CARACTERIZACIÓN DE CLONES DE YUCA (Manihot esculenta) MEDIANTE MARCADORES PROTÉICOS E ISOENZIMÁTICOS

Alexandra Schmidt, Francia Fuenmayor y Morela Fuchs

Alexandra V. Schmidt H. Ingeniero Agrónomo y M.Sc. en Agronomía, Universidad Central de Venezuela (UCV). Investigador, Laboratorio de Virología Vegetal, Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (CENIAP), Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA). Dirección: Apartado 4653. Maracay 2101-Aragua, Venezuela. e-mail: aschmidt@inia.gov.ve

Francia Fuenmayor. Ingeniero Agrónomo, UCV. M.Sc. en Agronomía, Universidad de Birmingham, Inglaterra. Investigador, Recursos Fitogenéticos, CENIAP / INIA. e-mail: ffuenmayor@inia.gov.ve

Morela Fuchs. Ingeniero Agrónomo y M.Sc. en Agronomía, Investigador, Laboratorio de Biotecnología Vegetal, CENIAP / INIA. e-mail: mfuchs@inia.gov.ve

Resumen

Se llevó a cabo la caracterización de 65 clones seleccionados de un total de 160 existentes en el banco de germoplasma de yuca (Manihot esculenta Crantz) del CENIAP-INIA, Maracay, Venezuela, por medio de electroforesis de isoenzimas y proteínas hidrosolubles, para complementar la caracterización morfológica realizado a estos clones. Los clones analizados mostraron gran variabilidad isoenzimática en casi todos los sistemas evaluados, excepto con las peroxidasas. El análisis de a y b esterasas en puntas de raíces detectó mayor variabilidad entre los clones que los sistemas evaluados en tejidos de hojas jóvenes (proteinas desnaturalizadas, peroxidasas y rubisco), resultando similar a la caracterización morfológica y presentándose como un posible complemento esta última.

Summary

The characterization of 65 clones selected out of the 160 clones present in the cassava (Manihot esculenta Crantz) germplasm bank of CENIAP-INIA, Maracay, Venezuela, was performed by electrophoresis of isoenzymes and hydrosoluble proteins, so as to complement the morphological characterization of these clones. The analyzed clones showed large isoenzyme variability in almost all of the evaluated systems, except peroxydases. The analysis of a and b esterases in root tips detected larger variability amongst the clones that the systems evaluated in young leaf tissues (denaturized proteins, peroxydases and rubisco), being similar to the morphological characterization and, thus, a possible complement to the latter.

Resumo

Realizou-se a caracterização de 65 clones selecionados de um total de 160 existentes no banco de germoplasma de mandioca (Manihot esculenta Crantz) do CENIAP-INIA, Maracay, Venezuela, por meio de eletroforeses de isoenzimas e proteínas hidro solúveis, para complementar a caracterização morfológica realizado a estes clones. Os clones analisados mostraram grande variabilidade isoenzimática em quase todos os sistemas avaliados, exceto com as peroxidasas. A análise de a e b esterasas em pontas de raízes detectou maior variabilidade entre os clones que os sistemas avaliados em tecidos de folhas jovens (proteínas desnaturalizadas, peroxidasas e rubisco), resultando similar à caracterização morfológica e apresentando-se como um possível complemento esta última.

PALABRAS CLAVE / Isoenzimas / Manihot esculenta / Marcadores Bioquímicos / Yuca /

Recibido: 04/08/2003. Aceptado: 28/11/2003

La yuca (Manihot esculenta Crantz) es un cultivo importante para el mundo, que proporciona alimento a más de 500 millones de personas (FAO, 2003). Entre las ventajas que presenta la yuca como cultivo para los países productores, la más importante es el hecho de que no se produce en zonas templadas (Cock, 1982; Mantilla y Villafañe, 1999). La mayor parte de la producción de yuca proviene de pequeñas plantaciones en condiciones marginales, muchas veces afectadas por complejos de enfermedades y plagas para cuyo control los agricultores han seleccionado variedades resistentes durante muchas generaciones y en forma rudimentaria.

En los programas de mejoramiento del cultivo es importante una adecuada caracterización e identificación de los materiales mediante descriptores agro-morfológicos. No obstante, estos rasgos son alterables por factores abióticos como el ambiente y bióticos como la edad del cultivo. Es ahí donde los programas de mejoramiento y los bancos de germoplasma juegan un papel importante, al incrementar la probabilidad de obtener genotipos adecuados a condiciones que mejoren su producción (Cock, 1982; Henry y Gottret, 1996).

La importancia del mantenimiento de estos recursos en bancos de germoplasma se mide mediante la caracterización de su diversidad genética (Simpson y Withers, 1986; Bretting y Widrelechner, 1995; Karp et al., 1997) y la efectividad en la exploración de ésta depende del tipo de carácter y la forma de evaluarlo (Brown, 1978). En primera instancia se emplea la descripción agro-morfológica (Gulick et al., 1983; Simpson y Withers, 1986) y en muchas oportunidades es complejo el reconocimiento de los genotipos para cada loci que afecta a cada carácter, debido al control poligénico y los efectos pleiotrópicos y epistáticos (Brown, 1978; Bretting y Widrelechner, 1995). Como complemento se han desarrollado técnicas bioquímicas como la electroforesis de proteínas (isoenzimas) y el análisis directo del ADN (Hussain et al., 1988; Karp et al., 1997; Peters, 1998). Estas técnicas son empleadas para detectar marcadores enzimáticos, asociándolos con características morfológicas (Ramírez et al., 1991; Ferreira y Grattapaglia, 1996; Alfenas et al., 1998; Brune y Alfenas, 1998), lo que agiliza el análisis de grandes cantidades de materiales (Simpson y Withers, 1986).

En cuanto a la caracterización enzimática de la yuca existen diversos trabajos (Hussain et al., 1987; Ramírez et al., 1987; Ramírez et al., 1991; De Oliveira et al., 1992; Ocampo et al., 1992; Polanco, 1998). Hussain et al. (1987) demostraron que el análisis de secciones terminales de raíces de 5mm, mediante el sistema esterasas (a y b) permitió discriminar hasta 86% de la colección, logrando revelar 22 bandas de esterasas, combinando descriptores morfológicos con enzimas y detectando posibles duplicados. También existen estudios de caracterización de M. esculenta, M. glasiovii e híbridos naturales de ambos (Lefèvre y Charrier, 1993a) utilizando diez sistemas enzimáticos para examinar el polimorfismo de la colección de germoplasma. Posteriormente, estudiaron la diversidad en la colección (Lefèvre y Charrier, 1993b), basados en los 17 loci polimórficos.

El objetivo de este trabajo fue caracterizar 65 clones de yuca del banco de germoplasma del CENIAP-INIA (antes FONAIAP), mediante el uso de la electroforesis de enzimas y proteínas hidrosolubles para complementar el análisis de caracterización morfológica realizado a estos clones.

Materiales y Métodos

Se utilizaron raíces y hojas provenientes de estacas de 65 clones (Tabla I) del Banco de Germoplasma de yuca del CENIAP / INIA (antes FONAIAP), de un total de 160 clones seleccionados sobre la base del mejor comportamiento agronómico mediante los descriptores recomendados por Gulick et al. (1983) y por Gonçalves y Guevara (1998). Los materiales caracterizados fueron procesados para electroforesis según las recomendaciones de Hussain et al. (1987) y Ramírez et al. (1987), y con base en los protocolos de análisis de proteínas hidrosolubles e isoenzimático de yuca establecidos por Fuenmayor et al. (2001).

Los sistemas empleados para la caracterización fueron proteínas desnaturalizadas (PD-SDS), rubisco (RBC) y peroxidasas (PRX, E.C. 1.11.1.7) en hojas apicales, mientras que en secciones apicales de raíces se evaluó a las esterasas (a-EST y b-EST, E.C. 3.1.1.1).

La identificación de las bandas se realizó de acuerdo con su movilidad relativa (Mr). Cada muestra se evaluó en 3 repeticiones y se promediaron los valores de migración para cada banda. Luego de obtenidos todos los zimogramas, se estableció el total de bandas que presentó cada sistema, y se construyó una base de datos. Los valores de Mr fueron transformados a códigos binarios bajo la forma de matriz de presencia (1) y ausencia (0) de cada banda para cada sistema, para cuya evaluación se emplearon los paquetes estadísticos CSTAT (1989) y NTSYS (Rohlf, 1987).

Se aplicó el análisis de coordenadas principales ACCORDAP (Aulicino y Bettini, 1998) para determinar la representatividad de cada banda (Bretting y Widrelechner, 1995), a fin de detectar las bandas más apropiadas para la evaluación. La agrupación de los clones fue del tipo Clasificación Jerárquica Ascendente en Cuadro Binario con coeficiente de Yule (Y). El criterio de agregación fue la distancia promedio UPGMA (Sneath y Sokal, 1973), calculada mediante correlación cofenética de la matriz y jerarquía indexada (Cuadras, 1991). Se calculó el coeficiente de correlación cofenética (r), para determinar la homogeneidad entre la matriz de distancia y el dendrograma (Rohlf y Sokal, 1981).

Resultados y Discusión

Análisis visual entre sistemas

Para el análisis de extractos de hojas jóvenes con PD-SDS se detectaron un total de 52 bandas, para RBC 36 bandas y cada clon presentó un patrón. En cambio, las PRX permitieron agrupar los clones en 32 patrones bien definidos (Figura 1), con 19 bandas de diferente Mr, con variaciones de 9 a 14 bandas por patrón. Se logró definir 9 zonas de actividad, en su mayoría de comportamiento monomérico. Otro aspecto a resaltar es que algunos de los clones que conformaron a los patrones presentaron relación con la zona de colecta, tales como en el patrón Nº1 los clones MEVEN 61 y México 59, ambos de Aragua (CENIAP), y para el patrón Nº2 los clones M278 y M307, ambos de Amazonas. Para la colecta de Sucre se presentaron con el mismo patrón Nº4 los clones M434 y M440; con el patrón Nº24 los materiales M366, M394 y M395, y con el patrón Nº 26 los clones M392 y M478.

Para extractos de puntas de raíces analizadas con a-EST, se observó que el sistema enzimático logró detectar 35 bandas bien definidas (Figura 2), de las cuales cada patrón presentó entre 5 y 11. Todos los clones presentaron patrones únicos que los identifican. En contraste, Polanco (1998), usando extractos de raíz reservante analizados con este sistema, encontró una zona difusa que no pudo ser analizada, detectando solo 10 patrones electroforéticos para 124 clones. En el análisis visual de las b-EST cada clon presentó un patrón distinto, con un total de 29 bandas (Figura 3), de 4 a 12 bandas por clon. En contraste, Polanco (1998) encontró en este sistema, para extractos de raíz reservante, una zona sin polimorfismo, y otra polimórfica con 19 patrones electroforéticos diferentes de 124 clones. Ambos sistemas no detectaron relaciones de patrones de bandas con zonas de colecta. Además, no fue posible la interpretación genética de este sistema debido a la complejidad de los patrones de bandas, coincidiendo en este aspecto con los resultados obtenidos por Polanco (1998).

Análisis integral por ACOORDAP

A fin de crear un conjunto de bandas que permitieran caracterizar el conjunto de clones evaluados, se realizó un análisis multivariado de las bandas seleccionadas por el análisis estadístico para cada sistema (Tabla II), con 45,08% al tercer factor de valor propio acumulado, valor altamente significativo, para prueba de c², y un coeficiente r= 0,53 (Tabla III), aceptable según Cuadras (1991), demostrando que de 49 bandas analizadas, solo 23 presentaron mayor peso para explicar la variabilidad enzimática del grupo de clones. A diferencia de Polanco que de un total de 37 bandas analizadas de los sistemas malato deshidrogenasa (MDH), a-EST y b-EST en hojas de plantas adultas y raíces reservantes, de 124 clones de la colección de yuca de Facultad de Agronomía, UCV, el sistema solo seleccionó 8 con mayor peso para explicar la variabilidad enzimática.

Clasificación UGPMA combinado

El dendrograma de las bandas isoenzimáticas combinadas seleccionadas (Figura 4) presentó una matriz de distancia cuyos valores variaron de 7,7% hasta 27,2%. La clasificación jerárquica se realizó con el criterio UPGMA a 23,5%. En este árbol se observa que de las 12 clases generadas, las menores distancias son ¹ 0, siendo D= 7,7%, que corresponde a los clones Burrera y Tempranita, pertenecientes a la clase IX. Además, todos los individuos dentro de las clases están separados en valores de distancia. Polanco (1998), al evaluar 124 clones de yuca mediante componentes principales (ACP) con tres sistemas enzimáticos (MDH, a-EST y b-EST) en tejidos de hojas de plantas adultas y raíces reservantes, detectó gran similitud isoenzimática entre los clones (D= 0) y solo tres formaron una clase cada uno.

Se detectaron algunas coincidencias de clones con zonas de colecta dentro de una misma clase, tales como para los clones Amacuro 130 y Amacuro 144 (clase I) para Delta Amacuro; M433 y M478 de Sucre; los clones Bolívar 58 y Brasileña 12 de Bolívar (clase VII). En la clase IV, de Sucre, los clones M434, M440, M402, M422, M338, M394, M365, M366, M393, M395 y M479; mientras que de Amazonas M278, M307, M291, M285 y M292; para los de Aragua, UCV, UCV 2076 y UCV 2184. En la clase III, Plan de hierro, Juliana catira y Querepa blanca, de Anzoategui, y Proletaria con México 59, estos últimos de Aragua (CENIAP). Para la clase V, los clones Bolívar 43 y Bolívar 89, de Bolívar.

Análisis de características morfológicas

Para determinar la correlación entre algunas características morfológicas e isoenzimáticas, se seleccionaron algunos descriptores morfológicos (Gonçalves y Guevara, 1998) aplicados a los clones del banco de germoplasma de yuca del CENIAP, resultando en 4 descriptores mínimos y 8 principales (Tabla IV).

Al conjunto de datos se le aplicó un análisis multivariado similar al de los resultados isoenzimáticos (correspondencias múltiples de variables seleccionadas), de las cuales quedaron seleccionadas, con sus respectivos niveles, color de la hoja apical (CHA), color del pecíolo (CP), color extremo del tallo (CET), color de la hoja expandida (CHE), ancho del lóbulo central (ALC), relación longitud del lóbulo central y ancho del lóbulo central (RLA) y color de la epidermis del tallo (CEP). Se alcanzó un nivel de 35,68% de clasificación, resultando significativo (p£0,05, prueba de c²) al tercer factor del valor propio acumulado y el coeficiente (r) fue de 0,67 que es aceptable según Cuadras (1991).

El dendrograma de la agrupación jerárquica ascendente UPGMA a 30% (Figura 5) presentó una matriz de distancia con valores que variaron de 0 a 41,2%. Se observan clones que el sistema no logra separar (D= 0), tales como Amacuro 130 con M285 y M422 con México 59 en la clase I; Juliana con M395 y M478, M180 con Morichalera, M307 con MEVEN 95, M388 con M402, Chapapotera con MEVEN 61; Barinas 1 con M366; y Bolívar 50 con M393.

Análisis global

Como se ha visto, la yuca presenta una amplia variación en caracteres morfológicos y fisiológicos, debido a que es altamente heterocigota, de polinización cruzada y con un gran número de especies silvestres relacionadas (López et al., 1987). Ésta puede ser la razón por la cual se observó gran variabilidad de patrones electroforéticos en los sistemas enzimático-proteicos evaluados. Sin embargo, se detectaron clones que coinciden en D= 0, es decir que para el sistema de análisis estadístico son iguales, tales como Bolívar 50 y Lengua e' pájaro para PD-SDS y en RBC en la clase III; Juliana y UCV 2105 en RBC (clase III), y en PRX (clase I); M278 y M307 para RBC (clase III), y PRX (clase I). Para los siguientes sistemas todos los clones están en la clase I: M422, M433 y M440 para PD y RBC; M394 y M395 en PD y PRX; Amacuro 130 y MEVEN 61 para RBC y PRX; Amacuro 144, Amazonas 188 y M440 en RBC y PRX; Amacuro 144 y Tempranita en PRX y a-EST; Amacuro 130 con UCV 2105 para PRX y a-EST.

La mayoría de las coincidencias entre clones tienden a estar en los sistemas evaluados en hojas y en varios materiales colectados en Sucre, que tienden a crear altas relaciones entre ellos, lo que indica que sus sistemas enzimáticos-proteicos son muy parecidos.

En la Tabla V se presenta la comparación de las agrupaciones derivadas de los dendrogramas de los sistemas proteicos, del combinado de bandas isoenzimáticas y de las características morfológicas. Se evidencia cómo los sistemas evaluados en el tejido foliar tienden ligeramente a clasificar al grupo de individuos de manera muy similar. En cambio, los sistemas analizados en raíces (esterasas) son disímiles entre sí en la forma de agrupación, con pocas coincidencias; mientras que entre el combinado de bandas seleccionadas (CI) y el morfológico (M) se observan 7 clones que coinciden, los cuales son Amacuro 130 (clase I), Amacuro 134 (clase II, salvo en PRX), Amacuro 144 (clase I, salvo en b-EST y morfológico), M278 (clase IV), M365 (clase IV), M366 (clase IV), M393 (clase IV) y M434 (clase IV).

Con respecto al comportamiento según la zona de colecta se observó que los materiales de Amacuro quedaron agrupados en las mismas clases para PD-SDS y RBC, mientras que los clones Amacuro 130 y Amacuro 134 quedaron en las mismas clases para todos los sistemas (I y II, respectivamente). Las colectas de Bolívar resultaron ser mas heterogéneas, los clones Bolívar 43 y Bolívar 50 quedaron en la clase V para ambos sistemas esterasas. En cuanto a los materiales de Monagas, sólo presentaron coincidencias en el sistema morfológico (clase II). De los clones de Anzoátegui resaltan Plan de hierro y Querepa blanca, los cuales quedaron en la misma clase I para PD, RBC y PRX, y morfológicamente en la clase II. Entre los materiales de Amazonas se observó bastante variabilidad de clasificación.

Al observar los resultados del análisis multivariado aplicado a todos los sistemas enzimáticos, el mismo aparenta ser incompleto, ya que solo considera algunas bandas (las más comunes) de cada sistema y no el total detectado, dejando de considerar bandas polimórficas que pueden estar explicando parte de la diversidad fenotípica de los patrones de los sistemas evaluados. Esto puede deberse a que ninguna de las bandas mencionadas fue seleccionada por el sistema de análisis, es decir que la evidencia estadística de este análisis no está reflejando la realidad, ya que ellas son índices de diferente huella digital.

No obstante lo referido, el análisis estadístico confirma los resultados obtenidos por Hussain et al. (1987, 1988), Ramírez et al. (1987, 1991), De Oliveira et al. (1992) y Ocampo et al. (1992), quienes utilizaron patrones ab-EST y las líneas elites de mejoramiento, para determinar la huella digital de cada uno de los clones de la colección central y las posibles duplicaciones, además de otras características tales como nombre, origen geográfico, diversidad morfológica. Este concepto sería un aspecto interesante de abordar en el manejo del banco de germoplasma de yuca del CENIAP-INIA, cuando la caracterización con el sistema ab-EST en la colección esté completa.

Los sistemas evaluados en hojas agrupan a una buena parte de los individuos en una sola clase, la cual de forma coincidente corresponde a la agrupación I, como se observa en PD-SDS con 41 clones, para RBC con 32 y con 41 en PRX. Un comportamiento similar se observó en el agrupamiento morfológico, con 31 clones en la clase II. Es evidente la capacidad de los sistemas esterasas en extractos de puntas de raíces de plantas jóvenes, de permitir la discriminación entre clones, inclusive al comparar con el combinado de bandas isoenzimáticas y aún más con el morfológico, ya que diferencian materiales que morfológicamente aparentan ser similares, lo que podría inducir a un error de descarte de material genético que puede ser de gran importancia como fuente de variabilidad para futuros programas de mejoramiento (Ocampo et al., 1992). La evaluación de clones de yuca mediante ab-EST en tejido de puntas raíces de plantas jóvenes es un procedimiento repetible, polimórfico, alto número de bandas detectables, económico, sencillo y permite la detección de posibles clones duplicados. Esto permite considerar a las esterasas como un complemento para caracterización más detallada de la colección de yuca del CENIAP-INIA, como lo han logrado Ramírez et al. (1991) y De Oliveira et al. (1992). Además, el resto de los sistemas estudiados permiten poseer información adicional de la caracterización y posterior identificación de cada uno de los clones.

Recomendaciones

Debido a que esta evaluación fue realizada solo a 41% de la colección de yuca, se propone continuar las evaluaciones del resto de los clones con los sistemas proteicos seleccionados en este trabajo, especialmente con las ab-EST, técnica que permite detectar mejor la variabilidad enzimática entre clones.

Se sugiere realizar un análisis estadístico comparativo que considere la totalidad de las bandas observadas y el uso de otros índices, que permita evaluar la totalidad de la varianza fenotípica de los materiales evaluados.

Es recomendable considerar el uso de marcadores de peso molecular y la medición de la intensidad de bandas en cultivares promisorios, para futuras evaluaciones, a fin de determinar la presencia de características proteicas relacionadas con rasgos de interés agronómico, fisiológico o morfológico.

Es aconsejable considerar el análisis de descendencia a fin de determinar patrones de herencia de estas enzimas, y el análisis conjunto de características morfológicas y agronómicas relacionadas a estos sistemas para obtener marcadores de rasgos de interés en fases tempranas de desarrollo y facilitar la determinación del nivel de diversidad genética del banco de germoplasma, aspecto importante para el desarrollo de programas de mejoramiento genético.

Para futuras investigaciones sería importante desarrollar programas de investigación en los cuales se profundice el análisis de la condición ontogénica, fisiológica e histológica de la planta en nuestras condiciones de producción para lograr las máximas expresiones de la técnica enzimática aquí desarrollada.

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