con valores de AFA comprendidos entre 15 y 52µmol·g-1·PS·min-1.

En resumen, en los dos sitios los suelos presentaron contenidos altos de Al, Fe y Cu, pero los suelos de San Antonio, por ser más ácidos, serían potencialmente más tóxicos. En ellos se encontraron menores contenidos de nutrientes tales como K, Ca, P, Mg, Mn y Zn. Estas diferencias entre sitios no se reflejaron siempre en las plantas, con excepciones tales como el Ni, correspondiendo los valores más altos de este metal a las muestras colectadas en San Antonio (hojas y/o raíces dependiendo de la especie). Se encontraron mayores concentraciones de metales en las malezas que en las plantas de cultivo y algunos indicadores fisiológicos como la peroxidación de lípidos pudiesen ser utilizados como síntomas de contenidos altos de metal.

Figura 8. Análisis de Componentes Principales para a) Características fisicoquímicas de los suelos de San Antonio (l0-10cm; ¡10-20cm) y San Pedro (n 0-10cm; o 10-20cm). b) Elementos minerales en hojas. c) Elementos minerales en raíces. d) Variables bioquímicas. Se presentan los resultados para hojas de lechuga (L), espinaca (S), Ageratum conyzoides (A) y A. houstonianum (H) en San Antonio (1) y San Pedro (2). Se absorbe 79, 67, 60 y 73% de la varianza en cada biplot.

%Arn: porcentaje de arena; %l: porcentaje de limo; %arc: porcentaje de arcilla; pHH: pH en agua; pHK: pH en KCl; Cl: clorofila; A/B: relación clorofila a/b; Car: carotenoides; Fl: flavonoides; Fen: fenoles totales; Lip: peroxidación de lípidos; Prot: proteínas; PFE: peso foliar específico; PFH: Relación peso freso / peso seco de hojas; PFR: Relación peso freso / peso seco de raíces; ANRH: actividad de nitrato reductasa en hojas; ANRR actividad de nitrato reductasa en raíces; AFAH actividad de fosfatasa ácida en hojas; AFAR actividad de fosfatasa ácida en raíces.

En las plantas más concentradas en metales no se observaron síntomas de senescencia, tales como disminución del contenido de clorofila y carotenoides. Por el contrario, su concentración de clorofila fue mayor, asociado a valores mas altos de N. Con la excepción de A. conyzoides de San Pedro, las medias de carotenoides fueron mas altas en las malezas. Los valores de media mayores de flavonoides se observaron también en las malezas, pero en lechuga de San Pedro los valores resultaron muy dispersos y con algunos valores muy altos.

Este trabajo refleja diferencias entre las concentraciones de metales de especies de cultivo y malezas muy comunes a nivel global, que están conviviendo en un mismo sitio en el trópico. Dichas diferencias pueden ser útiles en el momento de considerar prácticas agrícolas. Variables bioquímicas como la peroxidación de lípidos, sensibles a las concentraciones de metales, se identificaron en muestras de campo.

Conclusiones

Las malezas presentaron mayor concentración de Ca, Fe, Al y Cr que los cultivos.

Los cultivos y sus malezas asociadas presentaron concentraciones de Ni, Co, Pb y Cd por debajo de los niveles tóxicos en plantas.

Los valores más altos de clorofila, carotenoides y peroxidación de lípidos se encontraron en A. houstonianum.

Las lechugas hidropónicas presentaron mayor concentración de Mn. Sus raíces tuvieron menores valores de Fe, Cu y Ni, pero mayor de Zn, que las provenientes de suelos de San Antonio y San Pedro. Las lechugas no presentaron contaminación por Pb o Cd. Los valores más bajos de Al se encontraron en las plantas hidropónicas, que presentaron mayor concentración de clorofila, carotenoides, fenoles totales y proteínas y los menores valores de peroxidación de lípidos. Las raíces de las lechugas hidropónicas fueron más suculentas y su AFA fue mayor.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue subvencionado parcialmente por FONACIT (Proyecto S1-98003716). Las lechugas hidropónicas fueron una donación de Silvio Velandia.

REFERENCIAS

1. Anderson J, Ingram J (1993) Tropical Soil Biology and Fertility, a Handbook of Methods. C.A.B. International. Oxford. 221 pp.        [ Links ]

2. Amorim HV, Dougall DK, Sharp WR (1977) The effect of carbohydrate and nitrogen concentration on phenol synthesis in Paul’s Scarlet Rose cells grown in tissue culture. Plant Physiol. 39: 91-95.        [ Links ]

3. Baryla A, Laborde C, Montillet JL, Triantaphylidès C, Chagvardieff P (2000) Evaluation of lipid peroxidation as a toxicity bioassay for plants exposed to coper. Environ. Pollut. 109: 131-135.        [ Links ]

4. Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.        [ Links ]

5. Brun LA, Maillet J, Hinsinger P, Pépin M (2001) Evaluation of coper availability to plants in coper-contaminated vineyard soils. Environ. Pollut. 111: 293-302.        [ Links ]

6. Cakmak I, Horst WJ (1991) Effect of aluminium on lipid peroxidation, superoxide dismutase, catalase, and peroxidase activities in root tips of soybean (Glycine max). Plant Physiol. 83: 463-468.        [ Links ]

7. Chatterjee J, Chatterjee C (2000) Phytotoxicity of cobalt, chromium and copper in cauliflower. Environ. Pollut. 109: 69-74.        [ Links ]

8. Day TA, Demchik SM (1996) Influence of enhanced UV-B radiation on biomass allocation and pigment concentrations in leaves and reproductive structures of greenhouse-grown Brassica rapa. Vegetatio 127: 109-116.        [ Links ]

9. Ewais EA (1997) Effects of cadmium, nickel and lead on growth, chlorophyll content and proteins of weeds. Biol. Plantarum 39: 403-410.        [ Links ]

10. Fargašová A (2001) Phytotoxic effects of Cd, Zn, Pb, Cu and Fe on Sinapis alba L. seedlings and their accumulation in roots and shoots. Biol. Plantarum. 44: 471-473.        [ Links ]

11. Foy CD, Chaney RL, White MC (1978) The physiology of metal toxicity in plants. Ann. Rev. Plant Physiol. 29: 511-566.        [ Links ]

12. Gabbrielli R, Grosi L, Vergnano O (1989) The effects of nickel, calcium and magnesium on the acid phosphatase activity of two Alyssum species. New Phytol. 111: 631-636.        [ Links ]

13. Gallego SM, Benavides MP, Tomaro ML (1999) Effect of cadmium ions on antioxidant defense system in sunflower cotyledons. Biol. Plantarum. 42: 49-55.        [ Links ]

14. Glaab J, Kaiser WM (1999) Increased nitrate reductase activity in leaf tissue after application of the fungicide Kresoxim-methyl. Planta 207: 442-448.        [ Links ]

15. Hartley-Whitaker J, Ainsworth G, Meharg AA (2001) Coper- and arsenate-induced oxidative stress in Holcus lanatus L. clones with differential sensitivity. Plant Cell Environ. 24: 713-722.        [ Links ]

16. Huber SC, Huber JL (1995) Metabolic activators of spinach leaf nitrate reductase: Effects on enzymatic activity and dephosphorilation by endogenous phosphatases. Planta 196: 180-189.        [ Links ]

17. Jackson ML (1970) Análisis Químico de Suelos. Omega. Madrid. 662 pp.        [ Links ]

18. Kaiser WM, Kandlbinder A, Stoimenova M, Glaab J (2000) Discrepancy between nitrate reduction rates in intact leaves and nitrate reductase activity in leaf extracts: What limits nitrate reduction in situ? Planta 210: 801-807.        [ Links ]

19. Kandlbinder A, Weiner H, Kaiser WM (2000) Nitrate reductases from leaves of Ricinus (Ricinus communis L.) and spinach (Spinacia oleracea L.) have different regulatory properties. J. Exp. Bot. 51: 1099-1105.        [ Links ]

20. Kastori R, Plesnicar M, Sakac Z, Pancovic D, Arsenijevic-Maksimovic I (1998) Effect of excess lead on sunflower growth and photosynthesis. J. Plant Nut. 21: 75-85.        [ Links ]

21. Kevresan S, Petrovic N, Popovic M, Kandrac J (2001) Nitrogen and protein metabolism in young pea plants as affected by different concentrations of nickel, cadmium, lead, and molibdenum. J. Plant Nut. 24: 1633-1644.        [ Links ]

22. Larcher W (1995) Physiological Plant Ecology. Springer. Berlin. 506 pp.        [ Links ]

23. Lavid N, Schwartz A, Yarden O, Tel-Or E (2001) The involvement of polyphenols and peroxidase activities in heavy-metal accumulation by epidermal glands of the waterlily (Nymphaeaceaceae). Planta 212: 323-331.        [ Links ]

24. Lichtenthaler HK, Wellburn AR (1983) Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents. Biochem. Soc. Trans. 11: 591-592.        [ Links ]

25. Lindblad P, Guerrero MG (1993) Nitrogen fixation and nitrate reduction. En Hall DO, Scurlock JMO, Bolhar-Nordenkampf HR, Leegood RC, Long SP (Eds.) Photosynthesis and production in a changing environment: a field and laboratory manual. Chapman & Hall. London. pp. 299-312.        [ Links ]

26. Luna CM, Casano LM, Trippi VS (1997) Nitrate reductase is inhibited in leaves of Triticum aestivum treated with high levels of copper (1997) Plant Physiol. 101: 103-108.        [ Links ]

27. McGrath SP, Zhao FJ, Lombi E (2001) Plant and rhizosphere processes involved in phytoremediation of metal-contaminated soils. Plant Soil 232: 207-214.        [ Links ]

28. Miller RO (1998) Nitric-perchloric acid wet digestion in an open vessel. En Kalra YP (Ed.) Handbook of Reference Methods for Plant Analysis. CRC Press. Boca Raton. pp. 57-61.        [ Links ]

29. Marschner H (1995) Mineral nutrition of higher plants. Academic Press. London. 889 pp.        [ Links ]

30. Monni S, Uhlig C, Hansen E, Magel E (2001) Ecophysiological responses of Empetrum nigrum to heavy metal pollution. Environ. Pollut. 112: 121-129.        [ Links ]

31. Murphy J, Riley J (1962) A modified single solution method for determination of phosphate in natural waters. Anal. Chem. Acta 27: 31-36.        [ Links ]

32. Ouzounidou G, Ilias I, Tranopoulou H, Karataglis S (1998) Amelioration of copper toxicity by iron on spinach physiology. J. Plant Nut. 21: 2089-2101.        [ Links ]

33. Pereira PH, Cambraia J, Sant’Anna R, Mosquim PR, Moreira MA (1999) Aluminum effects on lipid peroxidation and on the activities of enzymes of oxidative metabolism in sorghum. Rev. Brasileira Fisiol. Veg. 11: 137-143.        [ Links ]

34. Prasad MNV (1997) Trace Metals. En Prasad MNV (Ed.) Plant Ecophysiology. John Wiley & Sons. Chichester. pp. 207-249.        [ Links ]

35. Ross SM (1994) Sources and forms of potentially toxic metals in soil-plant systems. En: Ross SM (Ed.) Toxic Metals in Soil-Plant System. John Wiley & Sons. Chichester. pp. 3-25.        [ Links ]

36. Salt DE, Smith RD, Raskin I (1998) Phytoremediation. Ann. Rev. Plant Physio. Plant Mol. Biol. 49: 643-668.        [ Links ]

37. Sandalio LM, Dalurzo HC, Gómez M, Romero-Puertas MC, del Río LA (2001) Cadmium-induced changes in the growth and oxidative metabolism of pea plants. J. Exp. Bot. 52: 2115-2126.        [ Links ]

38. Shah K, Kumar RG, Verma S, Dubey RS (2001) Effect of cadmium on lipid peroxidation, superoxide anion generation and activities of antioxidant enzymes in growing rice seedlings. Plant Sci. 161: 1135-1144.        [ Links ]

39. Singh RP, Dabas S, Choudhary A, Maheshwari R (1997/98) Effect of lead on nitrate reductase activity and alleviation of lead toxicity by inorganic salts and 6-benzylaminopurine. Biol. Plantarum. 40: 399-404.        [ Links ]

40. Statsoft Inc. (1993) Statistica for Windows 4.5: Help Manual. Versión electrónica.        [ Links ]

41. Tabatabai MA, Bremner JM (1969) Use of p-nitrophenylphosphate for assay of soil phosphatase activity. Soil Biol. Biochem. 1: 301-307.        [ Links ]

42. van Assche F, Clijsters H (1990) Effects of metals on enzyme activity in plants. Plant Cell Environ. 13: 195-206.        [ Links ]

43. van Hasselt PR, Chow WS, Andersen JM (1996) Short-term treatment of pea leaves with supplementary UV-B at different oxygen concentrations: impacts on chloroplast and plasma membrane bound processes. Plant Sci. 120: 1-9.        [ Links ]

44. Wierzbicka M (1999) Comparison of lead tolerance in Allium cepa with other plant species. Environ. Pollut. 104: 41-52.        [ Links ]

45. Xiong ZT (1997) Bioaccumulation and physiological effects of excess lead in a roadside pioneer species Sonchus oleraceus L. Environ. Pollut. 97: 275-279.        [ Links ]

46. Zeid IM (2001) Responses of Phaseolus vulgaris to chromium and cobalt treatments. Biol. Plantarum. 44: 111-115.        [ Links ]