Efecto de la dosis de a amilasa (bacillus licheniformis), temperatura de solución y molido del grano de sorgo en la aglutinación del almidón y digestibilidad ruminal in vitro

Fernando Xicotencatl Plata Pérez, Raúl Ricalde Velasco, Luz María Melgoza Contreras, 

Germán David Mendoza Martínez y Francisco Javier Franco Guerra

Fernando Xicotencatl Plata Pérez. M.C., Colegio de Postgraduados, México. Profesor, Universidad Autónoma Metropolitana (UAM), México. Dirección: Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco. Departamento de Producción Agrícola y Animal. Calzada del Hueso 1100. Col. Villa Quietud. México D.F. 04970, México. e-mail: fplata_61@yahoo.com

Raúl Ricalde Velasco. M.Sc., Purdue University, EEUU. Profesor, UAM, Unidad Xochimilco, México.

Luz María Melgoza Contreras. Doctor, Universidad de Sevilla, España. Profesora, UAM, Unidad Xochimilco, México.

Germán David Mendoza Martínez. Ph.D., Nebraska University, EEUU. Profesor, Instituto de Recursos Genéticos y Productividad, Colegio de Postgraduados, México.

Francisco Javier Franco Guerra. Doctor, Universidad de Córdoba, España. Profesor, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, México.

 

Resumen

Para evaluar los efectos de una a amilasa termoestable de Bacillus licheniformis y de la temperatura de la solución sobre la aglutinación del almidón y la digestibilidad in vitro del grano de sorgo, se realizaron dos experimentos con arreglo factorial de tratamientos, aplicando tres temperaturas (5, 40 y 80ºC) y cuatro dosis de enzima (0, 2, 4 y 6 g/kg MS de sorgo). En el primer experimento se evaluó el grado de aglutinación del almidón del sorgo (3×4), y en el segundo la digestibilidad in vitro incluyendo también el proceso del grano (aglutinado y molido; 3×4×2). El porcentaje de partículas aglutinadas de diferente tamaño de partícula mostró una respuesta lineal (P<0,01) al incrementar la dosis de enzima, con excepción de las partículas de 2mm. El aumento de temperatura de la solución produjo un incremento en la aglutinación del almidón en partículas de menor tamaño (<0,85mm). El grano molido mostró mayor digestibilidad que el aglutinado (P<0,05). La mayor digestibilidad se observó a 40ºC (efecto cuadrático, P<0,05). Al incrementar la dosis de enzima, se aumentó la digestibilidad (efecto cuadrático) durante las primeras 12 horas de incubación.

Sumary

In order to evaluate the effects of a thermostable a amylase from Bacillus licheniformis and of the solution temperature on starch agglutination and in vitro digestibility of sorghum grain, two experiments were conducted with factorial arrangement of treatments, applying three temperatures (5, 40 and 80ºC) and four enzyme doses (0, 2, 4 and 6 g/kg DM of sorghum). In the first experiment, the agglutination degree of sorghum starch was evaluated (3×4), and in the second, in vitro digestibility was measured including also the effect of grain process (agglutinated and ground; 3×4×2). The percentage of particles agglutinated with different particle size, showed a lineal response (P<0.01) when the enzyme dose was increased, with the exception of the particles of 2mm. Increasing the temperature of the solution led to an increment on starch agglutination in particles of smaller size (<0.85mm). Ground grain presented higher digestibility than the agglutinated grain (P<0.05). The highest digestibility was observed at 40ºC (quadratic effect, P<0.05). Increasing enzyme doses, improved digestibility (quadratic effect) during the first 12 hours of incubation.

Resuno

Para avaliar os efeitos de uma a amilasa termoestável de Bacillus licheniformis e da temperatura da solução sobre a aglutinação do amido e a digestibilidade in vitro do grão de sorgo, realizaram-se dois experimentos com arranjo fatorial de tratamentos, aplicando três temperaturas (5, 40 e 80ºC) e quatro dose de enzima (0, 2, 4 e 6 g/kg MS de sorgo). No primeiro experimento avaliou-se o grau de aglutinação do amido do sorgo (3×4), e no segundo a digestibilidade in vitro incluindo também o processo do grão (aglutinado e moído; 3×4×2). A porcentagem de partículas aglutinadas de diferente tamanho de partícula mostrou uma resposta linear (P<0,01) ao incrementar a dose de enzima, com exceção das partículas de 2mm. O aumento de temperatura da solução produziu um incremento na aglutinação do amido em partículas de menor tamanho (<0,85mm). O grão moído mostrou maior digestibilidade que o aglutinado (P<0,05). A maior digestibilidade observou-se a 40ºC (efeito quadrático, P<0,05). Ao incrementar a dose de enzima, aumentou-se a digestibilidade (efeito quadrático) durante as primeiras 12 horas de incubação.

PALABRAS CLAVE / Aglutinación / Almidón / Amilasa / Bacillus licheniformis / Digestibilidad / Rumen /

Recibido: 21/07/2004. Modificado: 05/11/2004. Aceptado: 11/11/2004.

Introducción

El grano de sorgo es empleado principalmente como una fuente de energía en la alimentación de ganado y la eficiencia de su utilización está directamente relacionada a la digestión ruminal del almidón (Huntington, 1997; Beauchemin et al., 2001). La degradación del almidón en el rumen es uno de los factores más importantes en el comportamiento productivo de los rumiantes alimentados con dietas altas en grano (Márquez Salas et al., 1998), por lo que se han desarrollado procesos físicos tales como el quebrado, rolado y hojueleado, y químicos como la adición de enzimas o álcalis, a fin de incrementar la tasa de digestión del almidón y el valor energético de los granos (Gaebe et al., 1998; Santos et al., 1999, Beauchemin et al., 2001).

Tratamientos tales como el humedecimiento han tenido resultados benéficos al favorecer la actividad enzimática (Mensah y Tomkins, 2003); sin embargo, también se ha reportado que se puede reducir la digestibilidad del almidón (Queiroz et al., 2002). El humedecimiento a altas temperaturas es utilizado como parte del proceso de hojueleado en rumiantes y normalmente aumenta la energía metabolizable del grano (Huntington, 1997). En este proceso, el incremento de energía depende de la temperatura, cantidad del vapor, tiempo de exposición y otros factores que modifican la cantidad de agua que penetra al endospermo, y el grado de gelatinización del almidón (Colonna y Mercier, 1985). Cuando el almidón es expuesto a altas temperaturas y después enfriado, las regiones lineares de la molécula de almidón se reorganizan formando cristales que contienen pequeños fragmentos de glucosas unidas, las cuales son más resistentes a la hidrólisis (Topping y Clifton, 2001), fenómeno conocido como retrogradación y que afecta la digestión.

La hidrólisis del almidón es el resultado de la actividad de diversas amilasas produciendo oligosacáridos, maltotriosas, maltosas, maltohexosas, maltopentosas, maltotetrosas, dextrinas y pequeñas cantidades de glucosa (Gray, 1992; Pandey et al., 2000). A pesar de ello, el uso de enzimas amilolíticas exógenas ha recibido poca atención como una herramienta para el mejoramiento en la digestibilidad ruminal del almidón y como aditivo en la alimentación de rumiantes. La a amilasa exógena proveniente de Bacillus licheniformis es una de las enzimas más estudiadas por sus efectos en la degradabilidad del almidón (Gray, 1992; Pandey et al., 2000). Sin embargo, en los experimentos realizados se ha prestado poca atención a la temperatura de la solución de la enzima, al proceso físico del grano, así como a los cambios de tamaño de partícula del almidón por sus propiedades fisicoquímicas, por lo que, el objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de la temperatura de la solución, nivel de enzima y grado de aglutinación, en la digestibilidad in vitro del grano de sorgo.

Materiales y Métodos

Experimento 1

El objetivo de este ensayo fue conocer el efecto de la dosis de enzima a amilasa termoestable y de la temperatura de la solución de enzima diluida en agua, sobre la aglutinación del almidón en diferentes tamaños de partícula. Para ello se usó un diseño completamente al azar con arreglo factorial 3×4, con 3 repeticiones por tratamiento, donde los factores fueron la cantidad de enzima (0, 2, 4, y 6g de enzima de B. licheniformis ENMEX^® por kg de sorgo) y la temperatura de la solución enzimática (5, 40 y 80ºC). Se depositaron 100g de sorgo (Sorghum bicolor variedad Quezada caracterizado por tener (%) 9,6 de PC; 67,6 de almidón; 12,0 de FDN y 2,0 de cenizas) en charolas de aluminio para tratarse con 50ml de agua de cada temperatura con la enzima a las concentraciones indicadas. Posteriormente se deshidrataron por 48h en una estufa de aire forzado a 65ºC y se enfriaron a temperatura ambiente. Se analizó la concentración de proteína (N×6,25) después de agregar la enzima con un analizador de N Leco FP-428 de gasometría de combustión. El contenido de proteína (%) del grano tratado fue de 9,49; 9,15; 9,48 y 9,04 para las concentraciones de 0, 2, 4, y 6g enzima/kg grano respectivamente.

Se determinó el porcentaje y la magnitud de la aglutinación del almidón mediante la cuantificación del porcentaje del grano que quedó distribuido en cribas de distintos tamaños (2,38; 2,0; 1,68; 1,19; 0,85; 0,59; 0,425; 0,297 y 0,15mm respectivamente). Se hicieron contrastes para evaluar la respuesta lineal o cuadrática de las dosis de enzima y de los cambios de la temperatura de la solución con el procedimiento GLM de SAS (Herrera y Barreras, 2000).

Experimento 2

El objetivo de este ensayo fue conocer el efecto de la dosis de enzima a amilasa termoestable y de la temperatura de la solución de enzima diluida en agua, y de la aglutinación del almidón en la digestibilidad in vitro de la MS del sorgo. Se utilizó un diseño de bloques generalizado completamente al azar con arreglo factorial 3×4×2, usando como criterio de bloqueo el día de la incubación, y utilizando la interacción bloque × tratamiento como error. Los factores evaluados fueron el nivel de enzima (0, 2, 4, y 6g de enzima de B. licheniformis por kg de sorgo), la temperatura de la solución enzimática (5, 40 y 80ºC) y el proceso físico del grano de sorgo (molido a 1mm en molino Wiley y aglutinado). Antes de la incubación con microorganismos ruminales, las muestras fueron preparadas en charolas de aluminio como se describió en el Experimento 1.

Se midió la digestibilidad in vitro de la materia seca con la primera fase de la técnica de Tilley y Terry, (1963), deteniendo las fermentaciones a las 6, 12, 24 y 48h, realizando 3 incubaciones por tratamiento, con 0,5g de muestra. El fluido ruminal se obtuvo de un ovino canulado, alimentado con una dieta con 70% de sorgo, y al colectarse se le adicionó saliva artificial (McDougall, 1948) previamente calentada a 39ºC con 1g de urea (1g/l) para asegurar que el nitrógeno amoniacal no limitara la actividad microbiana (Mendoza et al., 1995). Al final de la fermentación se registró el pH del medio de incubación. Las medias de tratamientos se compararon mediante la prueba de Tukey (Herrera y Barreras, 2000). Los resultados fueron analizados con el procedimiento GLM de SAS (Herrera y Barreras, 2000).

Resultados

Experimento 1

En la Tabla I se presenta el tipo de respuesta a la dosis de enzima y a la temperatura en el porcentaje de aglutinación del almidón, pudiéndose apreciar que hubo una respuesta cuadrática (P<0,01) a la dosis de enzima, con excepción de las partículas de 2mm. La temperatura de la solución mostró efectos lineales en las partículas de menor tamaño. Las interacciones entre los factores se pueden apreciar en la Figura 1. Las enzimas incrementaron el porcentaje de partículas pequeñas a partir de una reducción en el porcentaje de partículas grandes. El efecto lineal de la temperatura de la solución también se manifestó en las partículas de tamaño intermedio y pequeño (£0,85mm) en una forma inversa al de la adición de enzimas. En la Figura 1 se puede observar que a 40ºC las partículas pequeñas se reducen mientras que con las otras temperaturas aumentan. Las temperaturas de 5 y 80ºC interactuaron con el nivel de enzima reduciendo el porcentaje de partículas grandes aglutinadas.

 

Experimento 2

No se detectaron interacciones por lo que se presentan efectos principales en la Tabla II. La digestibilidad de la MS del sorgo fue mayor en el grano molido (P<0,05) en todas las horas de incubación. Se observó una mayor digestión del grano con las dosis mayores de amilasa en las primeras 12h de fermentación, sin embargo, ese efecto no se manifestó a las 24 y 48h de incubación. Los efectos de la temperatura de la solución muestran que a las primeras 12h de fermentación; la mayor digestión (P<0,05) se observa en el grano tratado con la solución a 40ºC. El pH final de la incubación tuvo una correlación negativa con la digestibilidad de la MS (r= -0,758; P<0,05), reflejando los cambios en la actividad fermentativa de los factores evaluados.

Discusión

Experimento 1

Existe poca información relacionada a los cambios físicos y al tamaño de partícula del almidón al tratarse con enzimas amilolíticas. Wang et al. (2001) aplicaron enzimas usando agua como vehículo para adicionarlas al grano antes o después de rolarlo y encontraron que el método de aplicación afecta la eficiencia de acción de las enzimas. Bajo las condiciones de este experimento, la adición de enzimas interactuó con la temperatura del agua para modificar el porcentaje de las partículas aglutinadas en las partículas grandes (2,38 y 2cm). La mayor proporción de partículas aglutinadas se observó cuando la solución tuvo 40ºC con niveles moderados (2g) de amilasa, mientras que con niveles altos (4 y 6g) se redujo el grado de aglutinación dependiendo de la temperatura del agua (Figura 1 A y B). Dentro de las partículas intermedias (1,68; 1,19 y 0,85mm) se observa que con las dosis altas de amilasa (4 y 6g) el mayor porcentaje de partículas aglutinadas se encuentra a los 40ºC, mientras que las otras temperaturas disminuyen este porcentaje (Figura 1C-E), y dentro de las partículas pequeñas (0,59; 0,425; 0,297 y 0,15mm) los niveles intermedios de enzima (2 y 4g) redujeron el porcentaje de partículas pequeñas mientras que con 6g de amilasa se produjo el mayor porcentaje de estas (Figura 1F-I).

La explicación para los cambios en el porcentaje de partículas aglutinadas puede estar dada por la licuefacción, la cual consiste en una ruptura al azar de grandes polímeros en segmentos de talla pequeña y que reduce drásticamente la viscosidad de las soluciones gelatinizadas. Aparentemente a 40ºC y con niveles bajos de enzimas se obtuvo una menor licuefacción, mientras que con temperaturas extremas o niveles altos de enzima se aumentó el porcentaje de partículas pequeñas a causa de una mayor licuefacción. Los trabajos de Buttrose (1962) y de Zeeman et al. (2002) muestran que los gránulos de almidón son estructuras discoidales de 1 a 2µm de diámetro y con un grosor de 0,5µm los cuales están conformados por anillos de crecimiento que separan una región amorfa de una cristalina, las cuales a su vez están formadas por cadenas de amilosa y amilopectina. Estas cadenas presentan regiones hidrofilicas e hidrofóbicas en toda su superficie, y el papel del agua en el mantenimiento de su estructura esta bien establecido (Topgaard y Soderman, 2002). Sin embargo, bajo condiciones de alta hidratación (47%) se ha encontrado que la temperatura y el agua pueden alterar el comportamiento armónico de las moléculas y producir un reblandecimiento de las mismas (Di Bari et al., 2001) que puede ser el responsable de los cambios en la magnitud de la licuefacción antes mencionada.

Svihus et al. (1997) evaluaron el efecto del humedecimiento y la adición de enzimas en la digestibilidad del alimento en aves, y mostraron que el alimento tratado con agua tenía entre 3 y 27% de partículas mayores a 2,38mm. Este incremento del tamaño de partículas resultó de una mayor aglutinación del almidón ocasionada durante el fenómeno de retrogradación. Este fenómeno ocurre después de la gelatinización del almidón y consiste en la formación de hélices dobles con las cadenas externas de la amilopectina, los cuales se adhieren fuertemente y forman cristales (Yao et al., 2002). Estos autores demostraron que el fenómeno de retrogradación aumenta con el tiempo de almacenamiento del grano, por lo que el dejar secar el grano que ha sido tratado con agua fría durante mucho tiempo podría aumentar en mayor proporción la cristalización que con su pronta utilización.

Experimento 2

El efecto del molido en la digestión ha sido observado en otros trabajos y se debe a que el procesamiento físico del grano y su efecto en el tamaño de partícula influyen en la tasa y extensión de la digestión (Yu et al., 1998). En estudios con ganado lechero, Yang et al., (2001) observaron que el molido del maíz incrementó la digestión de la materia seca en comparación con el grano quebrado de maíz. Resultados similares fueron reportados por Dhiman et al. (2002) quienes observaron que con un molido fino se incrementó la digestión ruminal (3%) y se redujo la excreción fecal de almidón (36%).

El grano entero sin procesar reduce la actividad fermentativa de los microorganismos ruminales, lo cual se refleja en condiciones de pH menos ácidas. Murphy et al. (1994) reportaron resultados similares cuando evaluaron el efecto del procesado del grano en becerros, encontrando que el pH esta inversamente relacionado con la concentración de ácidos grasos volátiles y que los animales alimentados con grano hojueleado tenían un pH menor que con grano entero desde 2 hasta 9 horas después de comer. McAllister et al. (1993) encontraron resultados similares al comparar la digestibilidad del almidón de maíz y de cebada en partículas de 0,89 vs 3mm, detectando una interacción en la velocidad de degradación entre el tipo de grano y el tamaño de partícula; también observaron que la digestión a las 24 horas no fue afectada al igual que se encontró en este estudio. Se ha demostrado que los principales cambios en la digestión ruminal del almidón se dan entre las primeras 12 horas de fermentación y que posteriormente no se detectan diferencias significativas ya que se considera un tiempo demasiado prolongado de permanencia en el rumen (Mendoza et al., 2000).

Se ha demostrado que las enzimas exógenas del B. licheniformis y A. Níger incrementan la digestibilidad ruminal in vitro de los granos y que constituyen una alternativa potencial para la alimentación de rumiantes (Gutiérrez, 2000; Meda, 2001). Los resultados de este estudio confirman dichas observaciones y muestran que las enzimas tienen actividad en las primeras 12 horas de incubación. La falta de actividad de las enzimas a partir de las 24 horas puede ser parcialmente explicada por la degradación de la enzima en el rumen, con un tiempo medio de degradación de 6 horas. La glucosilación de las enzimas exógenas reduce su degradación incrementando su tiempo de acción, mientras que enzimas no protegidas se degradan rápidamente entre las primeras seis horas de exposición a microorganismos ruminales (Morgavi et al., 2001).

Igarashi et al. (1998) demostraron que las amilasas industriales provenientes de B. licheniformis tienen su mayor actividad enzimática a un pH entre 5 y 6, con una temperatura óptima de 80ºC, y que cuando se reduce la temperatura hasta 55ºC, la actividad se disminuye hasta un 25%, por lo que las condiciones físico-químicas del rumen pueden no ser las óptimas para obtener su mayor eficiencia. Sin embargo, se ha demostrado que las amilasas exógenas incrementan la digestión in vitro del grano de sorgo (Meda, 2001) y del almidón en el rumen in vivo (Rojo, 2001).

Los estudios de Theurer et al. (1999) muestran que los animales alimentados con granos con altas velocidades de degradación tienen un mejor comportamiento que los alimentados con granos de lenta velocidad de degradación. Los resultados obtenidos en este trabajo indican que las amilasas exógenas incrementan la digestibilidad inicial entre un 3 y un 6% (Tabla II), por lo que pueden ser útiles al interactuar con las enzimas sintetizadas por los microorganismos ruminales. Como resultado de los cambios en la digestibilidad in vitro de la muestra se observaron cambios en el pH final (Tabla II), que solo se manifestaron durante las primeras seis horas. La adición de urea al líquido ruminal se hizo para que la degradabilidad ruminal de los carbohidratos no estuviera limitada por nitrógeno amoniacal y se pudieran expresar los efectos de las enzimas. Griswold et al. (2003) mostraron que la adición de urea a un líquido ruminal con una baja cantidad de proteína degradable pueden incrementar hasta en 10 puntos la digestibilidad in vitro de la MS.

Con relación a la temperatura del agua, Zinn et al. (2002) mostraron que el tratamiento con vapor al momento de hojuelear el grano incrementa la energía metabolizable, asociada con una mayor digestibilidad del almidón. Sin embargo, cuando la aplicación de calor se hace en otros procesos del grano, tiene un efecto menor. Otros investigadores (Cooper et al., 2002) han demostrado que cuando el rolado es en seco, la digestibilidad es menor a la del proceso de hojueleado con vapor. En ambos experimentos del presente trabajo se observó que tanto las altas como las bajas temperaturas deprimieron la digestibilidad (Tabla II), lo cual pudo deberse al fenómeno de gelatinización y retrogradación que sufrieron los granos al ser hidratados y deshidratados. La baja temperatura del agua reduce el grado de gelatinización que alcanza la muestra, debido fundamentalmente a que la energía requerida para alcanzar la temperatura de gelatinización es mayor y eso reduce la cantidad de agua que puede penetrar dentro de los gránulos de almidón. Zinn et al. (2002) mencionan que a 62ºC la cantidad de agua que penetra dentro del gránulo no excede 33% mientras que cuando la temperatura aumenta a 72ºC la humedad puede alcanzar 91%. Es probable que en este estudio, en el tratamiento con agua fría la gelatinización haya ocurrido únicamente cuando la muestra fue secada en la estufa. Por el contrario, cuando se agregó agua a 80ºC, la gelatinización fue mayor que a 40ºC. Sin embargo, debido a que no existió un proceso de aplastado paralelo a la adición del agua (similar al hojueleado o rolado) la digestibilidad fue menor. Huntington, (1997) mencionó que el aumento de la digestibilidad en los granos procesados se debe al aumento de la oportunidad que tienen las bacterias para adherirse a los gránulos de almidón a causa de la ruptura del pericarpio, por lo que la mayor gelatinización se tradujo en una mayor cristalización de la muestra.

Conclusiones

La adición de enzimas amilolíticas y la temperatura de la solución en el tratamiento de granos interactúan para modificar el tamaño, el porcentaje de distribución de las partículas y la digestibilidad in vitro de la MS del sorgo, sin modificar la digestibilidad potencial del mismo.

El porcentaje de partículas aglutinadas de tamaños menores a 0,85mm se incrementó al aumentar la dosis de enzima y la temperatura de la solución.

El grano molido mostró un incremento en la digestibilidad con relación al aglutinado.

Al incrementar la dosis de enzima, aumentó la digestibilidad durante las primeras 12 horas de incubación.

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