DESARROLLO DE UNA HERRAMIENTA DE DIAGNÓSTICO PARA EL VIRUS DE LA HOJA BLANCA DEL ARROZ EN VENEZUELA

Edgloris Marys y Octavio Carballo

Edgloris Marys. Licenciada en Educación, Mención Ciencias Biológicas, Universidad Católica Andrés Bello, Venezuela. M.Sc. en Biología y Doctor en Biología, Mención Microbiología, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC). Investigadora, IVIC, Venezuela. Dirección: Centro de Microbiología y Biología Celular, IVIC. Apartado 21827, Caracas 1020A, Venezuela. e-mail: eemarys@ivic.ve

Octavio Carballo. Licenciado en Biología, Universidad Central de Venezuela. M.Sc. en Biología, IVIC, Venezuela. Profesional Asociado a la Investigación, IVIC, Venezuela. e-mail: ocarball@ivic.ve

RESUMEN

Se describe el desarrollo de un ensayo de diagnóstico del tipo DAS-ELISA para la detección del virus de la hoja blanca del arroz (RHBV) en Venezuela. El virus fue aislado y caracterizado parcialmente a partir de material vegetal infectado proveniente de los estados Portuguesa y Guárico. Se obtuvieron inmunoglobulinas (IgGs) altamente específicas que reaccionaron contra el virus en diluciones de 1:1000 en los inmunoensayos. De acuerdo con los análisis serológicos, la incidencia del virus en las principales regiones productoras de arroz durante los años muestreados fue muy baja (11%), posiblemente debido a la siembra de líneas de arroz resistentes al virus en los estados encuestados y/o a la baja incidencia del insecto vector (Sogatodes orizicola) durante las estaciones de colecta. El desarrollo de este método de diagnostico permitirá en el futuro la certificación fitosanitaria de material vegetal libre de RHBV.

DEVELOPMENT OF A DIAGNOSTIC TOOL FOR THE RICE "HOJA BLANCA" VIRUS IN VENEZUELA

SUMMARY

The development of a DAC-ELISA assay for the diagnosis of Rice hoja blanca virus (RHBV) in Venezuela is reported. The virus was isolated and partially characterized from infected rice samples collected in the states of Portuguesa and Guárico. Highly specific immunoglobulin (IgGs) to virus particles reacted in 1:1000 dilution, when tested against viral particles by immunoassay. According to serological data, the incidence of RHBV in the main rice growing states was low (11%), possibly due to the use of resistant rice lines by local farmers and/or to the low incidence of the virus vector, the insect Sogatodes orizicola. The diagnostic will allow phytosanitary certification of RHBV free material.

DESENVOLVIMENTO DE UMA FERRAMENTA DE DIAGNÓSTICO PARA O VÍRUS DA FOLHA BRANCA DO ARROZ NA VENEZUELA

RESUMO

Descreve-se o desenvolvimento de um ensaio de diagnóstico do tipo DAS-ELISA para a detecção do vírus da folha branca do arroz (RHBV) na Venezuela. O vírus foi isolado e caracterizado parcialmente a partir de material vegetal infectado proveniente dos estados Portuguesa e Guárico. Obtiveram-se imunoglobulinas (IgGs) altamente específicas que reagiram contra o vírus em diluições de 1:1000 nos imunoensaios. De acordo com as análises sorológicas, a incidência do vírus nas principais regiões produtoras de arroz durante os anos de amostragem foi muito baixa (11%), possivelmente devido à plantação de linhas de arroz resistentes ao vírus nos estados pesquisados e/ou à baixa incidência do inseto vetor (Sogatodes orizicola) durante as estações de colheita. O desenvolvimento deste método de diagnóstico permitirá no futuro a certificação fitossanitária de material vegetal livre de RHBV.

PALABRAS CLAVE / Arroz / Diagnóstico / Hoja Blanca / Incidencia / Venezuela / Virus /

Recibido: 06/03/2006. Modificado: 01/02/2007. Aceptado: 02/02/2007.

Introducción

En las regiones de mayor producción de arroz a nivel mundial, las enfermedades causadas por virus han restringido el rendimiento o dañado considerablemente numerosas extensiones de cultivo. Actualmente se reconocen 30 virus capaces de infectar el cultivo del arroz en el mundo (Hibbino, 1996), de los cuales dos están presentes en el continente americano: el virus de la hoja blanca del arroz (RHBV; Rice hoja blanca virus; Morales y Niessen, 1985), y el virus del entorchamiento del arroz (RSNV, Rice stripe necrosis virus; Morales et al., 1999).

El virus de la hoja blanca (RHBV) se encuentra en Centro y Sur América, en el Caribe, y desde 1957-1959 en el sur de los EEUU (Hibbino, 1996). La primera epidemia causada por RHBV en América Latina tuvo lugar durante los años 1956-1967. RHBV es un miembro de la familia de los Tenuivirus (Brunt et al., 1996). Las partículas virales son filamentosas, de 3nm de diámetro y poseen un genoma constituido por varios fragmentos de ARN de cadena simple, de polaridad positiva y negativa.

El primer síntoma de la enfermedad producida por el RHBV es la aparición de una o más franjas blancas o moteadas en las hojas, que posteriormente pueden cubrir completamente la hoja o pueden permanecer variegadas. En casos severos la hoja afectada se torna amarilla y luego se seca lentamente. La esterilidad parcial o total de la inflorescencia es común en plantas afectadas. Los granos formados son alargados y delgados. En las plantas pueden aparecer macollas sanas y enfermas, notándose en las enfermas tallos de color verde más claro, más delgados y achaparrados que los de las sanas. Las plantas infectadas con RHBV muestran enanismo y bandas cloróticas y moteadas en las hojas. El virus es transmitido de manera persistente por el vector Sogatodes orizicola, en el que se propaga y se transmite a nuevas generaciones de insectos. En Venezuela, estos síntomas han sido descritos en las principales regiones productoras de arroz (Nass y Rodríguez, 1983). Las pérdidas económicas ocasionadas por el virus en los Llanos Centrales son millonarias.

Desde hace algunos años, investigaciones llevadas a cabo por fitomejoradores venezolanos, han recomendado la siembra de líneas de arroz resistentes a la infección por RHBV. Sin embargo, si estas plantas se infectan antes de los 25 días después de plantadas, desarrollan la enfermedad y mueren.

Otro de los virus que limita actualmente la producción de arroz en Latinoamérica, particularmente en Colombia, es el virus que produce la enfermedad conocida como "entorchamiento", en la que las hojas de plantas infectadas muestran malformación severa y crecimiento en forma de zig-zag, clorosis y posterior necrosis. El crecimiento de las plantas se ve reducido severamente, y cuando las plantas son infectadas en un estadio temprano del crecimiento, suelen morir en corto tiempo. En Colombia, se atribuyen a esta virosis pérdidas cercanas al 50% de los cultivos, y muchas áreas dedicadas tradicionalmente al cultivo de arroz han sido abandonadas (Morales et al., 1999). El virus causante del entorchamiento, denominado Rice stripe necrosis furovirus (RSNV), se transmite a través del hongo Polymyxa graminis, y fue identificado por primera vez en África. Hoy se piensa que el virus está presente en todas las principales regiones productoras de Colombia, donde se sospecha que fue introducido a través de un intercambio de germoplasma proveniente de África (Morales et al., 1999). Cabe destacar que en Venezuela se siembran numerosas variedades o "líneas" de arroz provenientes de Colombia, las cuales se seleccionan por su capacidad de adaptarse a las condiciones edafo-climáticas de los llanos venezolanos y por su resistencia a diversas enfermedades.

A pesar de las cuantiosas pérdidas económicas que se producen en las regiones productoras de arroz atribuibles a plagas y enfermedades, no existe un censo reciente en relación a la identificación e incidencia de infecciones virales, y no existen sistemas de diagnósticos producidos en el país, disponibles para los laboratorios de fitopatología. Por ello, el objetivo de este trabajo fue la identificación de las principales virosis que infectan el cultivo del arroz, y la producción de herramientas de diagnóstico adecuadas para éstas, con la finalidad de iniciar un plan de vigilancia, censo y control de enfermedades de origen viral en el país.

Materiales y Métodos

Colecta de las muestras

Se colectaron 270 plantas de arroz de las variedades FUNDARROZ PN-1, ARAURE 3 y CIMARRON, de aproximadamente de un mes de edad, en campos experimentales pertenecientes y/o cercanos al Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA), núcleos Portuguesa y Guárico, Venezuela, durante 2003-2005. Las muestras fueron tomadas durante dos visitas anuales a los campos. En cada campo se siguió un patrón de muestreo en forma de W, según se describe en Lin et al. (1979), registrándose el tipo de cultivar en aquellas plantaciones donde esa información fue disponible, así como los síntomas de posible origen viral. Las muestras fueron debidamente identificadas y transportadas al laboratorio en bolsas plásticas sobre hielo, donde se almacenaron a 4°C hasta el momento de su utilización.

Inmunoensayos

La determinación preliminar de la incidencia de las virosis que afectan actualmente el cultivo del arroz en Venezuela se realizó mediante ensayos inmunoenzimáticos del tipo DAS-ELISA (Clark y Adams, 1997). Para ello se utilizaron placas de microtitulación Inmulon I (Dynatech Lab. Inc.), las cuales se sensibilizaron durante 12h a 4°C con los anticuerpos policlonales adquiridos comercialmente y diluídos 1:1000 en tampón carbonato-bicarbonato (TCB) 0,05M, pH 9,5. Después de lavar con Tween 20 al 0,1% en tampón fosfato salino (PBS-T), pH 7,4, las placas de microtitulación fueron cubiertas con los extractos antigénicos de las plantas. Para preparar los antígenos, 0,1g de hojas fueron maceradas en tubos de microcentrífuga con 1ml de 0,1M TCB. A las placas se agregaron 100μl de estos extractos foliares en diluciones 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 y 1:100, y se incubaron por 2h a 37°C. Igualmente, las placas se sensibilizaron con alícuotas de 100μl de virus purificado (0,1; 0,5 y 1ng/ml en TCB), que sirvieron como controles positivos. Posteriormente, los pozos de las placas se lavaron con PBS-T. Para bloquear los sitios no reactivos, las placas fueron cubiertas con 100μl/pozo de una soluciσn de 1% BSA en PBS-T, seguido de incubación por 30min a 37°C. A continuación, las placas se lavaron nuevamente con PBS-T y se cubrieron con alícuotas de 100μl de los diferentes anticuerpos diluidos 10^-2; 10^-3; 10^-4 y 10^-5 en tampón PBS-T. Luego de 60min de incubación a 37°C, las placas se lavaron 3 veces con PBS-T, agregándose posteriormente 100μl/pozo del sustrato (1mM p-nitrofenilfosfato y 1mM CaCL2 en 50M tampón dietanolamina, pH 9,5), dejándose incubar a 37°C durante 60min. La reacción colorimétrica se detuvo mediante la adición de 50μl/pozo de 0,5N NaOH, y se cuantificó en un espectrofotómetro Multiskan MK II (Labsystem Inc., Vancouver, Ca), utilizando un filtro de 460nm. Como controles negativos, se incluyeron en el ensayo extractos de hojas de arroz libres de virus y de tampón carbonato. Los controles positivos consistieron en extractos de hojas infectadas con los virus aislados, así como virus purificados. Cada muestra se agregó por triplicado, y se tomaron como valores positivos aquellos cuyo promedio de densidad óptica fue tres veces mayor que el control negativo en cada caso (Sutula et al., 1986).

Purificación de partículas virales

Se homogeneizaron 100g de hojas previamente probadas positivas por ELISA para el RHBV, con tres volúmenes (p/v) de 0,2M TFP, pH 7,6 conteniendo 0,1% (p/v) ácido tioglicólico, 1mM DIECA, y un volumen de una mezcla 1:1 (v/v) cloroformo:tetracloruro de carbono. La emulsión obtenida fue centrifugada a 8288g por 5min. El sobrenadante se mezcló con 10% (p/v) polietilenglicol (PM 8000) y después de agitación durante 2h a 5°C, fue centrifugado a 9514g por 20min. El precipitado se resuspendió durante 12h a 5°C en 0,1M TFP, pH 7,6 y fue clarificado por centrifugación a 12000g por 10min. La suspensión se sometió a centrifugación al equilibrio (90000g por 17h) en 30% (p/p) sulfato de cesio, y a gradientes del mismo compuesto (20-30% p/p) a 100000g por 5h. Las bandas visibles después de los gradientes fueron colectadas con ayuda de una jeringa, se diluyeron con dos volúmenes de 0,01M TFP y se clarificaron por centrifugación a 12100g por 10min. Finalmente, la preparación viral se concentró mediante ultracentrifugación a 102900g por 120min. Esta preparación fue usada para espectrofotometría, electroforesis y como inmunógeno.

El espectro de absorción UV de la preparación viral se determinó en un espectrofotómetro LKB modelo Ultrospec II. La concentración viral fue estimada a partir del valor de absorbancia a 260nm, asumiendo un coeficiente de extinción 1OD= 2,35mg/ml (igual al reportado para un virus similar, el Tenuivirus Maize stripe virus (MStV); Gingery, 1985).

Morfología de las partículas

La preparación viral purificada fue absorbida sobre rejillas previamente ionizadas y cubiertas con una capa de colodión y carbón durante 3min a temperatura ambiente. Posteriormente, las rejillas se tiñeron negativamente con 2% fosfotungstato de sodio, pH 6,8 para su observación en un microscopio electrónico Phillips CM-10. El promedio de la longitud y el diámetro de 100 partículas virales se determinó por comparación con estándares internos del microscopio electrónico.

Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE)

Alícuotas de virus purificado (0,59mg/ml) fueron incorporadas a una mezcla de disociación para proteinas 5X (0,2M tampón Tris-HCL, pH 6,8; 0,2M 2-mercaptoetanol; 0,5M fenilmetil sulfonil fluoruro; 5% SDS; 5% glicerol; y 0,01% azul de bromofenol). La solución resultante se calentó a 100°C durante 3min, y las muestras así tratadas fueron sometidas a electroforesis en minigeles verticales de poliacrilamida 12%, siguiendo el método descrito por Laemmli (1970). La electroforesis se llevó a cabo en una cámara Mini-PROTEAN II (Bio-RAD Lab. Inc, California, EEUU). Como referencia se utilizaron los siguientes marcadores de bajo peso molecular: fosforilasa b (94kDa), albúmina sérica bovina (67kDa), ovoalbúmina (43kDa), anhidrasa carbónica (30kDa), inhibidor de tripsina (20kDa) y lacto albúmina (14kDa). Los geles se tiñeron durante 1h a 80°C en solución fijadora constituida por isopropanol 30% (v/v) y ácido acético 7% (v/v) conteniendo 0,05% (p/v) de azul brillante de Coomassie R. El exceso de colorante se removió mediante varios cambios de solución fijadora. La distancia recorrida por las bandas proteicas fue medida y el peso molecular se determinó mediante un análisis de regresión lineal, basada en la migración de los marcadores usados como referencia.

Obtención de antisuero

Aproximadamente 4mg/ml de virus purificado fueron inyectados vía intramuscular en un conejo raza New Zealand de 2kg de peso. La inmunización se realizó cada 7 días durante 4 semanas consecutivas. Para la inoculación del animal, el virus fue homogeneizado con igual volumen de adyuvante completo de Freund en la primera inyección, y adyuvante incompleto en las inyecciones posteriores, siendo el conejo sangrado por punción cardíaca 2 semanas después del ultimo reto. La sangre se mantuvo en estufa a 37°C por 30min, y el suero se obtuvo por centrifugación a 2000g durante 20min. Con el propósito de evitar reacciones no específicas, 1ml del suero obtenido se incubó toda la noche a 4°C con 1ml de un extracto de hojas de arroz sanas en TFP. Los anticuerpos que reconocieron proteínas del hospedero fueron removidos por centrifugación a 250000g por 30min (Hampton et al., 1990).

Preparación de inmunoglobulinas (IgGs)

Las IgGs presentes en el suero neutralizado fueron fraccionadas mediante cromatografía en columnas de proteína A-sefarosa (Sigma, St. Louis, MO, EEUU) se saturaron en 0,01M tampón fosfato pH 7,5 durante 15min, empacándose posteriormente en una columna Econopac de 1,5×12cm (Bio-RAD). El pH del suero sanguíneo se ajustó a 8,0 mediante la adición de 10 volúmenes de 1M tampón Tris-HCL, pH 8,0 y esta solución fue cargada en la columna. La columna fue primero eluída con 10 volúmenes de 0,01M Tris-HCl pH 8,0 y, finalmente, las IgGs se eluyeron mediante la aplicación de 0,1M tampón Tris-glicina pH 3,0. Alícuotas de 500μl se colectaron en tubos de microcentrífuga conteniendo 50μl de 1M tampσn Tris-HCl pH 8,0. Las fracciones que contenían las IgGs se identificaron por absorbancia a 280nm, y la concentración se calculó utilizando el factor de conversión de 1 unidad DO= 0,8mg/ml (Weissbach y Weissbach, 1988).

La incidencia de las infecciones se determinó utilizando las IgGs específicas contra RHBV obtenidas en esta investigación en ensayos de DAS-ELISA, como se describió.

Resultados

Durante visitas realizadas a zonas productoras de arroz en los Estados Portuguesa y Guárico fue posible observar plantas con un solo tipo de sintomatología no atribuida a deficiencias de nutrientes. Dichos síntomas consistieron en áreas cloróticas y lesiones típicas de mosaico, rayas de color amarillo pálido paralelas a la nervadura central, secamiento descendente de las hojas de plantas jóvenes y deformación de las panículas en plantas de mayor desarrollo, todos semejantes a los descritos en la literatura para el virus de la hoja blanca del arroz (RHBV; Morales y Niessen, 1985). Cabe señalar que durante los muestreos no se observaron plantas con síntomas de entorchamiento como los que se han descrito recientemente en Colombia, tales como deformación severa de las hojas (Morales et al., 1999)

A partir de plantas de arroz infectadas, se lograron preparaciones virales purificadas con altos rendimientos (~10mg/kg de tejido vegetal extraído). Las preparaciones virales parcialmente purificadas se separaron como 2 o 3 componentes en Cs₂SO₄. El examen de estas bandas al microscopio electrónico reveló la presencia de filamentos finos en forma de espiral (Figura 1), los cuales exhibieron coeficientes de absorción típicos de nucleoproteínas con una relación A260/280nm= 1,4 ±0,02. Al analizar las preparaciones virales derivadas de los gradientes de CsCl disociadas mediante electroforesis en geles de SDS-PAGE teñidos con azul de Coomassie, se observó la presencia de una simple especie de proteína de cápside con un peso molecular ~34kDa (Figura 2). Tanto la ultraestructura de las partículas virales observadas como los valores de absorción UV y el peso de la proteína purificada coinciden con los reportados en la literatura para el virus RHVB.

Hasta el momento no se ha producido en Venezuela un anticuerpo policlonal capaz de detectar al virus RHBV, y el utilizado en el presente trabajo fue cedido gentilmente por Dr. Francisco J. Morales (CIAT, Colombia). Por esta razón, y habiendo corroborado la incidencia de RHBV en dos zonas productoras del país, se propuso como uno de los objetivos de este trabajo de investigación, producir esta importante herramienta de diagnóstico. Usando las preparaciones virales como inmunógenos, se obtuvieron anticuerpos policlonales específicos contra la proteína de cápside viral, con un título de 1:1000 calculado mediante la técnica de DAS-ELISA. En estos ensayos, las IgGs no reaccionaron con extractos de plantas sanas y reconocieron específicamente al antígeno homólogo, tanto en preparaciones purificadas (con un límite de detección 0,5ng/ml) como en extractos de plantas enfermas (en una dilución óptima de 10:2; datos no mostrados). Estos anticuerpos permitieron calcular la incidencia del virus en los campos muestreados. En ensayos inmunoenzimáticos, de un total de 270 plantas colectadas en dos estados productores, 30 (11,1%) plantas reaccionaron fuertemente con anticuerpos policlonales dirigidos contra el virus RHBV. Ningún otro virus diferente de RHBV pudo ser detectado en el total de las muestras colectadas mediante ensayos serológicos o por microscopía electrónica.

Discusión

En Venezuela el cultivo del arroz es considerado estratégico desde el punto de vista agroalimentario, siendo atacado por numerosas plagas y enfermedades. Trabajos previos han identificado al virus de la hoja blanca en el país, en base a la sintomatología inducida en las plantas de arroz y mediante inoculaciones de plantas indicadoras a través de insectos vectores (Brunt et al., 1996).

En este trabajo se describe por primera vez en el país la producción de anticuerpos policlonales altamente específicos contra el principal agente viral, el virus de la hoja blanca del arroz (RHBV). Dicho virus, aislado de muestras provenientes de plantaciones de los estados Guárico y Portuguesa, fue caracterizado parcialmente mediante microscopía electrónica, serología y análisis del peso molecular de la proteína de cápside.

La incidencia del virus en las zonas muestreadas fue muy baja (11,1%), lo cual puede deberse a la siembra extensiva en estos campos de variedades de arroz resistentes a diversas enfermedades. Cabe señalar que se necesitan muestreos extensivos posteriores de las diversas líneas de arroz que se siembran a nivel nacional para evaluar la epidemiología del virus en el país.

En ninguna de las localidades encuestadas se detectó la presencia de síntomas relacionados con el "entorchamiento", causados por el virus RSNV. Así mismo, ninguna de las muestras colectadas reaccionó con anticuerpos dirigidos contra RSNV, hecho de relevante ventaja para el circuito arrocero venezolano.

Desafortunadamente, hasta el presente no se ha encontrado un remedio eficaz contra las enfermedades virales en plantas; sin embargo, resulta de mucha utilidad en la prevención conocer algunas características de la enfermedad, tales como sus propiedades biológicas, su forma de transmisión y la identificación de las especies vegetales con potencialidad de actuar como reservorio o fuente de inóculo del virus. Asimismo, resulta de importancia contar con sistemas de diagnóstico que permitan la detección de las virosis en el campo. La producción de un anticuerpo policlonal con alta especificidad para el virus RHBV y su utilización como herramienta de diagnóstico permitirán planificar estrategias de control y manejo integrado de las enfermedades virales del cultivo del arroz en Venezuela.

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan su agradecimiento a Nelly Delgado (INIA-Portuguesa) y Gelis Torrealba (INIA-Guárico), así como al personal de los programas de arroz del INIA, por su colaboración durante los muestreos de campo e identificación de plantas infectadas; a Mirtha Romano y Jorge Rivas por la microscopía electrónica y fotografía científica, a Zoraida Fernández (Universidad de Carabobo) la traducción del resumen al portugués. Este trabajo fue financiado parcialmente por las subvenciones CONICIT S1-2001000752 y Subproyecto de Biotecnología BID-FONACIT N. 2004000368.

REFERENCIAS

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