EFECTO DEL EXTRACTO DE TRES PLANTAS SILVESTRES SOBRE LA RIZOCTONIOSIS, LA MANCHA SUREÑA DEL MAÍZ Y LOS PATÓGENOS QUE LAS CAUSAN

Dorian A. Rodríguez y MarÍa E. Sanabria

Dorian A. Rodríguez. Ingeniero Agrónomo, Universidad del Zulia, Venezuela. Ph.D. en Fitopatología, North Dakota State University, EEUU. Profesor, Universidad Centrooccidental Lisandro Alvarado (UCLA), Venezuela. Dirección: UCLA. Postgrado de Fitopatología, Carretera vía Redoma de Agua Viva, Cabudare, Estado Lara. Apartado 400, Barquisimeto. Venezuela. e-mail: rdorian@ucla.edu.ve

María E. Sanabria. Licenciada en Biología y M.Sc. en Botánica, Universidad de Oriente, Venezuela. Profesora, UCLA, Venezuela. e-mail: mesanabria@ucla.edu.ve.

Resumen

Con el objeto de encontrar alternativas seguras de manejo de enfermedades se evaluaron los efectos de extractos etanólicos de Lippia origanoides, Phyllanthus niruri y Heliotropium indicum sobre Rhizoctonia solani y Bipolaris maydis, así como en las enfermedades causadas por ellos en maíz. El extracto obtenido de hojas secas se diluyó en papa-dextrosa-agar en concentraciones de 0 a 10% (v/v) y se vació en placas Petri. Se sembró un disco de cada hongo, se midió la colonia y se calculó el porcentaje de inhibición en relación al testigo (0%). Para la evaluación in vivo se instalaron tres ensayos con maíz: a) inoculación con R. solani y aplicación semanal de los extractos diluidos en agua al 2,5%; a los 18 y 26 días se evaluó el número y longitud de las lesiones; b) aplicación de los extractos 1h antes o después de la inoculación con B. maydis, evaluando las lesiones cada 3 ó 4 días; c) aplicación de los extractos 24h antes o después de inoculación. Se encontraron diferencias significativas (P<0,01) entre las concentraciones utilizadas in vitro. Los extractos de L. origanoides al 1% y P. niruri al 5% ocasionaron inhibiciones del 100% y 90%, respectivamente. Se observó un mayor efecto de P. niruri y L. origanoides en el control de la rizoctoniosis in vivo. En cuanto a la mancha sureña, P. niruri y L. origanoides resultaron mejores al ser aplicados 1h antes de inoculación. Estos resultados indican el potencial de los extractos de estas plantas en el control de ambas enfermedades en el maíz.

Summary

To find safer alternatives to handle plant diseases, ethanolic extracts of Lippia origanoides, Phyllanthus niruri y Heliotropium indicum were evaluated on Rhictozonia solani y Bipolaris maydis as well as on the diseases caused by them on corn. The extract obtained from dry leaves was diluted in potato-dextrose-agar at concentrations from 0 to 10% (v/v) and dispensed into Petri dishes. A mycelial disc of each fungus was placed in the dishes, colony diameter measured and the percentage of inhibition calculated based on the growth of the control (0%). For in vivo evaluation, three tests were established with corn: a) inoculation with R. solani and weekly application of extracts diluted in water at 2.5%; lesion number and length were evaluated 18 and 26 days later; b) application of extracts 1h before or later of innoculation with B. maydis with lesion evaluation every 3 or 4 days; c) application of extracts 24h before or later of inoculation. Significant differences (P<0.01) were found between the concentrations used in the vitro test. L. origanoides (1%) and P. niruri (5%) extracts caused 100% and 90 % inhibitions, resoectively. A major effect of P. niruri and L. origanoides was observed on the control of rhictozonia disease. With regard to southern corn leaf blight P. niruri and L. origanoides performed better when applied 1h before inoculation. These results indicate the potential of the extract of the evaluated plants to control both diseases in corn.

Resumo

Com o objetivo de encontrar alternativas seguras de manipulação de fungicidas avaliaram-se os efeitos de extratos etanólicos de Lippia origanoides, Phyllanthus niruri e Heliotropium indicum sobre Rhizoctonia solani e Bipolaris maydis, assim como nas enfermidades causadas por eles no milho. O extrato obtido de folhas secas se diluiu em batata-dextrose-agar em concentrações de 0 a 10% (v/v) e esvaziou-se em placas de Petri. Plantou-se um disco de cada fungo, mediu-se a colônia e calculou-se a porcentagem de inibição em relação à testemunha (0%). Para a avaliação in vivo instalaram-se três ensaios com milho: a) inoculação de R. solani com aplicação semanal dos extratos diluídos em água a 2,5%; aos 18 e 26 dias avaliou-se o número e longitude das lesões; b) aplicação dos extratos 1h antes ou depois da inoculação com B. maydis, avaliando as lesões cada 3 ou 4 dias; c) aplicação dos extratos 24h antes ou depois de inoculação. Encontraram-se diferenças significativas (P<0,01) entre as concentrações utilizadas in vitro. Os extratos de L. origanoides a 1% e P. niruri a 5% ocasionaram inibições de 100% e 90%, respectivamente. Observou-se um maior efeito de P. niruri e L. origanoides no controle da rizoctoniose in vivo. Quanto à mancha foliar, P.niruri e L. origanoides resultaram melhores ao ser aplicados 1h antes de inoculação. Estes resultados indicam o potencial dos extratos destas plantas no controle de ambas enfermidades no milho.

Palabras Clave / Bipolaris maydis / Control Natural / Maíz / Rhizoctonia solani /

Recibido: 08/07/2005. Modificado: 27/10/2005. Aceptado: 01 /11/2005.

El método de control de patógenos más generalizado en la agricultura, especialmente en la lucha contra las enfermedades fungosas, es el químico. El primer fungicida, descubierto en 1882, se conoció como la "Pasta Bordelesa" (Alexopoulos et al., 1996) y marcó el comienzo del control químico de las enfermedades en plantas. Desde entonces, se han desarrollado numerosos productos con diferentes modos de acción, primero los de contacto y posteriormente, a inicios de los años 70, los sistémicos (Delp, 1988).

Los fungicidas se han convertido en una de las principales herramientas de producción de los agricultores, lo que se refleja en los grandes volúmenes de agroquímicos comercializados a nivel mundial. Los EEUU, por ejemplo, exportó 14400ton de pesticidas entre 1997 y 2000, de los cuales el 57% fue a los países del tercer mundo (Smith, 2001). Las condiciones bajo las cuales se manipulan estos productos en los países en desarrollo son muy precarias e inaceptables en los países industrializados (Dinham y Malik, 2003). Los agricultores frecuentemente se exponen a los pesticidas, ya sea durante la preparación de las mezclas, su aplicación sobre los cultivos, la limpieza de los equipos o el almacenamiento de los productos. Las intoxicaciones o envenenamientos, tanto del productor como de su familia, ocurren porque no se usan guantes ni máscaras, por derrames del producto sobre el cuerpo, debido al mal funcionamiento de las asperjadoras, o por inhalaciones involuntarias, ya sea porque los productos se almacenan en depósitos contiguos a las habitaciones o porque las áreas de cultivo se encuentran cercanas a las casas (UNEP, 2004).

Anualmente ocurren entre 1 y 5 millones de envenenamientos con pesticidas, resultando en la muerte de unas 20000 personas (hombres, mujeres y niños) y se vaticina que cada año 3 millones se intoxicarán y 750000 nuevas personas sufrirán efectos crónicos por exposición a los plaguicidas (Dinham y Malik, 2003). Un ejemplo trágico de este problema ocurrió en 1999 en Tauccamarca, Perú, cuando debido a mal manejo de los químicos, 24 de los 48 niños presentes en la población murieron envenenados al confundirse un insecticida con la leche de la merienda escolar (Rosenthal, 2003). Otro caso lo refleja el estudio de Tagliaferro (2002), realizado en el Valle de Quibor, estado Lara, Venezuela, donde se encontró que el 46% de las mujeres lactantes incluidas en la muestra presentaba residuos de E-hexacloruro de benceno (hexaclorociclohexano), producto que es utilizado como fungicida para el tratamiento de semillas y es considerado como cancerígeno (EPA, 2004), razón por la cual no se usa en los países industrializados, pero si se exporta.

Esta situación ha conducido a entes internacionales a establecer convenios y medidas con el propósito de reducir el problema. Una de estas es el consentimiento fundamentado previo (CFP), también conocido como convenio de Rotterdam, suscrito en 1998 por 73 países y que entró en vigencia en febrero de 2004 (PNUMA, 2004). El mismo establece un sistema de información mediante el cual los países exportadores e importadores pueden intercambiar información acerca de plaguicidas peligrosos. Se basa en que la exportación de un producto químico sujeto al régimen del Convenio puede tener lugar solamente con el consentimiento fundamentado previo de la parte importadora. El CFP se aplica a plaguicidas y productos químicos industriales que han sido prohibidos o rigurosamente restringidos por razones sanitarias o ambientales por las partes y que han sido notificados por éstas para su inclusión en el procedimiento (PNUMA, 2004). Actualmente el convenio incluye 22 plaguicidas y 5 productos industriales, pero el CFP contiene las provisiones para incluir nuevos productos en el futuro.

Otro de los tratados referidos a los plaguicidas es el de los contaminantes orgánicos persistentes, también conocido como POP por sus siglas en inglés, que corresponde a los químicos que no se degradan en el ambiente una vez liberados. Estos productos se pueden acumular en el aire, suelo, agua y en los tejidos de los animales, continuando así en la cadena alimenticia y originando enfermedades, defectos congénitos y daños en el sistema nervioso, tanto en humanos como animales (PNUMA, 2001). El POP fue firmado en mayo de 2001, en Estocolmo, Suecia, y abarca 9 productos, entre los cuales se encuentra el hexacloruro de benceno. Los firmantes acordaron detener la producción y uso de los plaguicidas incluidos en la lista; sin embargo, los países pueden pedir excepciones basados en necesidades específicas, como es el caso del DDT para el control de la malaria (Smith, 2001).

Un tercer documento que intenta servir de apoyo a los gobiernos en las decisiones sobre el manejo de los plaguicidas es el Código Internacional de Conducta para la Distribución y Utilización de Plaguicidas (CICDUP), adoptado por el Consejo de la FAO (FAO, 2003), que establece normas de conducta de carácter voluntario para las entidades públicas y privadas que intervienen en la distribución y utilización de plaguicidas, o tienen relación con las mismas, particularmente en los casos donde no hay una legislación nacional para regular los plaguicidas. El código exhorta a los gobiernos a legislar sobre la materia y a promover alternativas de manejo de plagas menos dañinas al ambiente.

A pesar de los diferentes convenios y códigos de conducta propuestos, la seguridad en el uso de los plaguicidas depende de factores de tipo social, económico, educativo e incluso climático. La cultura del uso de los mismos está tan arraigada en los productores, que en la práctica constituye la primera alternativa utilizada por ellos. Algunos productos requieren de ciertos equipos de protección de alto costo que pueden no estar al alcance del pequeño agricultor. Además, en algunos casos resultan incómodos y calurosos en nuestras zonas tropicales, por lo que los trabajadores del campo deciden no usarlos (UNEP, 2004). Es por eso que se hace necesario evaluar otras alternativas de control que sean menos peligrosas e igualmente efectivas para el manejo de las plagas.

El CICDUP (FAO, 2003) en su Art. 3, aparte 3.9 establece que "los gobiernos, con el apoyo de las organizaciones internacionales y regionales pertinentes, deben alentar y promover la investigación y el desarrollo de alternativas que entrañen riesgos menores: agentes y técnicas de control biológico, plaguicidas que no sean químicos… y entrañen un riesgo reducido para los seres humanos y para el ambiente". Dentro del marco de la recomendación por parte de la FAO, se han realizado investigaciones con el objeto de encontrar, entre las plantas silvestres, algunas cuyos extractos tengan efecto fungicida o fungistático y puedan ser utilizadas como una alternativa en el manejo de enfermedades en los cultivos.

Uno de los trabajos previos es el realizado por Castillo (2004), analizando veinte plantas del Parque Nacional Terepaima, en el estado Lara, Venezuela, en el cual se incluían Phyllanthus niruri, Heliotropium indicum y Lippia origanoides. Este autor determinó la existencia de metabolitos secundarios (MS) en las hojas de dichos vegetales y encontró similitudes en cuanto a la presencia de alcaloides básicos, débilmente básicos, sales cuaternarias de amonio y aceites esenciales. Los flavonoides fueron positivos en P. niruri y L. origanoides, y los taninos y polifenoles en esta última y en H. indicum. A los fenoles se le atribuyen funciones de defensa contra insectos, resistencia a parásitos y regulación de los procesos de crecimiento por interacción con hormonas vegetales, al igual que los alcaloides y terpenoides, de allí la importancia que tienen desde el punto de vista fitoquímico (Marcano y Hasegawa, 2002). La presencia de estos MS en estas y otras especies de plantas representa un potencial para disminuir el uso de agroquímicos que no solo atentan contra la ecología y la salud, sino que también permanecen en el medio por años (Castillo, 2004). En base a los resultados obtenidos por este autor se seleccionaron estas tres plantas para la realización de la presente investigación.

Para evaluar las bondades del extracto de estas plantas se escogieron dos hongos que atacan el maíz: Rhizoctonia solani, patógeno de suelo con importancia en las zonas maiceras de Venezuela (Cardona et al., 1999) y Bipolaris maydis, hongo que ataca el follaje y es un limitante de la producción en diversos países (Carson, 1999; Simmons et al., 2001).

Materiales y Métodos

Obtención de los extractos

Los extractos se prepararon de plantas silvestres recolectadas en estado adulto (con floración) en la época lluviosa. Las especies utilizadas y las respectivas localidades donde se hicieron las recolectas fueron Phyllanthus niruri (Marín, estado Yaracuy, 180msnm), Heliotropium indicum (Tarabana, Cabudare, estado Lara, 450msnm), y Lippia origanoides (Parque Terepaima, Cabudare, estado Lara, 500msnm). Siguiendo el método de Marcano y Hasegawa (2002) se utilizaron las hojas, las cuales se secaron a la sombra, se pulverizaron en una licuadora Oster® y se maceraron 100g de vegetal en 400ml de etanol al 96% durante 1 a 2 semanas. El líquido fue filtrado en 4 capas de gasa y colocado en un Rotavapor Brinkmann®, el alcohol fue separado por destilación, el extracto puro envasado en un frasco ámbar y colocado en refrigeración (8ºC) hasta su uso posterior.

Evaluación del efecto de los extractos sobre el crecimiento micelial

La evaluación de los extractos se realizó utilizando cepas de Rhizoctonia solani AG1-IA (Hernández et al., 2003) y Bipolaris maydis obtenidas de la colección del laboratorio de Micología del Postgrado de Fitopatología de la Universidad Centrooccidental Lisandro Alvarado, Venezuela. Ambos hongos se cultivaron en agar-papa-dextrosa (APD) y se utilizaron en las pruebas con una semana de edad. El extracto puro de las tres plantas fue aplicado al APD inmediatamente después de la esterilización de éste en el autoclave, a las concentraciones (v/v) de 0; 1; 2,5; 5; 7,5 y 10% para los extractos de P. niruri y H. indicum; y de 0; 0,5; y 1% para el de L. origanoides.

El medio con extracto fue dispensado en placas Petri y una vez solidificado se colocó en él un disco de 5mm de diámetro de agar con micelio del hongo, luego se incubó a 26 ±2ºC hasta que la colonia en el testigo (sin extracto) cubrió totalmente la placa. El diámetro de la colonia se midió cada 2 ó 3 días, con lo cual se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial en cada tratamiento en comparación con el testigo. Se usaron 4 repeticiones (placas) por concentración y en cada placa se realizaron 3 mediciones en direcciones diferentes. Se utilizó un diseño completamente aleatorio. Los datos del último día de evaluación del crecimiento micelial fueron sometidos a análisis de varianza y la comparación de medias de tratamientos por el método de Tukey, utilizando el programa Statistix® 8.0 (Analytical Software). Los ensayos fueron repetidos y el análisis se realizó con los datos de la segunda evaluación.

Evaluación del efecto de los extractos vegetales sobre la rizoctoniosis del maíz

El ensayo se instaló en un umbráculo construido con malla metálica blanca, en el que se colocó una cámara húmeda construida con armazón de metal y cubierta de plástico blanco transparente. Se utilizaron granos de maíz híbrido Tocorón, plantados en 12 puntos de siembra en bandejas de plástico (25´32cm), 2 granos por punto, separados por 10cm, para un total de 24 plantas por bandeja. En cada punto de siembra se colocaron 2g de arroz infectado con R. solani, conjuntamente con los granos (Pineda et al., 2005), se tapó con una capa de tierra de 1cm y las bandejas se colocaron en la cámara húmeda. Durante el período del ensayo se midió la temperatura máxima y mínima dentro de la cámara. Los tratamientos aplicados fueron T1: suelo no inoculado, sin aplicación de extracto (testigo); T2: suelo inoculado, sin aplicación de extracto; T3: suelo no inoculado, con aplicación de extracto de H. indicum; T4: suelo inoculado, con aplicación de extracto de H. indicum; T5: suelo no inoculado, con aplicación de extracto de P. niruri; T6: suelo inoculado, con aplicación de extracto de P. niruri; T7: suelo no inoculado, con aplicación de extracto de L. origanoides; T8: suelo inoculado con aplicación de extracto de L. origanoides; T9: suelo inoculado con aplicación de fungicida iprodione.

Se usaron 3 repeticiones (bandejas) por tratamiento, distribuidas al azar en igual número de bloques. Todos los extractos fueron aplicados al 2,5% y el iprodione a 0,75g·l-1 de agua; se aplicaron 167ml de solución por bandeja de ambos productos. Los tratamientos se aplicaron semanalmente durante 4 semanas, utilizando un rociador plástico manual. Dos veces al día se humedeció el aire de la cámara con un humidificador eléctrico Fogmaster® (Fogmaster Corp., Deerfield Beach, Florida, EEUU).

Se llevaron a cabo 3 evaluaciones (una semanal), determinándose el número de lesiones por planta y la longitud de éstas en el tallo. Al final del ensayo, se determinó la materia seca del total de las plantas en cada bandeja. Los datos fueron analizados por el método no paramétrico de Kruskal y Wallis (Steel y Torrie, 1980) y la comparación de medias con a= 0,05, utilizando el programa Statistix® 8.0 (Analytical Software). El ensayo se llevó a cabo dos veces y el análisis estadístico se realizó con los datos de la segunda repetición.

Evaluación del efecto de los extractos vegetales sobre la mancha sureña del maíz

El ensayo se instaló en un cobertizo abierto, con techo de láminas de fibra de vidrio blanco, sin paredes. Se sembraron 2 granos de maíz híbrido Tocorón por maceta de 20cm de diámetro y el ensayo se inició cuando las plantas tenían 4 hojas verdaderas. Los tratamientos utilizados fueron T1: aplicación de extracto de P. niruri 1h pre-inoculación; T2: aplicación de extracto de H. indicum 1h pre-inoculación; T3: aplicación de extracto de L. origanoides 1h pre-inoculación; T4: aplicación de agua 1h pre-inoculación (testigo); T5: aplicación de agua sin inoculación (testigo); T6: aplicación de extracto de P. niruri 1h post-inoculación; T7: aplicación de extracto de H. indicum 1h post-inoculación; T8: aplicación de extracto de L. origanoides 1h post-inoculación; T9: aplicación de agua 1h post-inoculación (testigo).

El hongo se cultivó en APD por 10 días y se obtuvieron los conidios raspando el plato Petri y filtrando a través de 4 capas de gasa estéril. La suspensión de conidios se ajustó a 6,5´103 conidios/ml y se aplicó con un rociador plástico manual a razón de 5ml/planta.

Los extractos de P. niruri y H. indicum se aplicaron al 2,5% y el de L. origanoides al 1,25%, en un volumen de 5ml/planta, utilizando, igualmente, un rociador plástico manual. Se utilizaron 4 macetas (8 plantas) por tratamiento y un diseño completamente al azar. La evaluación se realizó cada 3 ó 4 días, en 6 ocasiones, determinando el número total de hojas, número de hojas infectadas, la severidad de enfermedad en cada hoja infectada y la materia seca al final del ensayo. Se contaron todas las hojas de las plantas, independientemente de si estaban parcial o totalmente muertas. Para la determinación de la severidad se aplicó una modificación de la escala gráfica de James (1971), en la cual se utilizaron los valores de severidad para establecer los siguientes rangos y clases:

Con los valores de las clases, se calculó un indice de infección (Rodríguez et al., 1996) definido por

donde Inf: índice de infección, ni: número de hojas con un mismo valor de clase, ci: valor de la clase en cada hoja, N: número total de hojas de la planta, y C: valor máximo de clase.

Los valores de Inf para cada día de evaluación y de materia seca, se sometieron al análisis de varianza y pruebas de comparación de medias por el método de Tukey, utilizando el programa Statistix® 8.0 (Analytical Software). Así mismo se utilizaron para el cálculo del área bajo la curva (ABC; Shaner y Finney, 1977). Un segundo ensayo se realizó variando el tiempo entre la aplicación de los extractos y la inoculación de 1 a 24h. El resto de las variables y procedimientos fueron similares.

Evaluación del efecto de los extractos vegetales sobre la germinación de conidios de B. maydis sobre hojas de maíz

El ensayo se llevó a cabo en una cámara ambiental Biotronette Mark III®, con 4 tubos fluorescentes Philips TL40W/54RS y 3 lámparas de luz incandescente Philips de 100W, todos a 50cm de altura sobre las plantas, con período de 12h de luz diarias. Se dispuso de temperaturas promedio máxima de 28,6ºC y mínima de 26,6ºC.

Se utilizó un sustrato formado por tierra, arena y cáscara de arroz en proporción 2:1:1 (v/v). Se colocaron 2 granos de maíz cv. Tocorón por matero, y cuando las plantas tenían 4 hojas se procedió a iniciar el ensayo. Se preparó una suspensión de inóculo de B. maydis de 2´104 conidios/ml, de la cual se colocaron gotas sobre las hojas y se esparcieron mediante una varilla de vidrio. Los extractos se aplicaron pulverizando una solución al 5% sobre la hoja en las modalidades de tratamiento siguientes: 1) aplicación del extracto 1h antes de la inoculación; 2) inoculación con el hongo 1h antes del tratamiento con los extractos; 3) aplicación del extracto 24h después de la inoculación.

Se realizaron observaciones de las hojas al microscopio óptico cada hora, para registrar el momento de inicio de la germinación. Para ésto se realizó un ligero raspado con una hoja de bisturí en el envés de la lámina foliar, con el objeto de aclarar el tejido sin afectar los conidios.

Resultados y Discusión

Efecto sobre el crecimiento micelial

Se encontraron diferencias significativas (P<0,01) entre las concentraciones de los extractos en relación con su efecto sobre los hongos. R. solani mostró mayor susceptibilidad al extracto de P. niruri, con inhibición del crecimiento de la colonia superior al 90% cuando se usó el 5% del extracto. Del mismo modo, B. maydis mostró una alta susceptibilidad, con una inhibición del 80%, a la misma concentración (Figura 1a). El extracto de H. indicum (Figura 1b) tuvo efecto inhibitorio solo en R. solani, donde, a la mayor dosis evaluada (10%), suprimió totalmente el hongo, mientras que B. maydis no fue susceptible a ninguna de las dosis utilizadas. L. origanoides fue efectivo contra ambos hongos (Figura 1c); al 1,5% causó una inhibición total y al 0,5%, la reducción fue del 70 y 84% en R. solani y B. maydis, respectivamente.

Se observó que R. solani y B. maydis tienen un comportamiento distinto frente a los extractos; así mismo, éstos no presentaron la misma efectividad frente a un mismo hongo. Tanto con P. niruri como con H. indicum, R. solani fue más susceptible que B. maydis, lo que quizás se deba a que R. solani es un Basidiomycetes y B. maydis es un Ascomycetes, diferenciándose en el tipo de espora meióticas y en la composición de la pared celular (Alexopoulos et al., 1996). Ambos hongos fueron altamente susceptibles a muy bajas concentraciones del extracto de L. origanoides.

La diferencia de efectividad de los extractos vegetales ha sido explicada por la variabilidad de metabolitos secundarios (MS) presentes en ellos (Albornoz, 1980). En ese sentido, Castillo (2004) encontró que estas tres plantas se diferenciaban claramente. L. origanoides presenta flavonoides, polifenoles y taninos, mientras que P. niruri, solo flavonoides y H. indicum solo polifenoles y taninos. Probablemente es la combinación de grupos distintos de MS lo que le confiere la mayor capacidad fungistática o fungicida a L. origanoides.

El extracto crudo de otras plantas también ha sido efectivo contra R. solana. Tal es el caso de Agapanthus inapertus Beauv., Aristea eklonii Baker y Eucomis autumnales (Mill.) Chitt. subsp. clavata (Baker) Reyneke, con las cuales, en Sudáfrica, se logró inhibición total con las 2 primeras y del 85% con la última (Pretorious et al., 2002; Eksteen et al., 2001). Müller–Riebau et al. (1995), en Turquía, encontraron que los aceites esenciales de Thymbra spicata, Satureja timbra, Pimpinella anisum y Origanum minitiflorum inhibieron totalmente el micelio de R. solani; al separar y evaluar individualmente los MS, estos autores observaron que el efecto inhibidor lo lograban con carvacrol y thymol a 100 y 150µg/ml, respectivamente. Dubey y Kishore (1987) evaluaron, entre otras plantas, a Lippia alba y observaron una alta toxicidad de los compuestos volátiles de su extracto acuoso contra el cultivo in vitro de R. solani.

Zapata et al. (2003) sometieron también a B. maydis y R. solani al extracto de Cereus deficiens Otto y Dietr., logrando la inhibición máxima del 66% al utilizar una concentración de crudo del 75% (v/v). Esto indica que las plantas utilizadas en este trabajo inhibieron con mayor eficacia el crecimiento micelial de los hongos.

Efecto sobre la rizoctoniosis en maíz

Durante el período del ensayo se registró dentro del umbráculo una temperatura máxima de 32ºC y una mínima de 23,7ºC. Se encontraron diferencias significativas (P< 0,01) entre los tratamientos a los 18 y 26 días de iniciados los ensayos, en cuanto al número de lesiones (Tabla I). Los extractos de P. niruri y L origanoides redujeron su número en comparación con el control (sin extracto). A los 18 días, las plantas que habían sido tratadas con extractos de P. niruri mostraron una cantidad de lesiones estadísticamente igual a las tratadas con L. origanoides, pero menor que aquellas tratadas con H. indicum. Ocho días después, P. niruri continuaba mostrando el mejor efecto e igual que L. origanoides, mientras que H. indicum y el control eran estadísticamente iguales. Ninguno de los extractos superó al tratamiento con el fungicida iprodione, el cual no permitió el desarrollo de síntomas de la enfermedad. Por esta razón no fue incluido en el análisis estadístico para evitar que afectara la sensibilidad de la prueba.

En cuanto a la longitud de las lesiones (Tabla I), no se observaron diferencias estadísticas significativas (P<0,05). Tanto el número como el tamaño de las lesiones disminuyeron a los 26 días, debido a la muerte de las plantas más afectadas. Ninguno de los tratamientos afectó el contenido de materia seca por planta (Tabla I).

Se observó como en ambas fechas de evaluación, los menores valores de severidad de rizoctoniosis se obtuvieron con P. niruri y L. origanoides, reafirmándose los resultados obtenidos en las pruebas in vitro, en las cuales este extracto fue más efectivo que H. indicum. En cuanto a L. origanoides, la fitotoxicidad observada con el 2,5% de concentración obligó a disminuirla en un 50%, resultando en una efectividad similar a P. niruri.

Efecto sobre la mancha sureña del maíz

Se registró una temperatura máxima de 33,7ºC y mínima de 22,4ºC. El método de inoculación fue apropiado y las plantas mostraron los síntomas de la enfermedad. El análisis estadístico del área bajo la curva (ABC) de progreso de la enfermedad (Tabla II) muestra una fuerte disminución de la infección (80,2%) para el tratamiento con P. niruri aplicado 1h después de inoculado, pero es estadísticamente similar al mismo extracto previo a la inoculación y a L origanoides, después de la inoculación, con los cuales las reducciones fueron del 67,2 y 56,7%, respectivamente (Tabla II).

En el segundo experimento, donde los extractos se aplicaron 24h antes o después de la inoculación con el hongo, la menor severidad se observó con H. indicum aplicado 24h antes de la inoculación, con lo que se logró una disminución de la infección del 41,1%; no obstante, fue estadísticamente similar a los tratamientos en post-inoculación, de P. niruri y de L. origanoides con los cuales se obtuvo menor disminución de la enfermedad (Tabla II).

Estos resultados indican que existe un efecto protector de las hojas frente a las esporas por parte de los extractos, la cual ofrece sus mayores beneficios a corto plazo, cuando el lapso entre la aplicación del extracto y el aterrizaje de las esporas sobre la hoja es de apenas unas horas. A medida que ese lapso se hace mayor, la efectividad de los extractos comienza a disminuir. Aún así, con una diferencia de 24h entre ambos eventos, la disminución de la infección fue, en promedio, de casi 23% (Tabla II).

En el experimento con el intervalo de 1h los extractos más efectivos fueron P. niruri y L. origanoides (Tabla II). En ambos casos la efectividad fue mayor cuando se aplicaron antes que después de la inoculación, lo cual pudiera atribuirse a un efecto directo de los extractos sobre la germinación de los conidios del hongo. Una hora de intervalo pudiera ser suficiente tiempo para que el extracto redujera su potencial fungicida.

Con el experimento de 24h de intervalo los extractos de P. niruri y L. origanoides disminuyeron su efecto (Tabla II) pero continuaron siendo más efectivos al ser aplicados después de la inoculación, lo que sugiere que las esporas que aún no habían germinado e infectado la planta, o aquellas con una germinación e infección incipiente, podían ser afectadas por los extractos. No obstante, los mejores resultados en esta prueba se lograron con el extracto de H. indicum aplicado antes de la llegada de las esporas, aunque fue estadísticamente similar a su aplicación posterior a la inoculación.

En este caso, el resultado del extracto fue diferente al obtenido en la prueba con intervalo de 1h, lo cual podría explicarse por una durabilidad mayor del compuesto activo del extracto de H. indicum comparado al de los de las otras plantas del estudio; o bien puede deberse a la naturaleza volátil de los compuestos biológicamente activos de P. niruri y L. origanoides, que se disipan en el aire. Otra explicación probable, aunque los valores de severidad son aún altos, sería que el extracto de H. indicum tenga un efecto inductor de resistencia al patógeno en la planta, que involucre el incremento en la producción de fitoalexinas como respuesta a la exposición prolongada (24h) a un agente externo como es el extracto (Swain, 1977). Este efecto ha sido observado como un carácter controlado genéticamente y que determina la formación de novo de productos fenólicos con actividad fungicida (Lee et al., 2001).

Efecto sobre la germinación de conidios de B. maydis sobre hojas de maíz

La prueba permitió observar cronológicamente la germinación de los conidios de B. maydis sobre la hoja de maíz bajo las condiciones de laboratorio. Tal como señala Carson (1999), el conidio germinó por ambos extremos e infectó la hoja penetrando a través de los estomas o directamente por la pared celular. La germinación en el tratamiento testigo (solo agua) ocurrió a las 3 ó 4h de incubación y la penetración del tejido por parte del tubo germinativo entre las 5 y 7h (Tablas III a V). En cuanto a los tratamientos, se encontró que cuando la inoculación se realizó 1h después de la aplicación de los extractos, no se observó germinación de conidios durante las primeras 8h de iniciado el experimento. Las esporas se observaron germinadas a las 24h en todos los tratamientos (Tabla III). Cuando el extracto se aplicó 1h después de la inoculación, los conidios germinaron a las 6h, mientras que el testigo lo hizo a las 4h (Tabla IV). En el caso de inoculación 24h después de aplicados los extractos, no se observó germinación de conidios a las 9h después de iniciado el experimento (Tabla V).

Estos resultados muestran un efecto similar de los tres extractos sobre la germinación de B. maydis, la que se retardó en todos los casos. Cuando la inoculación fue posterior a la aplicación de los extractos, la germinación tomó más de 8h, lo que indica que estos tuvieron un efecto protector sobre la superficie de la hoja. Cuando la inoculación ocurrió primero, el efecto retardante de los extractos fue solo de 2h, lo que sugiere que las esporas ya habían iniciado el proceso preparatorio para la germinación y el extracto no fue suficiente para detenerlo.

Conclusiones

Los resultados mostraron que existe un potencial de uso de los extractos vegetales como alternativa para el control de enfermedades de plantas causadas por patógenos del suelo y del follaje. Los extractos etanólicos de Phyllanthus niruri, Lippia origanoides y Heliotropium indicum tuvieron efecto sobre Rhizoctonia solani y Bipolaris maydis, tanto en las pruebas in vitro como in vivo, trabajando con plantas en vivero. El efecto fue directo sobre los hongos, pero la prueba con plantas indicó, además, la posibilidad de que los metabolitos secundarios de H. indicum sean menos lábiles o que tengan un efecto indirecto sobre la mancha sureña del maíz, especialmente si la planta es expuesta al extracto por cierto tiempo antes de la llegada de las esporas. Los extractos no superaron el fungicida comercial en el caso de la rizoctoniosis, pero causaron una reducción del 30 al 80% de la enfermedad. El efecto de los productos depende de la concentración utilizada y de los factores que determinan su durabilidad, lo que sugiere la necesidad de continuar los estudios.

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