APOMIXIS, POLIEMBRIONÍA SOMÁTICA Y CIGÓTICA

IN VIVO EN LECHOSA

Ariadne Vegas, Gustavo Trujillo, Yanet Sandrea y Jonás Mata

Ariadne Vegas. B.Sc. en Botánica, Universidad de Manchester, Inglaterra. M.Sc. en Agronomía y Doctora en Ciencias Agrícolas, Universidad Central de Venezuela (UCV). Investigador, Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA), Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (CENIAP). Dirección: Unidad de Biotecnología Vegetal, INIA-CENIAP, Apartado Postal 588, Maracay 2101, Venezuela. e-mail: avegas@inia.gov.ve.

Gustavo Trujillo. Ingeniero Agrónomo, UCV. M.Sc. y Ph.D., Universidad del Estado de Michigan, EEUU. Profesor, Facultad de Agronomía, UCV. Dirección: Instituto de Botánica Agrícola, Facultad de Agronomía, UCV. Apartado Postal 4579, Maracay 2101, Venezuela. e-mail: gus202@cantv.net.

Yanet Sandrea. Estudiante de Postgrado, Facultad de Agronomía, UCV. e-mail: yanetsand@yahoo.com.

Jonás Mata. Ingeniero Agrónomo, UCV. Profesor, Facultad de Agronomía, UCV. Dirección: Instituto de Genética, Facultad de Agronomía, UCV. Apartado Postal 4579, Maracay 2101, Venezuela. e-mail:jonas_mata@latinmail.com.

Resumen

Se describen la apomixis, la poliembrionía somática y cigótica in vivo en lechosa (Carica papaya L.). Se estudió la apomixis en siete poblaciones de lechosa ginóicas, para ello se taparon las flores con una bolsa de papel, previo a la antesis. Se obtuvo un promedio de 61% de frutos cuajados. En estos frutos, hubo formación de semillas, de las cuales se logró regenerar in vitro brotes verdes de apariencia normal. Por otro lado, en frutos de algunas poblaciones de lechosa ginóicas y andromonóicas se observaron en las semillas vanas sin endospermo, de 1 a 4 embriones localizados en el extremo del micrópilo. Estos embriones se rescataron y se germinaron in vitro. Las plantas regeneradas mantuvieron las características de la planta madre. En semillas normales del tipo Amameyada, se observaron dos embriones cigóticos por semilla, en una frecuencia de 5 en 3000 semillas disectadas.

Summary

Apomixis, somatic and zygotic polyembryony in vivo are described in papaya (Carica papaya L.). Apomixis was studied in seven populations of ginoic papaya plants, by enclosing the flowers in paper bags before opening. An average of 61% of the flowers set fruits. These fruits formed seeds from which green normal shoots were regenerated in vitro. In fruits of some ginoic and andromonoic papaya populations, empty seeds were observed without endosperm, with one to four embryos located in the micropile end. These embryos were rescued and germinated in vitro. Regenerated plants showed the same characteristics as mother plants. In normal seeds from the Amameyada papaya type, the occurrence of two zygotic embryos per seed was observed with a frequency of 5 in 3000 dissected seeds.

Resumo

No presente trabalho descrevem-se a apomixia, poliembrionia somática e zigótica in vivo no mamão (Carica papaya L.). A Apomixia foi estudada em sete populações ginóicas de mamão semeadas no campo e cujas flores foram cobertas com um saco de papel antes da ântese. Uma média de 61% das flores resultaram em frutos. Nestes frutos, sementes foram formadas e foi possível regenerar rebentos verdes de aparencia normal em meio de cultura. Nos frutos de algumas populações de mamão ginóica e andromonóica foi possível observar sementes sem endosperma com um a quatro embriões localizados na extremidade micropilar. Estes embriões foram resgatados e germinados em meios de cultivo in vitro. As plantas regeneradas mantiveram as características da planta-mãe, o que sugere a sua natureza somática. Por outro lado, em sementes normais de mamão do tipo Amameyada foram observados dois embriões zigóticos por semente provida de endosperma, numa frequência de cinco em 3.000 sementes dissectadas.

PALABRAS CLAVE / Apomixis / Carica papaya / Lechosa / Papaya / Poliembrionia /

Recibido: 15/08/2003. Modificado: 05/12/2003. Aceptado: 08/12/2003.

Introducción

Se entiende por partenocarpia el desarrollo del fruto sin que ocurra la polinización ni la fecundación. En este caso, los frutos formados no producen semillas. Por otro lado se utiliza el término apomixis cuando ocurre la formación de semillas cuyos embriones han sido originados sin el proceso de la fecundación (Lindorf et al, 1985).

La partenocarpia es un fenómeno que ha sido citado en la lechosa (Carica papaya L.) y en miembros del género Vasconcellea, antes consideradas caricas. Se han observado casos relativamente frecuentes de partenocarpia en los híbridos naturales Vasconcellea x heilbornii Badillo nm. pentagona (Heilborn) (n.v. "Babaco"), V. x heilbornii Badillo nm. chrysopetala (Heilborn) (n.v. "chamburo"), y V. x heilbornii Badillo nm. fructifragans (García et Hernández), en las que parece ser inducida por hibridismo, ya que desarrollan frutos aún sin estímulo del polen (Heilborn, citado por Micheletti, 1980; Horovitz, citado por Badillo, 1971). Según Mekako y Nakasone (1975) los cruces Vasconcellea pennata x V. goudotiana, V. goudotiana x V. cauliflora, y C. papaya x V. pennata produjeron frutos partenocárpicos sin desarrollo de óvulos. Igualmente, Manshardt y Wenslaff (1989) señalaron la formación de frutos partenocárpicos en los cruces Vasconcellea x heilbornii Badillo nm. pentagona x C. papaya, y C. papaya x V. cundinamarcensis. También reportaron poliembrionía cigótica in vivo en el híbrido C. papaya x V. cauliflora. Horovitz y Jiménez (1967) mencionaron la formación de frutos partenocárpicos, sin semilla, en V. cauliflora y en menor frecuencia en C. papaya. Por otro lado, Badillo (1971) describió la partenocarpia obtenida artificialmente y observada en la naturaleza en plantas de lechosa. En estos casos, se cita la presencia de semillas fértiles, en frutos cuyas flores femeninas habían sido cubiertas previo a la antesis y en plantas femeninas que crecieron aisladas. Como hubo la formación de semillas, el autor debió acotar el término apomixis en vez de partenocarpia.

No se encontró referencia alguna sobre la poliembrionía somática o cigótica in vivo en lechosa. Litz y Conover (1981) señalaron más bien que la poliembrionía cigótica in vivo no ha sido reportada en este frutal.

El objetivo del trabajo fue estudiar la apomixis y la poliembrionía somática y cigótica in vivo en poblaciones de lechosa.

Materiales y Métodos

Estudio de la apomixis

Se estudió la apomixis en plantas ginóicas pertenecientes a 7 poblaciones de lechosa, denominadas Solo 6, 7 y 8; Paraguanera; Criolla; Larga; y Costa Rica. Cada siete días, las flores maduras fueron tapadas con una bolsa de papel, previo a la antesis (Figura 1). De estas plantas se llevó un registro del número de flores tapadas y frutos cuajados por un período de 12 meses. Los frutos cuajados verdes de 3 a 4 meses fueron cosechados y abiertos asépticamente, rociándolos con alcohol (70%), dentro de una campana de flujo laminar. Las semillas encontradas dentro de los frutos se cuantificaron y se disectaron de forma longitudinal tangencial, para no causar daño en la región donde se forma el embrión y se cultivaron in vitro en medios básicos MS (Murashige y Skoog, 1962) de germinación (Fitch, 1993) o multiplicación (Tovar, 1989). Las condiciones ambientales suministradas a los explantes fueron de 25 ±2ºC, 32µmol·s^-1·m^-2 y fotoperíodo de 16h.

Figura 1. a: Planta ginóica apomíctica facultativa de la población Larga mostrando cuajado de los frutos. 

b: Cuajado de los frutos tapados o no previo a la antesis.

Estudio de la poliembrionía somática y cigótica in vivo

Se estudio la ocurrencia de la poliembrionía somática in vivo en semillas vanas de frutos de las poblaciones Larga y Cartagena, originadas a partir de polinizaciones libres, mediante la disección longitudinal tangencial de estas semillas. Las semillas vanas, sin endospermo, que incluyeron embriones en su interior se sembraron en las condiciones y medios de cultivos mencionados, para su multiplicación y germinación. Posteriormente se usó el medio de cultivo de embriogénesis (Fitch y Manshardt, 1990) en condiciones de oscuridad a 25 ±2ºC, para lograr la multiplicación de los embriones, con la finalidad de obtener suficientes plantas para estudios posteriores de laboratorio y campo. Diez plantas de la población Cartagena obtenidas por esta vía se sembraron anexas a una plantación comercial, en Valle Guanape, estado Anzoátegui, Venezuela, bajo el mismo manejo agronómico y fueron evaluadas hasta la etapa de fructificación.

De la misma manera se disectaron 3000 semillas normales de la población Amameyada y se cuantificó el número de semillas que presentaron poliembrionía cigótica in vivo.

Medios de cultivoempleados para la siembra de semillas

Medio de germinación: Medio base MS, el cual contenía los macronutrientes, los micronutrientes, la solución de hierro y las vitaminas descritos por Murashige y Skoog (1962), cinetina (KIN) 0,1mg·l^-1, bencilaminopurina (BA) 0,2mg·l^-1; sacarosa 30g·l^-1; agar 8g·l^-1 (Fitch, 1993).

Medio de multiplicación: Medio base MS, ácido naftalenoacético (ANA) 0,08mg·l^-1, BA 0,4mg·l^-1, sacarosa 30g·l^-1, agar 8g·l^-1 (Tovar, 1989).

Medio de embriogénesis: Mitad del medio base MS con las soluciones hierro y vitaminas completas, glutamina 400mg·l^-1, ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) 10mg·l^-1, sacarosa 60g·l^-1, (Fitch y Manshardt, 1990).

Medio de enraizamiento: Medio base MS, ácido indol-3-acético (AIA) 5mg·l^-1, sacarosa 30g·l^-1 (Tovar, 1989).

Medio simple MS: Medio base MS, sacarosa 30g·l^-1.

A los medios mencionados se les ajustó el pH a 5,8 y se solidificaron con agar al 0,7%.

Multiplicación, germinación y aclimatación de los embriones y brotes

Las semillas se cultivaron en los medios de multiplicación y germinación, en las condiciones de luz mencionadas, para el desarrollo de los embriones in vivo. Por otro lado, los embriones somáticos inducidos a partir de embriones in vivo se multiplicaron en repliques sucesivos en el medio de embriogénesis. Las plántulas procedentes de embriones germinados, mayores de 1cm, se colocaron en el medio MS base para su elongación y desarrollo. En algunos casos se indujo la formación de raíces en las plántulas desprovistas de ellas, colocándolas en el medio de enraizamiento antes de la fase de aclimatación. Las plántulas ³3cm fueron transferidas a macetas con mezcla de suelo estéril, cubiertas con una bolsa plástica por 15 días aproximadamente, hasta su aclimatación, bajo condiciones controladas (25 ±2oC, 32µmol·s^-1·m^-2 y fotoperíodo de 16h). Posteriormente se transfirieron a condiciones de umbráculo y campo.

Resultados y Discusión

En los estudios de apomixis se encontró que de 281 flores cerradas previo a la antesis, en 31 plantas ginóicas, pertenecientes a siete poblaciones, un promedio de 61,49% de los frutos cuajaron (Tabla I). Los mayores valores de los frutos cuajados, desde 76 hasta 81% se presentaron en los materiales tipo Solo, los cuales estaban genéticamente relacionados. No se logró cosechar todos los frutos cuajados debido a que algunos de ellos se cayeron antes de la cosecha. Se observó que el aumento del porcentaje de cuajado estaba asociado a un régimen regular de riego.

En 39 de los frutos cosechados no hubo formación de semillas. En 25 frutos hubo formación de semillas (desde 1 hasta 131), pequeñas e irregulares con una sarcotesta translúcida y la esclerotesta de color blanco, que presentaron el saco embrionario colapsado, carecían de endospermo y embriones visibles diferenciados. Sin embargo, algunas semillas presentaron una masa de tejido pequeña en la región del micrópilo. En general, en todas las poblaciones que se cosecharon frutos, parte de ellos contenían semillas (Tabla I).

Al sembrar in vitro las semillas en medios de cultivo con auxinas (ANA) y/o citocininas (KIN o BAP) en presencia de la luz, se lograron regenerar brotes verdes de apariencia normal, posiblemente originados del desarrollo de embriones preexistentes; sin embargo, el origen de estos brotes no se pudo determinar mediante las observaciones que se realizaron al microscopio de luz.

Recientemente Tokumoto et al. (2000a, b) lograron inducir embriones somáticos in vitro a partir de óvulos proveniente de ovarios no fecundados, en medios de cultivo MS contentivos de giberelinas, en condiciones de oscuridad, obteniendo plantas con morfologías y patrones de RAPDs (del inglés "random amplified polymorphic DNA", o amplificación aleatoria del ADN polimórfico) diferentes, sugiriendo que las plantas provenían de células reproductivas haploides. En el presente trabajo se logró producir brotes directamente de los óvulos, sin inducir la fase de embriogénesis. Posiblemente estas diferencias se deban a la composición de los medios de cultivo y a las condiciones de luz a que se expusieron los explantes desde la siembra.

En frutos de la planta ginóica tipo Larga, originados de las polinizaciones libres, se observó que algunas de las semillas vanas presentaban entre 1 y 4 embriones localizados en el extremo del micrópilo. Sin embargo, no poseían endospermo y el saco embrionario estaba colapsado (Figura 2a). Este mismo fenómeno se presentó en semillas aparentemente vanas de frutos de plantas andromonóicas del tipo Cartagena, pudiéndose rescatar, multiplicar y germinar estos embriones inmaduros in vitro, como se muestra en la Figura 2b. Algunas de las plantas regeneradas fueron evaluadas en el campo, donde mostraron una morfología normal tipo Cartagena, fueron similares entre si y andromonóicas, lo que sugiere la procedencia asexual de estos embriones.

En frutos de la población tipo Amameyada se observó la ocurrencia de dos embriones por semilla, en una frecuencia baja de 5 en 3000 semillas normales disectadas, provistas de endospermo (Figura 3). Este fenómeno de poliembrionía cigótica debe ser extremadamente raro ya que no ha sido observado en otras poblaciones y no se ha citado anteriormente en la literatura.

Conclusiones y Recomendaciones

En lechosa, la apomixis se presenta con una frecuencia relativamente alta en algunas poblaciones estudiadas, por lo que se puede considerar una planta apomíctica facultativa.

Se sugiere la utilización del término apomixis en lugar de partenocarpia.

Esta característica podría incrementarse en programas de mejoramiento para producir un mayor número de frutos y menor cantidad de semillas, para beneficio del agricultor y consumidor, tal como se ha realizado en otros frutales (Pauwels et al., 1999).

Se recomienda realizar estudios citohistológicos para esclarecer la procedencia y ploidía de los brotes provenientes de óvulos sin fecundar y determinar el tipo de apomixis presente en lechosa.

Se reporta por primera vez la poliembríonia cigótica y somática in vivo en semillas normales y en semillas vanas de lechosa, respectivamente. Estudios citológicos y moleculares futuros podrían corroborar la naturaleza de estos embriones.

A través de la apomixis y la embrionía cigótica y somática in vivo, y mediante el cultivo de tejidos, se podrían lograr genotipos interesantes con valor para los programas de mejoramiento.

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