Caracterización de un tobamovirus aislado de plantas de canavalia (canavalia ensiformis l.) En una parcela experimental del edo. Aragua, venezuela

Eduardo Ortega, Karla Zambrano, Octavio Carballo, Mirtha Romano y Edgloris Marys

Eduardo Ortega. Ingeniero Agrónomo, Universidad Rómulo Gallegos, Venezuela. Estudiante Graduado, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC). e-mail: eortega@ivic.ve

Karla Zambrano. Ingeniera Agrónoma, Universidad Centro-Occidental Lisandro Alvarado, Venezuela. M.Sc. en Biología, IVIC, Venezuela. e-mail: kzambran@ivic.ve

Octavio Carballo. Licenciado en Biología, Universidad Central de Venezuela (UCV). M.Sc. en Biología, IVIC. Profesional Asociado a la Investigación, IVIC, Venezuela. e-mail: ocarball@ivic.ve

Mirtha Romano. Técnica en Microscopía Electrónica, UCV. Técnica Asociada a la Investigación, IVIC, Venezuela. e-mail: mromano@ivic.ve

Edgloris Marys. Licenciada en Educación, Universidad Católica Andrés Bello, Venezuela. M.Sc. en Biología y Doctor en Biología, IVIC, Venezuela. Investigadora, IVIC, Venezuela. Dirección: Centro de Microbiología y Biología Celular, IVIC, CMBC, Apartado Postal 21827, Caracas, 1020-A, Venezuela.e-mail: eemarys@ivic.ve

RESUMEN

Se identificó un Tobamovirus infectando el cultivo de canavalia en una parcela experimental del estado Aragua, Venezuela. El rango de hospedantes y las pruebas serológicas basadas en la técnica de Western blot, permitieron determinar que el virus en estudio es un aislamiento del virus del mosaico del tabaco (TMV). Este resultado fue confirmado por el análisis de secuencia del gen de la proteína de la cápside, amplificado mediante RT-PCR, el cual reveló una identidad cercana al 98% entre el aislamiento descrito en esta investigación y cepas de TMV reportadas en Korea y Japón.

Characterization of a tobamovirus isolated from canavalia (canavalia ensiformis l.) In an experime ntal parcel at aragua state, venezuela

SUMMARY

A Tobamovirus has been identified as being involved in a disease of canavalia in an experimental plot in the state of Aragua, Venezuela. Results from indicator plants and serological tests based on Western blots suggested that the Tobamovirus was a strain of tobacco mosaic virus (TMV). This was confirmed from the full sequence of the coat protein gene. Sequence analysis revealed that TMV isolated from diseased canavalia had a high identity (~98%) with TMV vulgare type sequences reported from Korea and Japan.

Caracterização de um tobamovirus isolado de plantas de canavalia (canavalia ensiformis l.) Em um loteamento experimental do edo. Aragua, venezuela

RESUMO

Identificou-se um Tobamovirus infetando o cultivo de canavalia em um loteamento experimental do estado Aragua, Venezuela. A faixa de hospedeiros e as provas sorológicas baseadas na técnica de Western blot, permitiram determinar que o vírus em estudo é um isolamento do vírus do mosaico do tabaco (TMV). Este resultado foi confirmado pela análise de seqüência do gene da proteína da cápside, amplificado mediante RT-PCR, o qual revelou uma identidade perto de 98% entre o isolamento descrito nesta investigação e cepas de TMV reportadas na Coréia e no Japão.

PALABRAS CLAVE / Canavalia ensiformis / Infección Viral / RT-PCR / Tobamovirus / Venezuela /

Recibido: 17/04/2006. Modificado: 12/01/2007. Aceptado: 26/01/2007.

Introducción

La producción de rumiantes en Venezuela se ha basado tradicionalmente en el pastoreo sobre gramíneas forrajeras, las cuales presentan limitaciones nutricionales que restringen la expresión reproductiva, el crecimiento y la producción de leche de la población animal. En este contexto, se evalúan materias primas vegetales de origen tropical que puedan sustituir a las importadas y/o integrarse a los sistemas de alimentación de rumiantes. Entre las posibles fuentes de materia prima, se ha propuesto a la canavalia (Canavalia ensiformis L.) como una planta que puede jugar un papel relevante, debido a sus características nutricionales y agronómicas, y por su posible uso como planta conservadora de suelos al utilizarse como abono verde o cultivo de cobertura (Ramis et al., 1994).

Una de las principales desventajas de esta leguminosa es su susceptibilidad de ser infectada por virus. A nivel mundial, se han identificado doce virus que infectan este cultivo, pertenecientes a los grupos Nepovirus, Potyvirus, Carlavirus, Comovirus, Geminivirus y Caulimovirus (Brunt et al., 1996).

En Venezuela, aunque existen reportes sobre síntomas de origen viral asociados al cultivo de la canavalia (Alagares et al., 1988; Olivares y Viera., 1991; Ramis et al., 1994), ninguna de estas virosis ha sido identificada mediante métodos serológicos y/o moleculares hasta el presente. Se reconoce que de presentarse con mucha frecuencia e intensidad, estos síntomas podrían causar problemas económicos (Ramis et al., 1994).

Durante muestreos recientes realizados en ensayo de riego de canavalia se observaron plantas con síntomas tales como mosaico severo, ampollamiento y distorsión de la lámina foliar, y poco desarrollo. La presente investigación se llevó a cabo con el objetivo de determinar la asociación entre los síntomas observados y una posible etiología de origen viral. Avances de esta investigación fueron presentados en forma de resúmen (Marys et al., 2004).

Materiales y Métodos

Material vegetal

Hojas jóvenes de plantas de Canavalia ensiformis (L.) DC presentando síntomas típicos de infecciones virales, fueron colectadas en una parcela experimental localizada en la Facultad de Agronomía de la Universidad Central de Venezuela, en Maracay, Estado Aragua, durante el año 2004. Las muestras fueron transportadas al laboratorio de Biotecnología y Virología Vegetal del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), en bolsas plásticas sobre hielo, y almacenadas a -70°C hasta el momento de ser analizadas.

Bioensayos con plantas indicadoras y establecimiento de un cultivo viral

A partir del material vegetal recolectado se prepararon macerados en una solución de 1% K₂HPO₄ + 0,1% Na₂SO₃ 1:5 (p/v). Con estos extractos se inocularon mecánicamente una serie de especies de plantas indicadoras (Tabla I), previamente cubiertas con un abrasivo (Carburundum 600). Las hojas se lavaron inmediatamente con agua, y las plantas se mantuvieron en invernaderos a prueba de insectos, con fotoperíodo natural y temperaturas medias de 25 ±2 y 17 ±2°C de día y de noche. Las plantas inoculadas fueron observadas hasta la aparición de síntomas visibles.

Purificación viral

El virus aislado fue purificado a partir de hojas de Nicotiana tabacum var. Sansum infectadas sistémicamente, según el protocolo descrito por Gooding y Hebert (1967).

Ensayos serológicos

Con la finalidad de conocer la relación serológica entre el virus purificado y otros virus de morfología similar, se realizaron inmunoblots según el protocolo descrito por Towbin et al., 1979. Para ello, 0,5ng/ml de virus purificado fueron fraccionados mediante electroforesis en geles de SDS-PAGE al 12%. Los geles conteniendo las bandas proteicas fueron transferidos a membranas de nitrocelulosa de 0,45mm (Sigma) en una celda Mini-Transblot II (Bio-Rad, Hercules, CA, EEUU) a 70V durante 2h, en una solución de 50mM Tris-Base; 380mM glicina; 0,1% SDS (p/v) y 20% metanol (v/v). Las membranas electrotransferidas conteniendo la proteína de cápside viral se incubaron con los anticuerpos policlonales (0,1ng/ml) contra los siguientes virus (American Type Culture Collection ATCC, Rockville, Maryland, EEUU): TMV (Tobacco mosaic virus), ORSV (Odontoglosum ringspot), CGMMV (Cucumber green mottle mosaic), PMMV (Pepper mild mosaic), FrMV (Frangipani mosaic) y KGMMV (Kyuri green mottle mosaic). Posteriormente, las membranas se lavaron con 3 cambios de tampón fosfato salino (PBS), incubándose a continuación con una solución de IgGs anticonejo conjugadas a peroxidasa (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EEUU) diluida 1:1000 en PBS. Luego de tres lavados con PBS, las membranas se incubaron con el sustrato (6mg/ml diaminobenzidina en 10ml de tampón Tris-HCL 50mM) conteniendo 10µl de H₂O₂, hasta la aparición de las bandas. La reacción se detuvo descartando el revelador y añadiendo PBS a las membranas.

Microscopía electrónica

Las preparaciones virales purificadas fueron absorbidas sobre rejillas previamente ionizadas y cubiertas con una capa de colodión y carbón por 3min a temperatura ambiente. Posteriormente, las rejillas se tiñeron negativamente con fototungstato de sodio al 2%; pH 6,8 para su observación en un microscopio electrónico Phillips CM-10 (Eindhoven, Holanda). El promedio de la longitud y el diámetro de 100 partículas virales fue determinado por comparación con estándares internos del microscopio electrónico.

Las posibles alteraciones ultraestructurales fueron analizadas en trozos de tejidos foliares de aproximadamente 1mm² removidos del área central de hojas de canavalia y de otras especies de plantas hospedantes mostrando síntomas de mosaico severo y distorsión. Los tejidos foliares fueron procesados para su observación al microscopio electrónico siguiendo el protocolo descrito por Martelli y Russo (1984). Los tejidos fueron prefijados por 24h en una solución de glutaraldehido al 2% (p/v) en tampón cacodilato 0,1M; pH 7,3. Los tejidos fueron posteriormente fijados en tetróxido de osmio, deshidratados en una serie creciente de etanol y, después de un cambio a óxido de propileno, fueron embebidos en resina Medcast. Los bloques se seccionaron utilizando un ultramicrotomo Sorvall MT-2 con cuchilla de diamante. Los cortes se colocaron sobre rejillas de níquel y se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo para su observación al microscopio electrónico. Como controles se incluyeron secciones de hojas sanas de canavalia.

RT-PCR

La identificación y caracterización molecular del virus aislado en esta investigación se realizó mediante trascripción reversa (RT) seguida por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para ello, se extrajo ARN a partir de 0,1g de material vegetal infectado y sano, utilizando el reactivo TRIZOL^® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EEUU) según el protocolo recomendado por la casa comercial. Los ácidos nucléicos así extraídos se resuspendieron en 20µl de agua estéril y se guardaron a -70°C hasta su uso. La reacción de RT se llevó a cabo utilizando un kit de síntesis de ADN copia (ADNc; Invitrogen) y cebadores al azar. El ADNc se utilizó posteriormente como molde en una reacción de PCR, empleando como cebadores los oligonucleótidos específicos TMV-CP-F (5’CGCCGAATCGGATTCGTT3’) y TMV-CP-R (5’TTATGCATCTTGACTACC3’), según Spence et al. (2001). El control positivo empleado fue ADNc proveniente de purificaciones virales de TMV existentes en el banco de virus del Laboratorio de Biotecnología y Virología Vegetal (IVIC). Como control negativo se utilizó ARN obtenido a partir de plantas sanas como molde para la reacción de RT-PCR. Los productos de la reacción de RT-PCR fueron analizados bajo luz UV en geles de agarosa al 1,5% y teñidos con bromuro de etidio.

Clonaje, secuenciación y análisis filogenéticos

Los fragmentos de ADN obtenidos en la reacción de PCR fueron clonados en vectores comerciales (TA; Invitrogen) siguiendo las recomendaciones de la casa comercial. Los plásmidos recombinantes fueron purificados mediante un estuche comercial (Gibco, BRL, Madison, EEUU) y secuenciados automáticamente en ambos sentidos en un secuenciador automático (ABI Prism 377, Applied Biosystems, California, EEUU).

Las secuencias obtenidas fueron editadas y alineadas utilizando el programa DNAman versión 5.2.2 (Lynnon Biosoft, Quebec, Canadá) y comparadas con secuencias depositadas en el GenBank utilizando el programa BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). La secuencia descrita en este trabajo se encuentra depositada en el GenBank bajo el número de acceso DQ211985.

Resultados

Sintomatología

Durante visitas realizadas a la parcela experimental de canavalia en el 2004, se observaron plantas con sintomatología atribuible a infección viral. En general, las hojas de las plantas con síntomas mostraban mosaico severo, ampollamiento y distorsión (Figura 1).

Figura 1. Síntomas asociados a la infección por TMV en plantas de canavalia: la hoja muestra deformación ampollamiento (a) y mosaico (b)

Rango de hospedantes

El tipo de síntomas desarrollados por las diferentes especies de plantas inoculadas con extractos crudos de plantas sintomáticas se muestra en la Tabla I. Del grupo de especies utilizadas para los ensayos de determinación del rango de hospedantes, Capsicum annum, Glycine max y Solanum tuberosum resultaron no ser susceptibles a la infección, mientras que en las demás ésta le fue transmitida mecánicamente, mostrando los síntomas señalados en la Tabla I. En todos los casos, la infección fue verificada mediante ensayos de RT-PCR.

Microscopía electrónica

El examen de extractos crudos de tejido proveniente de plantas sintomáticas, así como de las preparaciones virales purificadas, reveló la presencia de filamentos rígidos, de un tamaño promedio de 500×12nm (Figura 2), típicos del grupo de los Tobamovirus.

Figura 2. Fotomicrografía electrónica de una preparación purificada del virus aislado de plantas de canavalia. Barra:226nm.

Tanto en plantas de canavalia infectadas en el campo, como en aquellas inoculadas mecánicamente, se observaron las mismas alteraciones ultraestructurales, relacionadas con la morfología externa de los cloroplastos, como la acumulación masiva de gránulos de almidón y desorganización de las granas (Figura 3). Por otro lado, en la mayoría de las células, se localizaron agregados paracristalinos de partículas virales (Figura 4). Ninguna de estas alteraciones se detectó en células de tejido sano.

Figura 3. Alteraciones ultraestructurales inducidas por TMV en C. ensiformis. Barra: 500nm.

Figura 4. Agregados paracristalinos de partículas virales TMV en C. ensiformis. Barra: 500nm.

Serología

Las preparaciones virales purificadas reaccionaron en los inmunoblots con anticuerpos dirigidos contra la proteína de la cápside de los virus TMV, Odontoglosum ringspot y Frangipanic mosaic; observándose una banda de reconocimiento antígeno-anticuerpo más intensa con el virus TMV (Figura 5).

Figura 5. Detención de aislamiento del virus TMV en canavalia mediante Western blot con antisueros contra 2) TMV, 3) ORSV, 4) FrMV.*:18kDa.

RT-PCR

Los oligonucleótidos TMV-CP-R y TMV-CP-F utilizados en esta investigación, dirigieron exitosamente la amplificación de un segmento de ADN de 450pb en la reacción de PCR cuando se utilizó como molde ARN proveniente de plantas enfermas, o extraído a partir de purificaciones virales (Figura 6). Las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas deducidas del fragmento obtenido fueron 96-98% y 98-100% idénticas, respectivamente, al gen de la proteína de cápside del TMV aislados de Korea y Japón, depositadas en el GenBank bajo los números de acceso J02415 y X68110.

Figura 6. Detención de aislamiento del virus TMV en canavalia mediante reacción en cadena de la polimerasa. 1: Marcadores de peso molecular, 2;TMV U1 purificado, 3: TMV-orq purificado, 4:extracto foliar de canavalia infectada, 5: extracto foliar de canavalia sana. *: 500pb.

Discusión

La identificación y diagnóstico acertado es el primer paso para el establecimiento de un programa exitoso de manejo de agentes patógenos. Esto es especialmente válido para los virus que infectan el cultivo de la canavalia en Venezuela, los cuales no han sido caracterizados a nivel molecular.

Los resultados obtenidos proveen evidencia experimental sobre la infección de la especie C. ensiformis con el virus del mosaico del tabaco (TMV) en condiciones naturales en Venezuela. Este trabajo constituye el primer reporte sobre la infección del cultivo de canavalia por un virus del grupo de los Tobamovirus. La identidad del virus fue verificada mediante microscopía electrónica, inmunoblot y métodos moleculares. El análisis de la secuencia nucleotídica del TMV aislado de canavalia sugiere que es una cepa del tipo vulgar, sin cambios significativos dentro del gen de la proteína de cápside.

El método de RT-PCR descrito representa una gran ventaja como herramienta de diagnóstico molecular, ya que al utilizar oligonucleótidos al azar como cebadores durante la reacción de trascripción reversa, el ADNc generado puede utilizarse para amplificar cualquier virus para los cuales se disponga óligos específicos. Dado que el cultivo de la canavalia es susceptible de ser infectado por lo menos por 13 virus pertenecientes a 6 grupos diferentes (incluyendo el descrito en este reporte), la generación de ADNc sintetizado al azar resulta muy ventajosa para el diagnóstico por PCR, al reducir el tiempo y los costos de la prueba.

La estructura del virus TMV es muy estable, y este puede permanecer por largo tiempo latente en material vegetal infectado (Brunt et al., 1996). Además, es transmitido mecánicamente a través de prácticas agro-culturales, por lo que se recomienda tomar medidas pertinentes con la finalidad de evitar la contaminación de otros cultivos con TMV en la misma parcela experimental.

REFERENCIAS

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