LAS β-GALACTOSIDASAS Y LA DINÁMICA DE LA PARED CELULAR

Iris Pérez-Almeida y Nicholas C. Carpita

Iris B. Pérez-Almeida. Ingeniero Agrónomo y Maestría en Ciencias, Universidad Central de Venezuela (UCV). Doctora en Biología Molecular de Plantas, Purdue University, EEUU. Investigadora, Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (CENIAP), Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA). Dirección: Apartado 4653. Maracay 2101-Aragua, Venezuela. e-mail: iperez@inia.gob.ve

Nicholas C. Carpita. Ph.D. en Fisiología del Desarrollo Vegetal. Profesor, Purdue University, EEUU. e-mail: carpita@purdue.edu

RESUMEN

La pared celular es crucial en la determinación del crecimiento y desarrollo de la célula vegetal. En la mayoría de las angiospermas existen muchos glucanos entrelazados sobre una infraestructura de celulosa. El monosacárido galactosa es un constituyente clave de la mayor parte de los polisacáridos no celulósicos en las paredes celulares vegetales: fucogalacto-xiloglucanos, cadenas de (1→3), (1→6)β-D-galactano tipo II, proteínas con arabinogalactanos, (1→4)β-D-galactanos y los arabinogalactanos tipo I. Cada uno de estos componentes exhibe un metabolismo diferente durante etapas específicas del crecimiento y desarrollo celular. Por ejemplo, se han observado alteraciones durante el ensamblaje o remodelación de la pared celular a través de la hidrólisis de galactósidos o galactanos de la pared, que ocurren antecediendo ciertos eventos del desarrollo, tales como el inicio de la maduración de los frutos y el inicio de la formación de haces fibrosos en lino. No se han encontrado endo-galactanasas en plantas, por lo que se responsabiliza a las exo-galactanasas/β-galactosidasas por la hidrólisis de todos los polímeros que contienen galactosa en la pared celular. Esta revisión examina los polímeros que contienen galactosa en la pared celular y propone una función y rol biológico para las β-galactosidasas vegetales en el contexto de la dinámica del crecimiento celular.

β-GALACTOSIDASES AND CELL WALL DYNAMICS

Summary

The cell wall is the major determinant of plant cell growth and development. Upon a framework of cellulose, in most flowering plants, there are many cross-linking glycans and pectins whose composition and interactions are involved in wall dynamics during growth. The monosaccharide galactose is a key constituent of major non-cellulosic polysaccharides in most plant cell walls: fucogalacto-xyloglucans, (1→3), (1→6)β-D-galactan chains of the type II arabinogalactan-proteins, (1→4)βD-galactans and related type I arabinogalactans. Each of them exhibits a different turnover at specific stages of cell growth and development. For instance, alterations in cell wall assembly or remodeling through hydrolysis of galactosides and galactans in the cell wall, pre-stages certain developmental events, such as the onset of fruit ripening and the initiation of fiber bundles in flax. No endo-galactanases have been found in plants; therefore, exo-galactanases/β-galactosidases are held responsible for the hydrolysis of all cell-wall galactose-containing polymers. The purpose of this paper is to review cell wall galactose-containing polymers and to better understand the biological role of the plant β-galactosidases in the context of the dynamics during cell growth.

As β-Galactosidasas E A Dinâmica Da Parede Celular

RESUMO

A parede celular é crucial na determinação do crescimento e desenvolvimento da célula vegetal. Na maioria das angiospermas existem muitos glucanos entrelaçados sobre uma infra-estrutura de celulosa. O monosacarídeo galactosa é um constituinte chave da maior parte dos polisacarídeos não celulósicos nas paredes celulares vegetais: fucogalacto-xiloglucanos, cadeias de (1→3), (1→6)β-D-galactano tipo II, proteínas com arabinogalactanos, (1→4)β-D-galactanos e os arabinogalactanos tipo I. Cada um destes componentes exibe um metabolismo diferente durante etapas específicas do crescimento e desenvolvimento celular. Por exemplo, têm-se observado alterações durante a ensamblagem ou remodelação da parede celular através da hidrólise de galactosídeos ou galactanos da parede, que ocorrem antecedendo certos eventos do desenvolvimento, tais como o início da maduração dos frutos e o início da formação de feixes fibrosos em linho. Não têm-se encontrado endo-galactanase em plantas, pelo que se responsabiliza às exo-galactanase/β-galactosidase pela hidrólise de todos os polímeros que contêm galactose na parede celular. Esta revisão examina os polímeros que contêm galactosa na parede celular e propôe uma função e rol biológico para β-galactosidase vegetal no contexto da dinâmica do crescimento celular.

Palabras clave / Galactanos / Galactosa / -Galactosidasas / Pared Celular /

Recibido: 02/09/2005. Modificado: 20/03/2006. Aceptado: 12/04/2006.

La pared celular es un compartimiento dinámico, continuamente modificado durante el crecimiento y diferenciación celular. Los residuos que contienen galactosa son muy activos durante ambos procesos. Los cambios más obvios en la pared celular durante la maduración, ocurren en las pectinas, siendo la galactosa el residuo más dinámico durante el desarrollo de los frutos del tomate (Gross y Sams, 1984; Seymour y Gross, 1996; Brummel y Harpster, 2001). Los residuos galactósicos de la pared celular son hidrolizados durante el desarrollo de los frutos, y el incremento en la actividad de la poligalacturonasa (PGasa) es responsable por el aumento en su tasa de remoción durante su maduración.

El (1®4)b-D-galactano aumenta en las fibras del lino durante su desarrollo temprano (Gorshkova et al., 1997). Estos investigadores sugirieron que el galactano puede funcionar como lubricante entre los haces fibrosos durante el crecimiento intrusivo de las células de fibra de lino, siendo hidrolizado extensamente cuando el crecimiento cesa, las células fibrosas maduran y se cementan.

Desde el punto de vista del fitomejoramiento, el control genético de la expresión de las b-galactosidasas puede emplearse para mejorar la calidad y la facilidad de extracción de las fibras de lino, así como para modular el ablandamiento y maduración de los frutos en varios cultivos importantes. Esta revisión pretende evaluar las complejidades de la estructura de los polímeros que contienen galactosa en la pared celular, sus posibles interacciones, así como los roles potenciales que pueden jugar en la dinámica de la pared celular durante el crecimiento y desarrollo, a través de la acción de las b-galactosidasas.

La Pared Celular Tipo I

La composición de las paredes celulares primarias de Arabidopsis es típicamente la Tipo I descrita para las angiospermas (Carpita y Gibeaut, 1993; Figura 1). Las paredes celulares de Arabidopsis contienen una red de microfibrillas de celulosa entrelazada por fucogalacto-xiloglucanos, embebidos en una compleja matriz de polisacáridos pécticos y glucoproteínas estructurales (Zablackis et al., 1995). Diversas clases importantes de polisacáridos de las paredes celulares vegetales, como los glucolípidos y glucoproteínas, contienen residuos de galactosa en enlaces tipo b. Incluyen fucogalacto-xiloglucanos, cadenas de (1®3), (1®6)b-D-galactanos, proteínas arabinogalactanos del tipo II, (1®4)b-D-galactanos y arabinogalactanos tipo I relacionados, así como numerosas y complejas glucoproteínas con N-enlaces.

Xiloglucanos (XiGs)

Comprende el mayor glucano entrelazante en plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas no gramíneas. La mayoría de los XiGs consiste en unidades heptasacáridas repetidas de cuatro unidades b-D-glucosa enlazadas en (1®4), con tres residuos consecutivos sustituidos con a-D-xilosa enlazadas (1®6)- al esqueleto de glucano. Cerca de la mitad de estas unidades heptaméricas contiene extensiones de b-D-galactosa-(1®2)- sobre la xilosa (más cercana al término reductor) del glucano o a la xilosa media o entre ambos residuos. Un residuo a-L-fucosa-(1®2)- se añade al residuo de galactosa en la primera posición (Figura 2). La estructura y distribución molecular de estas cadenas laterales de XiG varía según la especie y tejidos vegetales (Vincken et al., 1997). Los XiGs almacenados en las semillas no contienen fucosa pero están mucho más galactosilados (Buckeridge et al., 2000). La rigidez estructural y la fuerza de la pared celular depende de la integridad de la red formada por celulosa y glucanos entrelazados. La modificación de XiG catalizada por las enzimas es un proceso clave para la expansión durante el crecimiento celular (Talbott y Ray, 1992). El metabolismo de XiG aumenta durante el alargamiento de la célula vegetal y es un factor que contribuye a la extensión de la pared celular. La cooperación entre expansinas y xiloglucano endotransglucosilasas (XETs) está implicada en el alargamiento de polímeros durante el ensamblaje de la pared (Thompson y Fry, 2001) y en el estiramiento de la pared durante el crecimiento y la orientación de las microfibrillas (Nishitani, 1998).

Los residuos galactosilados de XiGs desempeñan un papel en el control de enlace de este polímero a la celulosa y en la actividad de la XET. Los estudios computacionales de modelaje de las estructuras de XiG en tercera dimensión sugieren que los grupos laterales enderezan el esqueleto de glucano para facilitar la formación de enlaces estéricos con las microfibrillas de celulosa (Levy et al., 1991, 1997). La galactosilación de la xilosa del medio proporciona una forma alternativa de enderezar la cadena (Levy et al., 1997). Los genes MUR2 y MUR3 de Arabidopsis codifican por transferasas específicas de xiloglucano-fucosa y galactosa, respectivamente (Vanzin et al., 2002; Madson et al., 2003). Mutaciones en estos genes alteran las estructuras de XiG presentando pérdidas de uno o de ambos residuos. El mur2 tiene una transferasa de fucosa defectuosa y el polímero es galactosilado normalmente, mas no fucosilado (Vanzin et al., 2002). El mur3, el cual es deficiente en fucosa, es una mutación en una transferasa de galactosa requerida para añadir la galactosa a la cual se enlaza la fucosa. El resultado es que una segunda galactosil-transferasa añade exceso de galactosa a la xilosa del medio (Madson et al., 2003). Las plantas mur2 y mur3 son similares al tipo silvestre Columbia, indicando que XiG necesita al menos un residuo de galactosa, bien sea en la posición del medio o en la primera posición para el crecimiento y desarrollo normal. A partir de la comparación de las respuestas mecánicas de mur2 y mur3, Ryden et al. (2003) dedujeron que las cadenas laterales que contienen galactosa en el XiG hacen una contribución principal a la fuerza de la pared celular, mientras que el rol de la fucosilación del XiG es comparativamente menor. Mientras que los tallos florales de mur2 y mur3 tienen resistencia a la tensión equivalente a la del tipo silvestre, los hipocotilos etiolados de estos mutantes tienen valores marcadamente menores a los del tipo silvestre (Peña et al., 2003).

La hidrólisis de XiG por a-xilosidasas y b-glucosidasas es modulada por residuos de galactosa en la xilosa del medio (Edwards et al., 1988; De Alcántara et al., 1999). Los XiGs de reserva en la semilla tienen una notable similitud con los XiGs estructurales de paredes celulares primarias de los tejidos vegetativos de las dicotiledóneas, excepto que las unidades (1®2)a-L-fucosa terminales enlazadas a grupos b-D-galactosa están ausentes. Una b-galactosidasa es activa en oligómeros de XiG y remueve únicamente el residuo de galactosa del medio (Edwards et al., 1988). La galactosa del medio disminuye también durante el crecimiento y está involucrada en la partición de XiG desde un compartimiento enzimático activo a uno inactivo (Pauly et al., 1999, 2001).

Proteínas con Arabinogalactanos Tipo II (AGPs)

Son una clase de proteoglucanos que se encuentran en las paredes celulares, membranas plasmáticas y en la matriz extracelular. Cerca del 70% de los polisacáridos dentro de las vesículas secretoras son AGPs, lo cual indica que estas moléculas ubicuas funcionan como moléculas glucochaperonas en el proceso secretor (Gibeaut y Carpita, 1991). Están involucradas en los procesos de proliferación celular, expansión celular, embriogénesis somática y muerte celular (Nothnagel, 1997). Se caracterizan por contener compuestos carbohidratos ricos en galactosa y arabinosa, y compuestos proteicos ricos en hidroxiprolina, serina, treonina, alanina y glicina (Clarke et al., 1979). La unidad núcleo de carbohidrato de AGPs (Figura 3) generalmente consiste de un esqueleto de b-D-galactano enlazado (1®3), del cual se ramifican cadenas de b-D-galactano en enlace (1®6). Estas cadenas usualmente están fuertemente saturadas con residuos de arabinosa y también con otros azúcares como xilosa, ramnosa, fucosa, ácido glucorónico, y ácido glucorónico 4-O-metilo.

Las AGPs clásicas contienen un dominio transmembrana hidrofóbico en su términal carboxilo. En la AGP madura, sin embargo, este dominio hidrofóbico está ausente y es reemplazado por un ancla lipídica de glucosa-fosfatidilinositol (GPI; Majewska-Sawka y Nothnagel, 2000). El descubrimiento que una clase de AGP asociada a la membrana posee un ancla de GPI sugiere un papel dual en señalización. Estas anclas de GPI otorgan una forma alternativa a los dominios transmembrana para anclar las proteínas a las superficies celulares (Schultz et al., 1998).

Las llamadas AGPs no-clásicas contienen un dominio carboxilo terminal rico en cisteína o uno o dos dominios ricos en asparagina que siguen o rodean a un domino rico en prolina, hidroxiprolina, alanina, serina o treonina. Ninguno de las AGPs no clásicas conocidas contiene un dominio carboxilo terminal hidrofóbico o codifica por una modificación GPI. Otras macromoléculas parecen ser quimeras de AGPs o extensinas, conteniendo ambas largos polisacáridos arabinogalactanos de AGPs del tipo II e hidroxiprolina-oligoarabinósidos cortos de extensinas (Majewska-Sawka y Nothnagel, 2000).

La gran cantidad de AGPs en las vesículas secretoras no se acumula apreciablemente durante el crecimiento en la pared celular. Así, es factible que sufra una hidrólisis considerable después de que los contenidos vesiculares son llevados a la pared celular. Marcaje de pulso de coleóptilos de maíz etiolados proporcionó evidencia directa de esta hidrólisis y el reciclaje de arabinasa y galactosa (Gibeaut y Carpita, 1991). Las b-galactosidasas y a-arabinosidasas han sido implicadas en acciones sinergísticas en la degradación de AGPs en hojas de espinaca (Hirano et al., 1994). Singh y Knox (1985b) postularon que la función de la b-galactosidasa del polen de Brassica campestris era la hidrólisis de arabinogalactanos. Los mutantes deficientes en b-galactosidasa aislados en B. campestris presentan fertilidad impedida (Singh y Knox, 1985b), lo cual soporta la hipótesis de que esta enzima tenga un papel importante en el crecimiento del tubo polínico o la fertilización. El polen de lirio (Lilium auratum) contiene altos niveles de b-galactosidasa (Singh y Knox, 1985a). La actividad total de la enzima permaneció constante durante la germinación in vitro, sugiriendo un rol para la b-galactosidasa en la degradación de arabinogalactanos estilares con el fin de proveer de una fuente de carbono para la nutrición del polen. La b-galactosidasa putativa del tabaco descrita por Rogers et al. (2001) es otro miembro del grupo de genes cuyo ARNm se acumula tarde durante el desarrollo del polen, y se presume que se almacena alistándose para la germinación del polen. Algunos de estos genes están involucrados en el metabolismo de las pectinas, incluyendo poligalacturonasa, metilesterasa de la pectina y pectatoliasa.

Matriz péctica de la pared celular vegetal

Los polisacáridos pécticos constituyen cerca de un tercio de las paredes celulares de las plantas dicotiledóneas (Carpita y Gibeaut, 1993). La matriz péctica de la célula vegetal es una mezcla compleja de homogalacturonano (HG), y polímeros de ramnogalacturonano I (RGI) y ramnogalacturonano II (RGII). Los HGs son cadenas no ramificadas de residuos de (1®4)a-D-ácido galacturónico (GalA) que pueden ser metilesterificadas o acetiladas diferencialmente, mientras que RGIs son heteropolímeros ramificados de (1®2)a-D-ramnosa alternados con residuos de (1®4)a-D-GalA que portan cadenas laterales neutras de residuos (1®4)b-D-galactosa y/o (1®5)a-L-arabinosa predominantemente unidos a los residuos del esqueleto de ramnosa en O-4. Las cadenas laterales de (1®4)b-D-galactano con residuos terminales de arabinosa en posición O-3 constituyen el arabinogalactano I (Figura 4). Las sustancias pécticas vegetales varían mayormente en la composición de las cadenas laterales neutrales de sacáridos.

La molécula de RGII es altamente conservada. Tiene un esqueleto de HG con cadenas laterales diversas y puede dimerizarse a través de un enlace diestérico de borato (O’Neill et al., 1996). Los complejos RGIIs contribuyen a la resistencia a la tensión de las paredes vegetales (Ryden et al., 2003).

Aunque la composición química de estas moléculas está bien caracterizada, su ensamblaje dentro de estructuras de alto orden no está claro (McCartney et al., 2000; SØrensen et al., 2000). Los residuos de galactosa están presentes en diferentes polisacáridos de la pared vegetal (XiGs, AGPs, y RGI), pero únicamente RGI es conocido por contener (1®4)-b-D-galactano, así como su pariente, arabinogalactano tipo I (Figura 4). Se han propuesto diversos roles para los polímeros pécticos incluyendo la regulación de la adhesión célula-célula, expansión celular, propiedades mecánicas de la pared celular, mediación de la porosidad celular, fuente probable de moléculas de señalización (oligosacarinas), y eventos de la diferenciación celular y organogénesis (Reiter et al., 1997). Se ha mostrado que la ocurrencia de RGI asociado a cadenas laterales de (1®4)b-D-galactano y (1®5)a-L-arabinano refleja eventos de desarrollo en un rango de sistemas (Vicré et al., 1998; Bush y McCann, 1999; Willats et al., 1999; Serpe et al., 2001). Sin embargo, las funciones precisas de estos polímeros dentro del grupo de RGI aún se desconocen.

Función de los arabinanos y galactanos durante el desarrollo de la planta

La aparición y desaparición de galactanos y otros polímeros que los contienen ocurre en diferentes órganos y tipos de células, ligada a eventos del desarrollo de las plantas. Se han empleado dos anticuerpos monoclonales para localizar los epítopes pécticos arabinano y galactano en la pared celular. LM5 se liga a un mínimo de cuatro residuos de (1®4)b-D-galactano (Jones et al., 1997) y el anticuerpo LM6 se liga a un mínimo de cinco residuos de (1®5)-a-L-arabinano (Willats et al., 1998). Formas de RGI enriquecidas en galactano y arabinano en las diferentes regiones de órganos indican que las estructuras de RGI son heterogéneas (Willats et al., 1998. 2001; Bush y McCann, 1999; Ermel et al., 2000). Cuando el galactano y el arabinano ocurren en la misma célula, pueden tener localizaciones espaciales distintas dentro de la pared celular. Cuando el galactano aparece durante la diferenciación celular, se observa en una región estrecha de la pared cercana a la membrana plasmática (Jones et al., 1997; Vicré et al., 1998; Bush y McCann, 1999; McCartney et al., 2000). En tales casos, el galactano ocurre durante la diferenciación celular y no está presente en estados proliferativos tempranos. En células meristemáticas de ápices radiculares de zanahoria, el epítope de arabinano es más abundante que el de galactano, el cual aparece en ciertos puntos durante la diferenciación celular (Willats et al., 1999). Vicré et al. (1998) mostraron que los epítopes de (1®4)b-D-galactano están restringidos a las células periféricas de ápice de la raíz del lino. No estuvieron presentes en células meristemáticas o de la columela. Por el contrario, se encontró un anticuerpo contra el epítope (1®6)b-D-galactano en todo los tipos de células de las raíces del lino. Marcado inmunológico con oro mostró que tanto el epítope de arabinano como el de galactano se localizan dentro de la pared celular inmediatamente adyacente a la membrana plasmática. McCartney et al. (2003) reportaron que la ocurrencia pasajera de un epítope péctico (1®4)b-D-galactano en las paredes celulares precede la fase principal de alargamiento celular en los ápices radiculares de plántulas de Arabidopsis. La ocurrencia de un epítope de (1®4)b-D-galactano o en la superficie de la raíz y en las paredes celulares epidermales/corticales/endodermales marca la zona de transición y el inicio del alargamiento rápido en raíces de plántulas de Arabidopsis.

El epítope galactano también es depositado en la pared celular relativamente tarde durante el desarrollo de la semilla (McCartney et al., 2000). La aparición de un (1®4)b-galactano en las paredes celulares de cotiledones de vainita en desarrollo se correlaciona con un incremento en la firmeza de estos tejidos evaluada en pruebas de compresión, indicando que este galactano modula propiedades mecánicas de los tejidos parenquimatosos de los cotiledones de vainita (McCartney et al., 2000).

La aparición de un galactano soluble en agua marca estados tempranos de la diferenciación de la fibra del lino (Gorshkova et al., 1996), el cual es hidrolizado a medida que las células fibrosas maduran y se cementan entre sí (Gorshkova et al., 1997). Estudios de caracterización inmunocitoquímica de paredes celulares de fibras de lino en etapas de desarrollo temprano mostraron que el anticuerpo LM5 se asoció primariamente con la pared secundaria más cercana a la membrana plasmática y el marcado con anticuerpos del galactano fue uniforme sobre la pared primaria más ausente de las junturas celulares. La importancia de estas regulaciones durante el desarrollo de las cadenas laterales de RGI no está clara pero los autores sugieren que su localización puede relacionarse a propiedades mecánicas (Willats et al., 2001). El estatus de los residuos de galactosa en estas regiones probablemente esté controlado por la acción de b-galactosidasas, aunque no se dispone de evidencia de relación directa in situ.

El galactano aparece durante estadios tempranos del desarrollo y en todas las paredes celulares del pericarpo del fruto del tomate (Jones et al., 1997; Orfila y Knox, 2000). Una característica constante del epítope galactano es que está específicamente ausente de paredes celulares en regiones de campos cercanos a hendiduras que contienen plasmodesmata (Bush y McCann, 1999; Orfila y Knox, 2000). Por otro lado, el epítope de arabinano es abundante en regiones que rodean campos cercanos a hendiduras de paredes celulares de tomate (Orfila y Knox, 2000). Probablemente las b-galactosidasas juegan un rol en la pérdida de cadenas laterales de galactano (Pressey, 1983; DeVeau et al., 1993; Carey et al., 1995; Carrington y Pressey, 1996).

Así pues, XiGs, RGI, y AGPs tipo II juegan roles importantes en el crecimiento celular, en la diferenciación y en los procesos secretores. La modulación de cada uno de estos polímeros de la pared celular por las b-galactosidasas puede impactar sus funciones en estadios específicos del desarrollo. Debido a la disponibilidad del genoma completo de Arabidopsis, todas las b-galactosidasas putativas se han anotado, facilitando de esta forma el análisis de la función de esta familia de genes y sus posibles roles en el estatus de estos polímeros y su dinámica en el contexto de la pared celular y el crecimiento de la planta.

Las b-Galactosidasas y la dinámica de la pared celular

Toda la dinámica de la galactosa en la planta involucra las b-galactosidasas. La familia 35-glucosa-hidrolasas comprende un grupo caracterizado por su habilidad de hidrolizar residuos terminales, no reductores de b-D-galactosa de b-D-galactósidos (Henrissat, 1998). En mamíferos y Escherichia coli han sido comúnmente asociados con la hidrólisis de lactosa en galactosa (Gal) y glucosa (Glc). El LacZ de E. coli se ha convertido en el sistema de gen reportero más conspicuo que se usa en la actualidad (Lewis et al., 1998). Numerosos estudios han mostrado que las b-galactosidasas catalizan la hidrólisis de residuos terminales de Gal a partir de carbohidratos, glucoproteínas y galactolípidos. Se ha propuesto que la acción de b-galactosidasas libera energía almacenada para crecimiento rápido, Gal disponible durante el reciclaje metabólico de galactolípidos, glucoproteínas, y componentes de la pared celular, y degrada compuestos de la pared celular durante la senescencia (Smith y Gross, 2000).

Los cambios aparentes más evidentes durante la maduración del fruto del tomate, en término de tamaño y composición, ocurren en la fracción péctica de la pared celular (Seymour y Gross, 1996), incluyendo aumento en la solubilidad, despolimerización, desesterificación y una significativa pérdida neta en cadenas laterales de azúcares neutros (Huber, 1983; Fischer y Bennett, 1991; Seymour y Gross, 1996). Aunque la maduración del fruto puede involucrar cambios en la presión de turgor, características anatómicas de ablandamiento, y la integridad de la pared celular, se asume generalmente que el desmontaje de la pared celular lleva a una pérdida de la integridad de la pared como característica crítica. La PGasa y la metilesterasa de pectina (PME) son relativamente abundantes y tienen actividad sustancial durante la maduración del tomate pero incluso en frutos de plantas trangénicas en las cuales la expresión génica y la actividad enzimática de la PGasa (Smith et al., 1988) o la PME (Tieman et al., 1992; Hall et al., 1993) se ha disminuido se observa ablandamiento. La sobre-expresión de PGasa en frutos del mutante rin no-madurador de tomate no resultó en ablandamiento, aún cuando fue evidente que había despolimerización y solubilización de pectina (Giovannoni et al., 1989).

Entre las modificaciones conocidas de pectina que ocurren durante el desarrollo del fruto, la mejor caracterizada es la pérdida neta significativa de residuos de galactosa que ocurre en las paredes celulares de muchos frutos en maduración (Gross y Sams, 1984; Kim et al., 1991; Seymour y Gross, 1996). Datos fisiológicos y bioquímicos han mostrado que Gal es el azúcar más dinámico de la pared celular durante el desarrollo de frutos de tomate (Kim et al., 1991; Redgwell et al., 1997). Hay una pérdida neta significativa de residuos de galactosa de la pared a través del desarrollo del fruto, y la tasa de pérdida de residuos de Gal se incrementa durante la maduración. Los niveles de Gal libres, estables durante los estadios premaduración del desarrollo del fruto, se incrementan rápidamente durante la maduración (Kim et al., 1991). Cuando se infiltró Gal libre dentro de frutos verde-maduros a una concentración equivalente al del estadio maduro-rojo de desarrollo del fruto, se aceleró la maduración (Gross, 1985). Aunque algunos residuos de Gal pueden perderse indirectamente por la acción de PGasa, b-galactosidasa es la única enzima identificada en plantas superiores capaz de cortar directamente enlaces (1®4)-b galactano, y debe ser responsable por la pérdida de cadenas laterales de galactano (Pressey, 1983; DeVeau et al., 1993; Carey et al., 1995; Carrington y Pressey, 1996). El punto de vista de que la b-galactosidasa hidroliza residuos de Gal de la pared celular durante la maduración se apoya en el aumento marcado en Gal libre, producto de la actividad de la b-galactosidasa (Gross, 1984) y un incremento simultáneo en la actividad de b-galactosidasa II en tomate durante la maduración (Carey et al., 1995). Por otro lado, la supresión de la expansina relacionada con la maduración Exp1 y la b-galactosidasa 4 (TBG4) del tomate resultó en un fruto significativamente más firme (Brummel et al., 1999; Smith et al., 2002).

Se cree que la actividad exogalactanasa es responsable por reducir los niveles de Gal en la pared de una variedad de frutos aparte del tomate (Gross y Sams, 1984; Redgwell et al., 1997; Trainotti et al., 2001). Se observaron cambios en la distribución de marcaje en el estudio de Gorshkova et al. (1996) relacionados con ruptura a monosacáridos y/o modificaciones de la pared celular. En los tallos de lino homogeneizados, la b-D-galactosidasa y b-D-glucosidasa de la pared celular exhibieron actividades altas. Estas enzimas pueden estar involucradas en cambios de la estructura de la pared celular (Gorshkova et al., 1996). La degradación y modificación de polisacáridos puede jugar un rol significativo en la formación de propiedades órgano-específicas de las paredes celulares.

Mecanismo de las b-Galactosidasas

Las b-Galactosidasas catalizan la hidrólisis enzimática del enlace glucosídico entre dos o más carbohidratos o entre un carbohidrato y una molécula no-carbohidrato vía catálisis ácida general, la cual requiere dos residuos críticos: un donador de protones y una base nucleofílica. Esta hidrólisis ocurre vía retención completa de la configuración anomérica (Figura 5). La familia 35-glucosa-hidrolasa ha sido clasificada por contener el patrón de secuencia consenso putativo G-G-P-[LIVM](2)-x(2)-Q-x-E-N-E-[FY] en el sitio activo, donde los aminoácidos denotados son conservados, los aminoácidos [LIVM] y [FY] son sustituciones conservadas, y x es cualquier aminoácido (Henrissat, 1998). Se predice que el segundo residuo glutamato en esta secuencia actúa como el donador de protones en el mecanismo catalítico sobre la base de similitud con otras familias de glucosa hidrolasas (Henrissat et al., 1995; White y Rose, 1997; Henrissat y Davies, 1997; Juers et al., 2001).

La exo-(1®4)b-D-galactanasa es la única enzima identificada en plantas superiores capaz de romper directamente residuos terminales de (1®4)b-D-galactano y probablemente juega un rol en la pérdida de las cadenas laterales de galactano. No se ha reportado ninguna galactanasa que actúe en enlaces internos en las angiospermas. Se han detectado b-galactosidasas/exogalactanasas en un amplio rango de órganos y tejidos vegetales que sufren cambios de desarrollo tales como semillas, cotiledones (Edwards et al., 1988; Buckeridge y Reid, 1994; De Alcántara et al., 1999), epicotilos alargados (Dopico et al., 1989), frutos en maduración (De Veau et al., 1993; Ali et al., 1995; Carey et al., 1995; Smith et al., 1998; 2000; Tateishi et al., 2001), pétalos (O’Donoghue et al., 2002), polen (Singh y Knox, 1985a, b; Rogers et al., 2001) y brotes de espárragos cosechados frescos (O’Donoghue et al., 1998). Dado que las b-galactosidasas pueden catalizar la hidrólisis de residuos terminales de Gal a partir de polímeros diversos que incluyen carbohidratos y glucoproteínas, el conocimiento actual acerca de sus sustratos naturales es aún fragmentario. Solamente en Lilium spp. (Singh y Knox, 1985a), Tropaeolum majus L. (Edwards et al., 1988), Lupinus angustifolius (Buckeridge y Reid, 1994), Lycopersicum esculentum (Smith et al., 1998; 2000) y cotiledones de Copaifera langsdorfii (De Alcántara et al., 1999) se ha asignado una función de sustrato específico.

Las b-galactosidasas de plantas comprenden una familia de multigenes

Se han caracterizado bioquímicamente b-galactosidasas en diferentes plantas. En contraste, el conocimiento desde el punto de vista molecular apenas ha comenzado a acumularse. Se han identificado miembros de la familia de genes de b-galactosidasa en espárrago, tabaco y fresa (O'Donohue et al., 1998; Rogers et al., 2001; Trainotti et al., 2001). Durante el desarrollo del fruto del tomate, se expresan al menos siete genes de b-galactosidasas. Algunos miembros de la familia en tomate (TBG) han sido estudiados a través de co-supresión de sentido y supresión en antisentido. Carey et al. (2001) analizaron líneas transgénicas con niveles del ARNm de TBG1 reducidos a un 10% de los niveles normales en frutos bajo maduración. Pese a la reducción drástica en el mensaje, la actividad total de b-galactosidasa y exo-galactanasa no se alteró en líneas TBG1-suprimidas (Carey et al., 2001). Así, TBG1 puede que no contribuya sustancialmente al nivel total de actividad de b-galactosidasa/exo-galactanasa durante la maduración, pero podría actuar sobre un conjunto específico de polímeros ricos en galactano en la pared. La regulación-disminuida de niveles de ARNm de TBG3 resultó en líneas transgénicas con niveles de actividad exo-galactanasa y niveles aumentados en el contenido de galactosa en la pared celular, e incrementó los niveles de contenido de galactosa en la pared celular (De Silva y Verhoeyen, 1998). Aunque la firmeza del fruto de TBG3 no se afectó significativamente, la tasa de deterioro en almacenaje largo disminuyó. La regulación-disminuida antisentido de los niveles de ARNm de TBG4 resultó en plantas transgénicas con frutos 40% más firmes que los controles (Smith et al., 2002). Adicionalmente, la supresión del ARNm de TBG4 se correlacionó con reducciones en la actividad exo-galactanasa y los niveles de Gal libre en el estado verde maduro. El producto del gen TBG4 está claramente implicado en proveer la mayor cantidad de la actividad exo-galactanasa detectable y cambios relacionados a la galactosa en la pared celular durante la maduración (Smith et al., 2002). Las razones por las cuales la actividad reducida de la exo-galactanasa puede resultar en aumento en la firmeza del fruto siguen siendo especulativas. La actividad exo-galactanasa es responsable por los niveles reducidos de galactosa en la pared en variedad de frutos incluyendo tomate (Gross y Sams, 1984; Redgwell et al., 1997). Smith et al. (2002) discuten la posibilidad de que, tal como se reportó en cotiledones de vainita (McCartney et al., 2000), el incremento en las cadenas laterales de galactano péctico puede estar ligado a la firmeza y al aumento en la fuerza mecánica de la pared. Una hipótesis sería probar que las cadenas laterales que contienen galactosa en la pared disminuyan la porosidad de la pared, obstruyendo el acceso de otras hidrolasas a componentes de la pared, previniendo la despolimerización de polisacáridos estructurales. Es necesario un examen detallado de la composición y tamaño de varias fracciones de la pared en líneas antisentido y controles para determinar si puede hacerse alguna correlación entre la reducción en la actividad exo-galactanasa codificada por TBG4, la composición de la pared celular y la firmeza del fruto.

El rol del producto del gen TBG6 mediante regulación-disminuida de su expresión (Moctezuma et al., 2003) fue explorado, encontrándose que dos líneas anti-sentido tenían niveles de ARNm de TBG6 reducidos significativamente. Los fenotipos morfológicos observados en las líneas anti-sentido incluían agrietamiento del fruto, espacio locular reducido, y la cutícula del fruto estaba doblemente engrosada. La función exacta del gen TBG6 aun es desconocida, pero los resultados implican un rol importante de esta enzima en el crecimiento y desarrollo temprano del fruto en tomate (Moctezuma et al., 2003). Los experimentos de inhibición por antisentido han sido difíciles de interpretar debido a la redundancia de funciones.

Conclusiones

Una vez examinada la estructura y conformación de los polímeros que contienen galactosa en la pared celular, la idea de que varias b-galactosidasas puedan estar involucradas en las modificaciones de tales polímeros es plausible basado en los reportes de diferente especificidad de sus sustratos. Es común encontrar familias multigénicas en plantas aunque la función de las enzimas que ellas codifican apenas comienza a dilucidarse. Por ejemplo, el genoma de Arabidopsis contiene una familia genética b-galactosidasa extensa con 18 secuencias predichas como codificantes de estas proteínas. Tal familia puede relacionarse con varios procesos asociados con el crecimiento y desarrollo vegetal, incluyendo la hidrólisis de diferentes tipos de polisacáridos incluyendo XiGs, AGPs o las cadenas laterales de RGI, cuya ocurrencia está regulada espacial y/o temporalmente. La aparición o desaparición de estos polímeros inicia ciertos procesos como alargamiento celular, deposición de diferentes clases de polímeros y/o demarcación de zonas de diferenciación; o señala eventos de desarrollo, tales como maduración de los frutos o maduración de células fibrosas de lino. La actividad de diferentes miembros de la familia de genes b-galactosidasa de Arabidopsis probablemente ocurre en diferentes tejidos y tipos de células, así como en diferentes periodos del crecimiento. Algunos genes b-galactosidasa de Arabidopsis (AtBGALs) pueden contribuir a la degradación o estiramiento de la pared celular, mientras otros pueden ensamblar paredes celulares nacientes o reforzar paredes celulares ya establecidas. Otros pueden expresarse solo en células o tejidos específicos, o en regiones distintas de la pared celular. La caracterización de las actividades enzimáticas in vitro e in vivo junto con la determinación de la localización de la expresión génica y la acumulación de las proteínas llevará a un entendimiento más completo de la función precisa de cada AtBGAL, conocimiento que podrá extenderse a plantas de cultivo.

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