CULTIVO IN VITRO DE PATRONES DE CÍTRICOS TOLERANTES AL VIRUS DE LA TRISTEZA, EMPLEANDO SUSTRATOS INERTES ALTERNATIVOS AL AGAR

María de Jesús Martínez-Hernández, Alejandro Alonso López, Francisco Osorio-Acosta, Felipe Gallardo López, Héctor López Moctezuma y Martín Mata Rosas

María de Jesús Martínez-Hernández. Doctora en Ciencias en Agroecosistemas Tropicales, Colegio de Postgraduados (COLPOS), Campus Veracruz, México. Dirección: Calle Juan López Domínguez Nº 59. Col. Álvaro Obregón. 91060. Xalapa, Veracruz, México. e-mail: martinezhernandezmarj@hotmail.com

Alejandro Alonso López, Doctorado, Université d'Avignon, Francia. Profesor Investigador, COLPOS, Campus Veracruz. México.

Francisco Osorio-Acosta. Doctorado, University of California, Riverside, EEUU. Profesor Investigador. COLPOS, Campus Veracruz. México.

Felipe Gallardo López. Doctor en Ciencias, COLPOS, Campus Veracruz, México. Profesor Investigador, COLPOS, Campus Veracruz, México.

Héctor López Moctezuma. Doctor en Ciencias en Biotecnología. Universidad de Colima, México. Profesor, Universidad Veracruzana, México

Martín Mata Rosas. Doctor en Ciencias en Biología, Universidad Nacional. Autónoma de México. Investigador, Instituto de Ecología. México.

RESUMEN

Se evaluó el efecto de los sustratos agrolita, vermiculita y tezontle como sustitutos del agar en la germinación, multiplicación, enraizamiento y sobrevivencia de plántulas de los portainjertos tolerantes al virus de la tristeza de cítricos (VTC) Citrus volkameriana, Citrumelo swingle y Citrange 35. El medio de cultivo utilizado fue el Murashige y Skoog (MS) adicionado en la etapa de multiplicación con 3% de sacarosa, vitaminas y BAP (1mg·l^-1). En el enraizamiento se diluyeron las sales MS y la sacarosa al 50% de su concentración, adicionándole también 2,5mg·l^-1 de AIB y vitaminas. El porcentaje de germinación, multiplicación y enraizamiento fue de 96-100, 95-100 y 93-100%, respectivamente, en todos los sustratos utilizados, al igual que en el agar, no mostrando diferencias estadísticas (P>0,05). Se observó una frecuencia de dos brotes por explante en todos los tratamientos. La sobrevivencia fue superior estadísticamente (P<0,05) en las plántulas que provenían del medio de cultivo con sustratos inertes (91-100%) en relación a los brotes enraizados con agar (48-51%). Los sustratos inertes evaluados pueden sustituir como medio de soporte al agar en el cultivo de tejidos, reduciendo el costo y mejorando la sobrevivencia de las plántulas.

TISSUE CULTURE OF CITRUS ROOTSTOCKS TOLERANT TO CITRUS TRISTEZA VIRUS, USING INERT SUBSTRATES AS SUBSTITUTES FOR AGAR

SUMMARY

Effects of the substrates agrolite, vermiculite, tezontle as substitutes for agar were evaluated on seed germination, shoot proliferation, rooting, and survival of the seedlings of the citrus ‘tristeza’ virus (CTV) tolerant rootstocks Citrus volkameriana, Citrumelo swingle and Citrange 35. The medium used was Murashige and Skoog (MS), which for shoot proliferation was supplemented with 3% saccharose, vitamins, and 1mg·l^-1 BAP. Rooting was achieved using half strength of MS medium and saccharose, supplemented with 2.5mg·l^-1 of IBA and vitamins. Seed germination, shoot proliferation, and rooting were 96-100, 95-100 and 93-100%, respectively, in the three substrates and did not differ from the value of 95-100% in agar (P>0.05). Survival was higher (P<0.05) from seedlings obtained in the substrates (91-100%) than in the agar (48-51%). The substrates evaluated can be used instead of agar as a support in tissue culture, being less expensive and increasing seedling survival.

CULTIVO IN VITRO DE PADRÕES DE CÍTRICOS TOLERANTES AO VIRUS DA TRISTEZA, EMPREGANDO SUBSTRATOS INERTES ALTERNATIVOS AO ÁGAR

RESUMO

Avaliou-se o efeito dos substratos agrolita, vermiculita e "tezontle" como substitutos do ágar na germinação, multiplicação, enraizamento e sobrevivência de plântulas dos porta enxertos tolerantes ao virus da tristeza de cítricos (VTC) Citrus volkameriana, Citrumelo swingle e Citrange 35. O meio de cultivo utilizado foi o Murashige e Skoog (MS) adicionado na etapa de multiplicação com 3% de sacarose, vitaminas e BAP (1mg·l^-1). No enraizamento se diluíram os sais MS e a sacarose a 50% de sua concentração, adicionando-lhe também 2,5mg·l^-1 de AIB e vitaminas. A porcentagem de germinação, multiplicação e enraizamento foi de 96-100, 95-100 e 93-100%, respectivamente em todos os substratos utilizados, igual que no ágar, não mostrando diferenças estatísticas (P>0,05). Observou-se uma freqüência de dois brotos por explante em todos os tratamentos. A sobrevivência foi superior estatísticamente (P<0,05) nas plântulas que provinham do meio de cultivo com substratos inertes (91-100%) em relação aos brotos enraizados com ágar (48-51%). Os substratos inertes avaliados podem substituir como meio de suporte ao ágar no cultivo de tecidos, reduzindo o custo e melhorando a sobrevivência das plântulas.

PAALABRAS CLAVE / Agrolita / Citrange 35 / Citrus volkameriana / Citrumelo swingle / Cultivo de Tejidos / Vermiculita / Tezontle /

Recibido: 03/03/2006. Modificado: 22/07/2006. Aceptado: 25/07/2006.

Introducción

Los cítricos son de los frutales más importantes, con una producción en el 2003 de aproximadamente 98 millones USD. México ocupa el sexto lugar en producción en el mundo y esta actividad genera cerca de dos millones de jornales anuales (FAO, 2002). Los cítricos son susceptibles a una serie de enfermedades, plagas y condiciones adversas (edáficas, climáticas, etc.) que afectan su rendimiento (García, 1999; Carimi y Pasquale, 2003). Una de las enfermedades que potencialmente puede afectar la producción en México es el virus de la tristeza de los cítricos (VTC). En el estado de Veracruz se está en riesgo de perder cerca de 200000ha de cítricos por esta enfermedad; porque en la mayoría de las plantaciones utilizan como portainjerto al naranjo agrio (Citrus aurantium L. Osbeck), que fue el más usado en el mundo. Actualmente el empleo de este portainjerto está limitado, debido al alto grado de susceptibilidad que presenta al VTC cuando se injerta con otros cítricos, como la naranja dulce, por lo que debe ser sustituido por un porta injerto tolerante o resistente. En este sentido, es necesaria la propagación de patrones tolerantes, mediante técnicas de cultivo que garanticen la producción masiva de plantas libres de patógenos (Padrón, 2000; Murcia et al., 2002).

La multiplicación in vitro de especies de interés requiere de investigaciones que aseguren la obtención de brotes de buena calidad con un adecuado sistema radical, garantizando el éxito de la micropropagación y la inmediata adaptación de las plantas a las nuevas condiciones ambientales (Medina-Urrutia y Valdez-Verduzco, 1990; Singh, 2002; Cervera et al., 2004). Además, se tiene la ventaja de que al iniciar con material sano esta condición se mantiene, garantizando que este libre de patógenos al no estar expuesto a la intemperie.

En los estudios realizados hasta ahora, el medio de cultivo in vitro empleado para las diferentes especies se ha solidificado con agar y en otros casos se ha utilizado papel filtro como medio de soporte; ocasionando que al transferir las plántulas del medio in vitro a macetas se presente una baja sobrevivencia. Por ello existe la necesidad de estudiar otro tipo de sustratos que permitan servir como soporte y que sean fáciles de usar. El propósito del presente trabajo fue estudiar el efecto de diferentes sustratos inertes como sustitutos del agar en la multiplicación y enraizamiento in vitro, así como la sobrevivencia de plántulas de los porta injertos Citrus volkameriana, Citrumelo swingle y Citrange 35.

Materiales y Métodos

El medio de cultivo utilizado para toda la investigación fue el de Murashige y Skoog (1962; MS) y agar (Sigma^®) 6g·l^-1; adicionándole en la etapa de multiplicación bencilaminopurina (BAP) 1mg·l^-1. En el enraizamiento se diluyeron las sales inorgánicas MS al 50%, suplementándolo con 2,5mg·l^-1 de ácido indolbutírico (AIB) y vitaminas (mio-inositol 0,1; tiamina 0,1 y piridoxina 0,5mg·l^-1). Se ajustó el pH a 5,8 con KOH 1N o HCl 1N antes de adicionar el agar y los sustratos; se esterilizó en la autoclave a 120°C por 20 min. De acuerdo a la metodología de kataoka (1994), los sustratos inertes agrolita (Multiperl^MR), vermiculita (SINSEMILLLA STREET 3L) y tezontle (piedra volcánica porosa, de color negro o rojizo con diámetro variable de 5 a 15mm) se tamizaron para obtener una granulometría de 2,4 a 5mm, esterilizándose posteriormente en la autoclave a 120ºC por 20min. Se colocó 25ml del sustrato y 20ml del medio de cultivo en un frasco de vidrio de una capacidad de 120ml.

Las semillas de los patrones tolerantes Citrus volkameriana, Citrumelo swingle y C-35 se obtuvieron de árboles con buena producción y certificados libres de virus. Se eliminaron los tegumentos de las semillas y se desinfectaron por inmersión durante 1min en una solución de hipoclorito de sodio (Cloralex®) al 2,5% más 2 gotas de Tween 20; se enjuagaron 3 veces con agua destilada estéril. La preparación y posterior cultivo de las mismas se realizó bajo condiciones asépticas en campana de flujo laminar.

En cada frasco se colocaron 3 semillas para su germinación, cultivándose a una temperatura de 25ºC y un fotoperíodo de 16h luz / 8h oscuridad. A los brotes de 15 días de edad se les realizaron cortes internodales, colocando tres fracciones por frasco. Cada sección contenía un nudo. Los tratamientos fueron MS + Agrolita, MS + Vermiculita, MS + Tezontle, y MS + Agar (testigo). El diseño experimental fue completamente al azar; la unidad experimental estuvo constituida por 16 frascos que contenían 3 brotes cada uno. Este experimento fue repetido 4 veces. Las plántulas enraizadas se transfirieron a bolsas de polietileno negro de 20×25cm que contenían 5kg de sustrato (suelo, materia orgánica y arena de río en proporción 3:1:1) esterilizado (120ºC por 20min). Las plántulas se mantuvieron tapadas con plástico transparente para conservar la humedad, destapándolas paulatinamente durante 30 días, y después de este tiempo se descubrieron definitivamente. El porcentaje final de sobrevivencia se evaluó en este momento.

Los datos obtenidos se analizaron mediante el sistema de análisis estadístico SAS (SAS, 1997). Se realizó análisis de varianza y comparación de medias de Tukey (P<0,05).

Resultados y Discusión

Germinación

La germinación de las semillas de los patrones tolerantes Citrus volkameriana, Citrumelo swingle y Citrange 35 no presentó diferencias significativas entre tratamientos. En la Tabla I, se observa que C. volkameriana muestra 100% de semillas germinadas en los tratamientos con agar y vermiculita; en los tratamientos con agrolita y tezontle registró un porcentaje de germinación de 98-99 %. La tasa de germinación de los patrones tolerantes C. swingle y C- 35 fue de 95-99 %, tanto en medio solidificado con agar como con sustratos inertes.

Esta respuesta se debió probablemente a factores internos de las semillas, como su viabilidad, y no a los factores externos (temperatura, humedad, oxígeno y luz) que intervienen en el proceso de germinación. Al respecto, se puede señalar que la humedad relativa en los frascos con el medio de cultivo fue de 100%. Además, se mantuvieron a una temperatura constante de 25ºC y la luz no es un factor fundamental para la germinación de semillas en cítricos. La respuesta que se obtuvo con todos los sustratos y el agar con el medio MS, fue similar a los resultados obtenidos por diversos autores (Nestares et al., 1996; Germana et al., 2003; Hassanein y Azooz 2003; Karwa, 2003), quienes en especies de cítricos ubican al medio de cultivo y los reguladores de crecimiento como factores no decisivos en la germinación, dado que en éste proceso intervienen grupos hormonales, inhibiendo o activando el crecimiento de las plántulas. Los resultados obtenidos muestran que el proceso de germinación se puede dar tanto en medio de cultivo solidificado con agar como en medio de cultivo donde se adicionaron los sustratos inertes vermiculita, agrolita o tezontle. Por otra parte, el costo de 1kg de agar es de 2026 USD y alcanza para 8300 frascos de medio de cultivo, con un costo por frasco de USD 0,2440. En comparación, 1kg de vermiculita, que es el sustrato inerte mas caro, cuesta USD 5,9 y alcanza para 40 frascos, con un costo por frasco de USD 0,1475, resultando 1,69 veces mas caro el agar. Además el comportamiento de la semilla fue estadísticamente similar en ambos medios de cultivo, por lo que los sustratos inertes pueden sustituir al agar.

Multiplicación

En la formación de brotes de C. volkameriana, C. swingle y Citrange 35, no se encontraron diferencias estadísticas. Se puede observar en la Tabla I que los tratamientos donde al medio de cultivo se le adicionó los sustratos inertes presentaron una formación de brotes estadísticamente similar al tratamiento solidificado con agar, en los tres patrones evaluados. El patrón C-35, produjo un 95% de brotes cuando al medio de cultivo se le adicionó agar y en los sustratos inertes se obtuvo un porcentaje del 96-97% de brotes. En la Figura 1 se observa que el número de brotes formados mas frecuente fue 2 y 3 por explante, y al comparar los patrones se aprecia que C. volkameriana obtiene la mayor frecuencia en comparación con C. swingle y C-35. Estos resultados indican que el medio de cultivo estimula las yemas para obtener los brotes, no observándose ningún efecto de los sustratos. Este efecto presentó similitud con lo reportado por Kobayashi et al. (2003), quienes mencionan que el tipo de medio y los reguladores del crecimiento son los factores más importantes para obtener una estimulación de las yemas y asegurar una buena formación de brotes. En relación al efecto de los reguladores de crecimiento en el medio de cultivo en limón (Citrus aurantifolia) se encontró que el medio MS suplementado con bencilaminopurina incrementa hasta un 55% la formación de brotes (Al-Bahrany, 2002). Así mismo, Rana y Ranvir (2002a) obtuvieron un incremento en el número y largo de brotes de lima Kagzi (C. aurantifolia), cuando al medio de cultivo le adicionaron 1,5mg·l^-1 de bencilaminopurina (BAP), 2,5mg·l^-1 de ácido indolbutirico (AIB) y 7g·l^-1 de agar. Sin embargo, al incrementarse la concentración a 2mg·l^-1 de BAP y 3mg·l^-1 AIB, se reduce el número de brotes por explante en C. aurantifolia (Rana y Ranvir, 2002b).

En los brotes emitidos no se presentaron diferencias entre los sustratos inertes y el agar, lo que indica que su función principal es de soporte para los explantes, permitiendo además la disposición de nutrientes. Es decir, se puede utilizar cualquiera de los tres sustratos, vermiculita, agrolita o tezontle, en sustitución del agar en el medio de cultivo ya que permiten la absorción de nutrientes.

Enraizamiento

Los datos obtenidos en la formación de raíces mostraron que no hubo diferencias estadísticas significativas entre tratamientos. En la Tabla I se observa que los patrones tolerantes C. volkameriana y C-35 presentaron el 100% de brotes enraizados en agar, mientras que C. swingle produjo 98%; en los demás sustratos el porcentaje de brotes enraizados no fue menor al 93%, para los tres porta injertos. Esta respuesta muestra que la formación de raíces se dio por la adición de los reguladores de crecimiento y la concentración de las sales inorgánicas del MS, diluidas al 50% en el medio de cultivo y no por la adición del agar, agrolita, vermiculita o tezontle. Resultados similares han sido reportado por diferentes investigadores que corroboran que la combinación de hormonas promueve el enraizamiento. Karwa et al. (2004) mencionan que la combinación AIB, BAP y ANA induce más del 60% de brotes enraizados en C. sinensis L. En lima Kagzi se obtuvo el 92% de enraizamiento con BAP 0,2mg + 0,1mg ANA cuando se utilizó C. aurantifolia y C. reticulata Blanco. A la misma combinación adicionándole 2,5mg·l-1 de paclobutrazol, se obtuvo el 87,7% de brotes enraizados de C. aurantifolia y el 52% en C. reticulata (Singh et al., 2003). Así mismo, la respuesta de Mandarina Kinnow al adicionar AIB en concentración de 0,5mg·l^-1 al medio de cultivo, fue de 68,8% de brotes enraizados (Kumar et al., 2001; Vijayakumari y Shyam, 2001; Al-Bahrany, 2002). Con esta perspectiva, donde la combinación de hormonas y la dilución de sales MS al 50% induce al enraizamiento de los brotes, se puede utilizar entonces en el medio de cultivo los sustratos inertes en lugar de agar, ya que ambos sirven como soporte en el medio de cultivo.

Sobrevivencia

Los resultados presentados en la Figura 2 muestran que el mayor porcentaje de plántulas que sobrevivieron a la aclimatación para los tres portainjertos fueron aquellas que provenían del medio de cultivo donde se adicionaron los sustratos vermiculita, agrolita y tezontle en una disminución gradual aunque no significativa, mostrando una respuesta de 91-100%; en comparación con aquellos brotes que provenían del medio de cultivo con agar donde la sobrevivencia fue 48-50%. Las plántulas provenientes del medio de cultivo solidificado con agar se dañaron al lavar sus raíces y sufrieron estrés. Esto no sucedió en el caso de las plántulas en los sustratos inertes, ya que al pasarlas de in vitro a ex vitro el sustrato queda adherido a sus raíces, no sufren daño y el estrés es menor.

Estos resultados guardan relación con lo observado por McClelland et al. (1990), quienes al usar vermiculita para la multiplicación de papaya in vitro encontraron que las raíces tienen mayor aireación por estar en un medio más poroso, lo cual favorece la sobrevivencia de las plántulas al pasarlas a macetas. En contraste, las plántulas obtenidas en el medio de cultivo con agar sufren una hipertrofia en sus raíces y el espacio intercelular es mayor, lo que limita la absorción de agua y reduce la sobrevivencia; aunado a la susceptibilidad que presentan las plántulas al ataque de hongos y bacterias, porque la corteza queda desnuda al lavar el agar.

Lo anterior contrasta con lo reportado por Hazarika et al. (2002), quienes mencionan que el protocolo para la aclimatación de C. reticulata, C. nobilis x C. deliciosa, C. volkameriana y C. reshini se llevó acabo con la adición de paclobutrazol al medio de cultivo, incrementando la sobrevivencia de las plantas hasta en un 97%. En pectinifera (C. depressa Hayata) se obtuvo el 70% de sobrevivencia de plantas que provenían del medio liquido MS suplementado con BAP (Gill y Gosal, 2002). En plantas de Citrange que provenían de medio MS sin raíces secundarias sobrevivió el 12% y de aquellas que presentaban raíces secundarias sobrevivió el 25% (Plastira y Karetsos, 2003). Los porcentajes de sobrevivencia obtenidos indican que los sustratos inertes incrementan la sobrevivencia de las plántulas provenientes de medio de cultivo in vitro al pasar a condiciones ex vitro.

El uso de sustratos inertes permitió comprobar que la función principal del agar para la germinación, brotación y formación de raíces es la de soporte. El medio de cultivo y los reguladores del crecimiento y vitaminas utilizados son los que determinan el porcentaje de brotación y enraizamiento. Aunque a partir del agar se presentó una disminución gradual de éstos parámetros para la vermiculita, agrolita y tezontle, ésta no fue estadísticamente significativa. La sobrevivencia se incrementó significativamente con el uso de los sustratos inertes, porque al pasar las plántulas a las macetas sus raíces no se dañaron. Estos resultados abren la posibilidad de usar sustratos económicos y que reduzcan los efectos del estrés que sufren las plántulas al cambiarlas de condiciones de desarrollo, permitiendo explorar su uso comercial por la posible reducción en costos.

Conclusiones

Los resultados permitieron comprobar la existencia de alternativas viables para la sustitución del agar por sustratos inertes. Comparando el agar con los sustratos inertes agrolita, vermiculita y tezontle en la germinación y en la formación de brotes y raíces de los patrones C. volkameriana, C. swingle y C- 35, no hubo diferencias entre ellos, por lo que los sustratos inertes pueden ser utilizados en sustitución del agar. La adición de los sustratos inertes al medio de cultivo en la etapa de enraizamiento para los tres porta injertos aumentó el porcentaje de sobrevivencia de las plántulas. La incorporación de sustratos alternativos al agar incrementa la sobrevivencia hasta en un 50%, obteniendo en algunos casos hasta un 100% de sobreviviencia.

Agradecimientos

Los autores agradecen al consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) de México por la concesión de una beca (2004-2006) y al Colegio de Postgraduados por los fondos para la investigación.

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