EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA DE SUELOS CONTAMINADOS CON PETRÓLEOS NUEVO E INTEMPERIZADO MEDIANTE ENSAYOS CON LEGUMINOSAS

 

María del Carmen Rivera-Cruz, Antonio Trujillo-Narcía, Martha Aurora Miranda de la Cruz y Eduardo Maldonado Chávez

 

María del Carmen Rivera-Cruz. Ingeniero Agrónomo, Colegio Superior de Agricultura Tropical (CSAT), Cárdenas, Tabasco, México. Maestría y Doctorado en Ciencias en Edafología, Colegio de Postgraduados, Montecillo, México. Profesor Investigador, Colegio de Postgraduados, Campus Tabasco, México. Dirección: Periférico Carlos A. Molina s/n km. 3.5, H. Cárdenas, Tabasco, México. e-mail: mariari@colpos.mx

Antonio Trujillo-Narcía. Ingeniero Agrónomo, CSAT, México. Maestría en Ciencias en Edafología, Colegio de Postgraduados, Montecillo, México. Estudiante de Doctorado en Ecología y Desarrollo Sustentable, El Colegio de la Frontera Sur, Unidad Villahermosa, Tabasco, México.

Martha Aurora Miranda de la Cruz. Estudiante de Ingeniería Química Petrolera. Universidad Popular de la Chontalpa. H. Cárdenas, Tabasco, México.

Eduardo Maldonado Chávez. Biólogo, Universidad Autónoma de Colima, México. Estudiante de Maestría en Producción Agroalimentaria en el Trópico, Colegio de Postgraduados, Campus Tabasco, México.

Resumen

Los estudios toxicológicos permiten identificar las especies vegetales más sensibles a concentraciones bajas de contaminantes en el suelo. Las leguminosas son plantas con órganos y respuesta fisiológica sensibles a concentraciones bajas de petróleo en el suelo. El objetivo del presente estudio fue evaluar y explicar la respuesta en crecimiento, biomasa total, número de nódulos y en ausencia/ presencia de leghemoglobina en los nódulos de cuatro leguminosas a diferentes concentraciones de petróleos nuevo (recién extraído) o intemperizado (expuesto al ambiente por más de 20 años). Se realizaron dos ensayos de fitotoxicidad en invernadero. El primero con plantas de chipilín silvestre (Crotalaria sp) durante 120d con arreglo factorial 1×5 y diseño al azar con cuatro repeticiones por tratamiento, con concentraciones de petróleo de 150 (suelo testigo), 7500, 25000, 50000 (nuevo) y 79457 (intemperizado) mg·kg^-1 de hidrocarburos totales del petróleo (HTP), base seca. El segundo ensayo fue durante 150d, con dormilona (Mimosa sp), guaje (Leucaena sp) y zarza (Mimosa pigra) en un arreglo factorial 3×5 en un diseño al azar con cuatro repeticiones, y concentraciones de 150, 50000, 79457, 100000 y 150000 mg·kg^-1 de HTP, base seca. Hubo diferencias estadísticas significativas en todas las variables evaluadas, que se asociaron negativamente con la presencia de petróleo en el suelo. Chipilín silvestre fue la planta más sensible a la exposición al petróleo y evidenció mejor su fitotoxicidad, por lo que podría ser utilizada como especie fitoindicadora de suelos contaminados con petróleo. El número de nódulos con leghemoglobina fue el indicador más sensible para medir el efecto fitotóxico del petróleo.

Summary

Toxicological studies enable to identify those plants with the highest sensibility to low concentrations of soil pollutants. Leguminous plants have extremely sensible organs and physiological responses to low concentrations of oil in the soil. The object of this study was to assess and explain the response in terms of growth, total biomass, number of nodules and presence/absence of leghaemoglobin in the nodules of four different leguminous plants at four different concentrations of oil under two conditions: new oil, recently extracted, or weathered oil, exposed to the environment for >20 years. Two phytotoxicity assays were carried out under greenhouse conditions. The first involved «wild chipilín» plants (Crotalaria sp) for 120 days with a 1×5 factorial arrangement and a random design with four replicates per treatment, testing oil concentrations (in mg·kg^-1 of total petroleum hydrocarbons (TPH), dry weight) of 150 (control soil), 7500, 25000, 50000 (new oil) and 79457 (weathered oil). The second assay lasted 150 days, testing plants of "dormilona» (Mimosa sp), «guaje» (Leucaena sp) and «zarza» (Mimosa pigra), in a 3×5 factorial arrangement, at random with four replicates. The concentrations tested were 150, 50000, 79457, 100000 and 150000 mg·kg^-1 TPH, dry weight. Statistically significant differences were found in all variables, being negatively associated to the presence of oil in soil. Wild chipilín was the most sensitive species to oil exposure, better showing its phytotoxicity, so that it could be used as a phytoindicative species of oil-polluted soil. The number of nodules containing leghaemoglobin was the most sensitive indicator of oil’s phytotoxic effect.

Resumo

Os estudos toxicológicos permitem identificar as espécies vegetais mais sensíveis a concentrações baixas de contaminantes no solo. As leguminosas são plantas com órgãos e resposta fisiológica; sensíveis a concentrações baixas de petróleo no solo. O objetivo do presente estudo foi avaliar e explicar a resposta em crescimento, biomassa total, número de nódulos e na ausência/ presença de leghemoglobina nos nódulos de quatro leguminosas a diferentes concentrações de petróleo novo (recém extraído) ou intemperizado (exposto ao ambiente por mais de 20 anos). Realizaram-se dois ensaios de fitotoxicidade em invernadeiro. O primeiro com plantas de "guizo-de-cascavel" ou "xiquexique" (Crotalaria sp) durante 120 dias com arranjo fatorial 1×5 e desenho ao acaso com quatro repetições por tratamento, com concentrações de petróleo de 150 (só testemunha), 7.500, 25.000, 50.000 (novo) e 79.457 (intemperizado) mg·kg^-1 de hidrocarbonetos totais do petróleo (HTP), base seca. O segundo ensaio foi durante 150 dias, com Jurema de Imbira (Mimosa sp), leucena (Leucaena sp) e "malícia-de-boi" ou "Jiquiri Grande" (Mimosa pigra) num arranjo fatorial 3×5 em um desenho ao acaso com quatro repetições, e concentrações de 150, 50.000, 79.457, 100.000 e 150.000 mg·kg^-1 de HTP, base seca. Houve diferenças estatísticas significativas em todas as variáveis avaliadas, que se associaram negativamente com a presença de petróleo no solo. «Guizo-de-cascavel» ou «xiquexique» foi a planta mais sensível à exposição ao petróleo e evidenciou melhor sua fitotoxicidade, pelo que poderia ser utilizada como espécie fitoindicadora de solos contaminados com petróleo. O número de nódulos com leghemoglobina foi o indicador mais sensível para medir o efeito fitotóxico do petróleo.

PALABRAS CLAVE / Crotalaria / Hidrocarburos/ Leghemoglobina / Leucaena / Mimosa / Nodulación /

Recibido: 10/11/2004. Modificado: 27/04/2005. Aceptado: 29/04/2005.

 

Los derrames de petróleo originan la acumulación de hidrocarburos en el suelo. Los derrames pueden ocurrir por rompimiento de oleoductos, accidentes de vehículos que transportan petróleo en tanques en las carreteras, por derrames de petróleo de los tanques de almacenamiento o por daños a los oleoductos durante el uso de maquinaria en áreas agrícolas (Chaîneau et al., 2003; Rivera-Esparza y Dendooven, 2004). En las regiones tropicales del sureste de México la contaminación del suelo es originada por derrames de desechos de hidrocarburos del petróleo de las presas o fosas de los pozos petroleros, por filtración de agua aceitosa a través de los bordos y fondos de las presas, por desbordamiento de las presas de los pozos petroleros y por rotura de los oleoductos, todo lo cual aumenta debido a la corrosión de los oleoductos y a la dispersión a través de los escurrimientos superficiales del agua de la lluvia (Trujillo et al., 1995; Rivera-Cruz, 2004). El petróleo produce daños en las plantas por el potencial tóxico de los hidrocarburos (Pothuluri y Cerniglia, 1994), además el contacto directo con las plantas origina quemaduras y la reducción de la fotosíntesis debido al recubrimiento de las hojas y tallos con petróleo (Freedman, 1995). Proporciones bajas de petróleo en el suelo estimulan el crecimiento de plantas de algodón (Plice, 1948) porque aumenta el contenido de carbono. La exposición a concentraciones altas de petróleo (Ortiz, 2001; Rivera-Cruz y Trujillo-Narcía, 2004) inhibe el crecimiento vegetativo y reduce la biomasa vegetal de pastos (Echinochloa polystachya y Brachiaria mutica) y de ciperáceas (Cyperus spp). El petróleo en el suelo puede eliminar la vegetación debido a sus propiedades fitotóxicas (Wetzel y Werner, 1995; Chaîneau et al., 1997, 2000), aunque la intensidad del daño depende del tipo de petróleo.

El petróleo ligero es más tóxico que los petróleos mediano y pesado, debido a que tiene grandes cantidades de hidrocarburos saturados y contenidos bajos de compuestos polares (Dorn et al., 1998). Estudios previos con la prueba LC50 identificaron que las leguminosas son más sensibles que las gramíneas y ciperáceas a la exposición al petróleo y tienen los índices más altos de fitotoxicidad por efecto de la toxicidad aguda (Rivera-Cruz y Trujillo-Narcía, 2004). En el presente estudio se propone que las leguminosas pueden ser utilizadas como bioindicadoras de la contaminación del suelo causada por derrames de petróleos nuevo, aquel recién extraído de un yacimiento a través de un pozo petrolero, o por petróleo intemperizado, aquel expuesto a las condiciones ambientales en la superficie del suelo al menos durante 20 años, y que también pueden utilizarse para la evaluación de la eficiencia de la descontaminación final de suelos de acuerdo con la normativa ambiental mexicana (Diario Oficial, 2004). Los objetivos fueron: a) evaluar y explicar el efecto de diferentes concentraciones de petróleos nuevo e intemperizado en el crecimiento, en la biomasa total, en el número de nódulos y en la presencia/ausencia de leghemoglobina del nódulo; b) encontrar especies fitoindicadoras de la toxicidad del petróleo en el suelo; y c) identificar las variables más sensibles de la planta a la toxicidad del petróleo en el suelo.

Materiales y Métodos

Se efectuaron tres actividades secuenciales: i) Trabajo de campo en dos áreas, una con suelo con concentración baja de petróleo (150mg·kg^-1 de HTP) y posiblemente biogénico (Área 1), y la otra con suelo severamente contaminado con petróleo mediano por derrame crónico de petróleo por roturas de oleoductos al menos durante los últimos 20 años (Área 2). Se utilizó muestreo al azar para la colecta de muestras simples de suelo de acuerdo con la normativa oficial mexicana (Diario Oficial, 2004). Se colectaron cinco muestras simples del horizonte superficial (0,0-0,30m de profundidad) del suelo en las dos áreas. Se efectuó la colecta de semillas de leguminosas herbáceas y arbustivas localizadas en el Área 2 y en sitios aledaños a ésta. ii) Análisis de las propiedades físicas y químicas de los suelos, y cuantificación de los hidrocarburos totales del petróleo (HTP) de los suelos. iii) Ensayos de fitotoxicidad de los petróleos nuevo e intemperizado en plantas de cuatro leguminosas (Figura 1).

Trabajo de campo

El estudio se realizó en un terreno de 6,25ha de un Gleysol antráquico (ISSS-ISRIC-FAO, 1998) localizado en las coordenadas 18º04'54"N y 94º02'31"O, en el ejido José N. Rovirosa, municipio de Huimanguillo, estado de Tabasco, México. El clima es cálido húmedo con abundantes lluvias en Verano, con 2240mm de precipitación anual y 25,8ºC de temperatura media anual (INEGI, 2001). El uso del suelo en el Área 1 es cultivo de pasto para la ganadería bovina, la especie dominante es el pasto alemán (Echinochloa polystachya) con 95% de cobertura, y no se encontraron leguminosas. El Área 2 tiene mayor diversidad vegetal, las especies tulillo (Cyperus articulatus), espadaño (Typha sp.) y cebollín (Cyperus sp.) son dominantes con 20, 30 y 40% de cobertura, respectivamente. La leguminosa zarza (Mimosa pigra) tiene una cobertura de 2%. Se realizó la colecta de suelo superficial (0,0-0,30m de profundidad) en las dos áreas. El suelo para el análisis de los HTP se colectó con barrena tipo auger de acero inoxidable, se colectaron muestras simples y se introdujeron las muestras en frascos nuevos de vidrio de 0,25 litros de capacidad. Las muestras se preservaron a 4ºC, de acuerdo con la normativa oficial mexicana (Diario Oficial, 2002a). El suelo empleado para los ensayos de fitotoxicidad se colectó con pala recta en cada sitio y se introdujo en recipientes metálicos. La colecta de semillas maduras de la zarza (Mimosa pigra) se realizó de arbustos localizados en el área 2, también se colectaron en áreas aledañas con suelos no contaminados semillas maduras de las leguminosas chipilín silvestre (Crotalaria sp.), dormilona (Mimosa sp.) y guaje (Leucaena sp.).

Análisis físico y químico

Se determinaron 12 propiedades físicas y químicas del suelo (Tabla I). Los métodos analíticos que se reportan en la tabla son los indicados en la norma oficial mexicana NOM-021-RECNAT-2000 (Diario Oficial, 2002b). La concentración del petróleo (cuantificado como HTP) se determinó con el método analítico EPA 418.1 (EPA, 1986), encontrándose que el suelo del Área 1 tiene 150mg·kg^-1 y el suelo del Área 2 tiene 79457mg·kg^-1 en base seca. El suelo del Área 2 está contaminado con HTP, rebasa las concentraciones máximas permisibles para los suelos con usos agrícola (1000mg·kg^-1 HTP), de conservación (1000mg·kg^-1 HTP) y para uso industrial (3000mg·kg^-1 HTP) según la normativa ambiental mexicana vigente (Diario Oficial, 2002a).

Ensayos de fitotoxicidad del petróleo

De junio a diciembre del 2003 se realizaron en invernadero dos ensayos de fitotoxicidad en instalaciones del Campus Tabasco del Colegio de Postgraduados, localizado en H. Cárdenas, Tabasco, México. Los ensayos se llevaron a cabo con las semillas recolectadas de las cuatro leguminosas, las cuales se establecieron en suelo secado bajo sombra, molido y tamizado en malla de 0,5cm de abertura. Las semillas de Leucaena fueron escarificadas con agua caliente, durante 15min a 50ºC, mientras que las semillas de las otras tres especies no requirieron escarificación para inducir la germinación. Las semillas se sembraron a 1,0cm de profundidad en el suelo testigo y la humedad se mantuvo a capacidad de campo (30%). Los ensayos se realizaron con plántulas de un mes de edad. El ensayo 1 se realizó durante 120d con plantas de la leguminosa chipilín silvestre, utilizando un arreglo factorial 1×5 en un diseño al azar con cuatro repeticiones por tratamiento; se evaluaron las concentraciones 150 (suelo testigo), 7500, 25000 y 50000mg·kg^-1 HTP de petróleo nuevo y 79457mg·kg^-1 HTP de petróleo intemperizado, en base seca. Se utilizó solamente esta concentración de petróleo intemperizado porque existen extensas áreas afectadas por derrames crónicos con esta concentración promedio. El ensayo 2 se realizó durante 150d con plantas de las leguminosas dormilona (Mimosa sp.), guaje (Leucaena sp.) y zarza (Mimosa pigra). Se aplicó un arreglo factorial 3×5 y un diseño completamente al azar con cuatro repeticiones por tratamiento. Se ensayaron las concentraciones de 150 (suelo testigo), 50000, 100000 y 150000mg·kg^-1 HTP de petróleo nuevo y 79457mg·kg^-1 HTP de petróleo intemperizado, en base seca. Las concentraciones de petróleo nuevo en los dos ensayos se prepararon con suelo testigo (150mg·kg^-1 HTP) y las concentraciones se calcularon en base seca relación peso-peso. El petróleo nuevo se diluyó en diclorometano (Merck) que se adicionó en el suelo en relación de volumen 1:1 y se mezcló hasta lograr homogeneidad, dejando pasar posteriormente 24 horas para permitir la volatilización del diclorometano.

El procedimiento de dilución utilizado se realizó de acuerdo con el protocolo Nº 208 de la Organización para la Cooperación y Desarrollo Económico (OECD, 1984), que se refiere a pruebas de toxicidad aguda en plantas. Se utilizaron recipientes de vidrio ámbar con capacidad de 1,8 litros y cada recipiente fue una unidad experimental. Se trasplantaron en cada recipiente dos plántulas de 8cm de altura, 15d después se eliminó una y quedó una plántula en cada unidad experimental. Se aplicó riego cada 24h y la humedad se mantuvo a capacidad de campo (30%). Las variables evaluadas fueron crecimiento vegetativo (altura) medida cada 30d; biomasa seca total (secada en estufa a 70ºC durante 48h), número de nódulos y la presencia/ausencia de leghemoglobina en los nódulos. Estas tres variables se midieron a los 120d en chipilín silvestre, que tiene un ciclo vegetativo más corto, y a los 150d en dormilona, guaje y zarza. La cosecha de la biomasa y el estudio de los nódulos se realizó el 9 de diciembre del 2003. La presencia de nódulos viables (con leghemoglobina) se determinó de manera visual (presencia de color marrón-rojizo) según Weaver y Frederick (1982).

Análisis estadístico

Se aplicó el procedimiento GLM para el análisis estadístico y se utilizó la prueba de Tukey para determinar diferencias estadísticas de las medias de los tratamientos (p<0,05). Asimismo se aplicó análisis de correlación (SAS, 1989).

Índices de fitotoxicidad

El índice de fitotoxicidad representa la respuesta de la planta a la exposición al petróleo presente en el suelo. El método para el cálculo de los índices relativo de fitotoxicidad (IRF) y absoluto de fitotoxicidad (IAF) ha sido reportado por Rivera-Cruz y Trujillo-Narcía (2004). Los IRF y los IAF más grandes representan mayor efecto fitotóxico, los más pequeños significan menor efecto fitotóxico.

Resultados y Discusión

Crecimiento vegetativo

El crecimiento vegetativo de las cuatro leguminosas mostró diferencias estadísticas significativas (p<0,05) entre las medias de los tratamientos (Tabla II). La altura de la planta fue severamente afectada por las tres concentraciones más altas de los petróleos intemperizado (79457mg·kg^-1 HTP) y nuevo (100000 y 150000mg·kg^-1 de HTP). La mayor reducción en la altura se presentó en las leguminosas dormilona y zarza, donde las plantas no lograron sobrevivir al efecto de la concentración más alta de petróleo (150000mg·kg^-1 HTP; Tabla II); en cambio la planta de guaje (Leucaena sp.) fue menos sensible a la exposición de la concentración más alta de petróleo nuevo, ya que sobrevivió a su efecto y creció un poco al pasar de 8cm de altura al momento inicial a 13cm después de 120d de exposición.

El chipilín silvestre fue expuesto por menos tiempo (120d) que las otras tres especies (150d) porque tiene un ciclo vegetativo más corto. También presenta la misma respuesta aún bajo la menor concentración de petróleo y fue la especie más sensible al petróleo en el suelo. El patrón de crecimiento de las cuatro leguminosas en suelo testigo fue de tipo sigmoidal (Salisbury y Ross, 2000) con pendiente acentuada (Figura 2). Aunque con menor pendiente, igual respuesta evidenció el tratamiento con 50000mg·kg^-1 HTP en guaje y zarza, lo que sugiere que poseen mecanismos de adaptación para condiciones de suelos contaminados con petróleo. La planta de chipilín silvestre (Figura 2d) redujo su crecimiento seis veces por efecto de 7500mg·kg^-1 HTP, el daño fue absoluto por el efecto de la concentración 50000mg·kg^-1 HTP, que eliminó la planta. Hernández (1997) encontró que las plantas de frijol negro (Phaseolus vulgaris) son susceptibles al queroseno y su desarrollo fue afectado a medida que aumentó la concentración de queroseno. Esta respuesta fitotóxica fue similar a la obtenida en los ensayos con pastos (Brachiaria mutica y Echinochloa polystachya) y con dos ciperáceas (Cyperus spp.) realizados por Rivera-Cruz y Trujillo-Narcía (2004) hasta con 150000mg·kg^-1 HTP.

Producción de biomasa total

La mayor producción de biomasa seca total en las cuatro leguminosas se encontró en el suelo testigo (Tabla II). Las medias de los tratamientos tuvieron diferencias estadísticas significativas (p<0,05). La especie más sensible fue el chipilín silvestre que disminuyó 6 veces la producción de biomasa por el efecto de 7500mg·kg^-1 HTP. Las dos especies más tolerantes fueron las leguminosas guaje y zarza donde la concentración 50000mg·kg^-1 HTP redujo la biomasa total en 31 y 25%, respectivamente. El efecto fue directamente proporcional con el aumento de la concentración de petróleo. Debido a la mayor sensibilidad de la planta de chipilín silvestre, cuya biomasa disminuyó en concentraciones de 7500mg·kg^-1 HTP de petróleo crudo, ésta puede ser utilizada como especie indicadora de concentraciones bajas de hidrocarburos en el suelo. La producción de biomasa de plantas de frijol negro (Phaseolus vulgaris) también disminuyó significativamente con el incremento de un complejo de hidrocarburos (Hernández, 1997).

Nodulación

El número de nódulos tuvo diferencias estadísticas (p<0,05) por el efecto del petróleo. La nodulación fue inhibida en las cuatro leguminosas, la disminución del número de los nódulos aumentó con la mayor concentración de petróleo (Tabla II). La especie más sensible fue el chipilín silvestre, que no formó nódulos cuando fue expuesta a 500000mg·kg^-1 HTP. El guaje fue la especie más tolerante a la exposición del petróleo, ya que formó nódulos en concentraciones altas de petróleo nuevo (100000mg·kg^-1 HTP) e intemperizado (79457mg·kg^-1 HTP). La zarza, aunque tuvo menor infección de rizobios, también fue tolerante al petróleo y la reducción de los nódulos fue menos acentuada que en las otras tres leguminosas. Se ha reportado (Alexander, 1994; Atlas y Bartha, 2002) que bajo condiciones favorables en el suelo la bacteria Rhizobium puede invadir los pelos radicales, que sufren una deformación o enroscamiento bajo la influencia de algunos productos bacterianos. De esta manera puede iniciar la formación de nódulos y desarrolla la actividad fijadora de nitrógeno a través de los bacteroides de Rhizobium (Conn et al., 2002). Las células de los nódulos donde residen los bacteroides contienen un pigmento llamado leghemoglobina, que se une reversiblemente al oxígeno. La leghemoglobina oxigenada transporta el oxígeno en condiciones de baja tensión de oxígeno libre a los sitios de fosforilación oxidativa en el bacteroide, donde se utiliza durante la producción de ATP (Conn et al., 2002).

Las condiciones del suelo tienen un efecto marcado sobre los rizobios, pudiendo afectar tanto la supervivencia como la capacidad de infección de los pelos radicales (Alexander, 1994). Algunos rizobios son sensibles a pH bajo y no pueden establecer infecciones en suelos ácidos. Esta restricción no influyó en la formación de nódulos de las cuatro leguminosas en el suelo sin petróleo a pesar de que el pH es fuertemente ácido y que el contenido de nitrato es bajo (Tabla I). Suominen et al. (2000) también identificaron la misma respuesta en suelos contaminados con benceno, tolueno y xileno, y encontraron que concentraciones mayores de 500ppm de m-toluato en el suelo bloquean la formación de nódulos en la leguminosa Galega orientalis. Experimentos efectuados por Wetzel y Werner (1995) con plantas de alfalfa (Medicago sativa), revelan que los hidrocarburos aromáticos policíclicos reducen la nodulación antes de que ocurran daños visibles en la planta, y afectan la vitalidad del macrosimbionte y del microsimbionte. Adam y Duncan (2003) realizaron estudios de fitorremediación con plantas de Vicia sativa en suelo contaminado con diesel; el número de nódulos por planta fue significativamente reducido en suelo contaminado con diesel, pero los nódulos fueron más grandes y desarrollados que los correspondientes a las plantas en suelos sin diesel. Hernández (1997) encontró que el queroseno reduce el número de nódulos de plantas de frijol negro (Phaseolus vulgaris), e identificó que a los 55 días después de la siembra la concentración de 2500mg·kg^-1 de queroseno originó una reducción de 10 veces en el número de nódulos respecto a las plantas establecidas en suelo testigo. Las plantas presentaron un estado similar al estrés hídrico que originó la formación de pocos nódulos, la toxicidad y la inducción de un estado de hidrofobia en las raíces origina efectos similares a los del estrés hídrico. A los 91 días después de la siembra no hubo nodulación en los diferentes tratamientos porque las plantas se encontraban en la fase de senescencia. Los resultados de Hernández (1997) difieren con los de las cuatro leguminosas ya que todos los tratamientos sin petróleo formaron numerosos nódulos (Tabla II) a pesar que habían fructificado. Este resultado es positivo porque aumenta el periodo de fijación biológica de nitrógeno.

Leghemoglobina

Las células de los nódulos donde residen los bacteroides contienen un pigmento llamado leghemoglobina, que se une reversiblemente al oxígeno. La leghemoglobina oxigenada transporta el oxígeno en condiciones de baja tensión de oxígeno libre a los sitios de fosforilación oxidativa en el bacteroide, donde se utiliza durante la producción de ATP (Conn et al., 2002). Los nódulos sanos en las leguminosas tienen color marrón-rojizo debido a la presencia de iones de hierro y molibdeno en la leghemoglobina, que es una molécula presente en gran abundancia en el tejido central de todos los nódulos fijadores de nitrógeno (Madigan et al., 1999; Atlas y Bartha, 2002). La exposición de la planta al suelo con petróleo produjo daños cualitativos y cuantitativos en los nódulos de las cuatro leguminosas, con diferencias estadísticas significativas (p<0,05). Con excepción del suelo no contaminado (testigo), el petróleo en el suelo redujo el tamaño de los nódulos y también la presencia de la leghemoglobina en el nódulo (Tabla II). Todos los nódulos de las leguminosas chipilín silvestre, dormilona y zarza establecidos en suelo no contaminado tuvieron leghemoglobina, fueron sanos y con capacidad para realizar el proceso de nitrificación; en cambio en el guaje (Leucaena sp.) el número de nódulos sanos con leghemoglobina disminuyó en 34% (116 a 77 nódulos). El efecto del petróleo en el nódulo fue drástico por el aumento de la concentración. Los nódulos localizados en los pelos radicales de la leguminosa zarza establecida en suelo con 50000mg·kg^-1 HTP (Tabla II) fueron afectados por el petróleo, ninguno tuvo el color rojo-marrón típico de un nódulo sano; el interior del nódulo fue color blanco, lo que indica la ausencia de iones de hierro. Las concentraciones mayores de petróleo nuevo (100000 y 150000mg·kg^-1) y de petróleo intemperizado (79457mg·kg^-1 HTP) originaron daños más severos en el nódulo. Tampoco se encontró el color rojo-marrón en el interior del nódulo, ocurrió disminución del tamaño del nódulo hasta cinco veces respecto al tamaño del nódulo en suelo sin petróleo; la diferenciación morfológica del nódulo fue inhibida y todos los nódulos evidenciaron fuertes daños necróticos.

Índices relativos y absolutos de fitotoxicidad

La nodulación fue la variable más afectada por el petróleo en las cuatro leguminosas tras la exposición durante 120 y 150 días (Tabla II). Los índices relativos de fitotoxicidad de chipilín silvestre (Figura 3a) y de dormilona y zarza (Figura 3c) fueron mayores en los tres suelos más contaminados con petróleo nuevo (50000, 100000 y 150000mg·kg^-1 HTP), mientras que en el suelo con petróleo intemperizado (79457mg·kg^-1 HTP), la nodulación fue completamente inhibida. Estos resultados confirman que la formación de nódulos puede ser un indicador confiable utilizado en la evaluación ecotoxicológica de suelos contaminados (Wetzel y Werner, 1995). Los índices absolutos de fitotoxicidad de las cuatro leguminosas (Figuras 3b y d) muestran que el efecto del petróleo en el crecimiento y en la formación de la biomasa vegetal es directamente proporcional con el incremento de la concentración de petróleo. El chipilín silvestre fue la especie más sensible, ya que las concentraciones de 50000mg·kg^-1 de petróleo nuevo y 79457mg·kg^-1 de petróleo intemperizado inhibieron el crecimiento vegetativo y consecuentemente la formación de biomasa (Figura 3b). Las leguminosas dormilona, guaje y zarza fueron más tolerantes al petróleo; la inhibición del crecimiento y de la acumulación de biomasa fue mayor por el efecto de la exposición de 150000mg·kg^-1 de petróleo nuevo. La inhibición absoluta del crecimiento, de la formación de tejido y de la nodulación ocurrió en las cuatro leguminosas, dado que no sobrevivieron las plantas al efecto del petróleo. La muerte de la planta no permitió el cálculo de ambos índices y el valor calculado se reporta en la Figura 3 con el símbolo a.

 

  Conclusiones

1. El crecimiento vegetal, la biomasa, el número de nódulos y la formación de leghemoglobina dentro del nódulo fueron inhibidos por el efecto de los petróleos nuevo e intemperizado en el suelo. Las mayores concentraciones de petróleo produjeron mayores efectos fitotóxicos.

2. La falta de nodulación, la mínima diferenciación morfológica de los nódulos, la necrosis severa de los nódulos y la ausencia de leghemoglobina fueron promovidas por concentraciones ³50000mg·kg^-1 de hidrocarburos totales del petróleo (HTP). Esto no ocurrió en la leguminosa guaje (Leucaena sp.), la cual, aunque disminuyó severamente, fue tolerante a 100000mg·kg^-1 HTP.

3. La leguminosa chipilín silvestre (Crotalaria sp.) fue la especie más sensible a la exposición a concentraciones ³7500mg·kg^-1 HTP y evidenció mejor la fitotoxicidad originada por el petróleo en el suelo, por lo que podría ser utilizada como especie fitoindicadora de suelos contaminados con petróleo.

4. Los indicadores más sensibles para medir el impacto toxicológico del petróleo en el suelo son el número de nódulos y la presencia o ausencia de la leghemoglobina dentro del nódulo.

REFERENCIAS

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