Determinación de la capacidad nitrificante de un sedimento marino proveniente de un centro de cultivo de salmones.

Mayra Jarpa, Alicia Aguilar, Marisol Belmonte, Jacqueline Decap, Mireya Abarzúa y Gladys Vidal

Mayra Jarpa. Licenciada en Biología. Universidad de Concepción (UdeC), Chile. Centro de Ciencias Ambientales EULA-Chile. e-mail: mayjarpa@udec.cl

Alicia Aguilar. Licenciada en Biología, UdeC, Chile. e-mail: alicia_lorena@hotmail.com

Marisol Belmonte. Licenciada en Biología. Estudiante de Doctorado, Centro de Ciencias Ambientales EULA-Chile. e-mail: mbelmont@udec.cl

Jacqueline Decap. Química laboratorista, Universidad de la Frontera. Centro de Ciencias Ambientales EULA-Chile, UdeC, Chile. e-mail: jdecap@surnet.cl

Mireya Abarzúa. Licenciada en Biología, M.Sc. en Ciencias mención Microbiología. UdeC, Chile. Centro de Ciencias Ambientales EULA-Chile. e-mail: mabarzua@udec.cl

Gladys Vidal. Doctora en Ciencias Químicas, Universidad de Santiago de Compostela, España. Directora Programa Doctorado en Ciencias Ambientales. Centro de Ciencias Ambientales EULA-Chile. Dirección: Centro de Ciencias Ambientales EULA-Chile. Universidad de Concepción. Casilla 160-C. e-mail: glvidal@udec.cl

Resumen

En el proceso productivo del salmón se eliminan residuos líquidos y sólidos. Si estos residuos no son tratados o retirados de los sitios de cultivos pueden ser tóxicos a los sistemas acuáticos, debido a su descomposición y producción de amonio (NH₄⁺) y nitrito (NO₂^-). En los ecosistemas acuáticos las bacterias nitrificantes son responsables de la oxidación de estos compuestos. El objetivo del presente trabajo es obtener cultivos de bacterias amonio oxidantes (BAO) y nitrito oxidantes (BNO) en sistemas de tipo batch y evaluar la capacidad de eliminación de nitrógeno, determinando las respectivas cinéticas. Como inóculo inicial se utilizó sedimentos de un centro de cultivo de salmones. Los resultados muestran la baja actividad nitrificante presente en los sedimentos, obteniéndose para BAO producciones de 197-206mg·l^-1 N-NO₂^-, velocidades de consumo de O₂ (VCO) con respecto del factor estequiométrico de 0,023mg·l^-1·min^-1 N y consumo neto de O₂ (CNO) de 0,055mg·l^-1·min^-1 O₂, mientras que para BNO, se obtuvieron producciones de 404-631mg·l^-1 N-NO₃^-, VCO de 0,027mg·l^-1·min^-1 N y CNO de 0,0122mg·l^-1·min^-1 O₂. Los resultados corroboran la incapacidad de las bacterias nitrificantes de oxidar la gran cantidad de compuestos nitrogenados generados por esta actividad acuícola.

Determination of the nitrifying capacity of marine sediments from a salmon farming centre.

Summary

Solid and effluent wastes are generated by salmon productive process. Wastes can produce toxic effects to the aquatic system due to the ammonia (NH₄⁺) and nitrite (NO₂^-) production, if they are discharged without any treatment. In the aquatic ecosystems nitrifying bacteria are responsible for the nitrogen oxidize compounds. The goal of this work is to obtain Oxidize Ammonia Bacteria (OAB) and Oxidize Nitrite Bacteria (ONB) in batch assays and also, to evaluate the nitrogen removal and kinetic, respectively. The batch assays inoculations were done with sediments from salmon culture. Results show a lower sediment nitrifying capacity. The OAB values were between 197-206mg·l^-1 N-NO₂^- whereas Oxygen Uptake Rate (OUR) respect to stoichiometric factor and the Oxygen Consumption Net (OCN) were 0.023mg·l^-1·min^-1 N and 0.055mg·l^-1·min^-1 O₂. On the other hand, ONB values were between 404-631mg·l^-1 N-NO₃^-, whereas 0.027 mg·l^-1·min^-1 N, and 0.0122mg·l^-1·min^-1 O₂ were determine for OUR and OCN, respectively. Due to the high concentration of the nitrogen compounds bacteria are not able to oxidize nitrogen generation from wastes.

Determinação da capacidade nitrificante de um sedimento marinho proveniente de um centro de cultivo de salmões.

Resumo

No processo produtivo do salmão se eliminam resíduos líquidos e sólidos. Se estes resíduos não são tratados ou retirados dos lugares de cultivos podem ser tóxicos aos sistemas aquáticos, devido a sua decomposição e produção de amônio (NH4+) e nitrito (NO2-). Nos ecossistemas aquáticos as bactérias nitrificantes são responsáveis da oxidação destes compostos. O objetivo do presente trabalho é obter cultivos de bactérias amônio-oxidantes (BAO) e nitrito-oxidantes (BNO) em sistemas do tipo batch e avaliar a capacidade de eliminação de nitrogênio, determinando as respectivas cinéticas. Como inóculo inicial se utilizou sedimento de um centro de cultivo de salmões. Os resultados mostram a baixa atividade nitrificante presente nos sedimentos, obtendo-se para BAO produções de 197-206mg·l-1 N-NO2-, velocidades de consumo de O2 (VCO) em relação ao fator estequiométrico de 0,023mg·l-1·min-1 N e consumo neto de O2 (CNO) de 0,055mg·l-1·min-1 O2, enquanto que para BNO, se obtiveram produções de 404-631mg·l-1 N-NO3-, VCO de 0,027mg·l-1·min-1 N e CNO de 0,0122mg·l-1·min-1 O2. Os resultados destacam a incapacidade das bactérias nitrificantes de oxidar grande quantidade de compostos nitrogenados gerados por esta atividade aqüícola.

Palabras Clave / BAO / biodegradación / BNO / salmonicultura /

Recibido: 29/05/2007. Modificado: 23/08/2007. Aceptado: 28/08/2007.

Introducción

En Chile en los últimos años, el cultivo de salmones ha incrementado, reportándose para 2005 producciones de aproximadamente 600000ton, situando al país como uno de los principales productores a nivel mundial (Sernapesca, 2005).

La salmonicultura se desarrolla preferentemente en las regiones de los Lagos (39-44ºS) y General Carlos Ibáñez del Campo (44-50ºS), dadas las características geográficas y oceanográficas que estas zonas presentan (Buschmann et al., 1996; Buschmann, 2001), donde el aumento de esta industria ha influido directamente en el medio ambiente donde se desarrolla (Alonso y Camargo, 2003).

Dentro de las principales fuentes de contaminación se encuentran el uso de antibióticos en la alimentación (Miranda y Zemelman, 2002) y los residuos de alimentación y desechos orgánicos de peces, cuyo efecto principal es la eutroficación de las aguas (Claude y Oporto, 2000).

Normalmente, los ambientes acuáticos tienen la capacidad de metabolizar los residuos orgánicos mediante la acción de poblaciones bacterianas que habitan tanto en la columna de agua como en los sedimentos marinos, siendo estas colonias las encargadas del reciclamiento de nutrientes (N y P) en el mar (Pantoja et al., 2004).

En el ambiente acuático las bacterias nitrificantes tienen un papel importante, ya que por medio de la actividad biológica oxidan el amonio (NH₄⁺) generado por la mineralización de los desechos de los peces, el exceso de comida y la descomposición de tejidos animales y vegetales. La toxicidad del NH₄⁺ se da bajo su forma no ionizada, el amoniaco (NH₃), y depende sobre todo del pH y la temperatura del medio. La oxidación del NH₄⁺ generará nitritos (NO₂^-) que también presentan un efecto tóxico, lo que dependerá de su concentración en el medio, ya que inhibe la capacidad de los glóbulos rojos de la sangre en los peces para intercambiar oxígeno. A su vez, los nitritos generados servirán de sustratos para bacterias que los oxidan (Blanco, 1984), produciendo finalmente formas menos tóxicas como el nitrato (NO₃^-). La oxidación de estos productos nitrogenados se realiza mediante el proceso de nitrificación, el cual es de tipo aeróbico y realizado por microorganismos litotróficos que utilizan sustratos inorgánicos como fuente de energía. La oxidación total del NH₄⁺ por medio de estas bacterias ocurre en dos etapas. En la primera etapa, conocida como nitritación y realizada por bacterias amonio oxidantes (BAO), se produce la oxidación del NH₄⁺ a NO₂^-. En la segunda etapa se produce la oxidación de NO₂^- a NO₃^-, denominada nitratación, la cual es realizada por bacterias nitrito oxidantes (BNO; Brauer y Hefni-Omar, 1988; Brauer y Annachhatre, 1992; Capone, 2000; Effler et al., 1990; Garrido et al., 1996; Knowles, 1982). En ambas reacciones existe desprendimiento de energía, la cual es empleada por estas bacterias nitrificantes para su crecimiento y mantenimiento celular. Pero dicha energía resulta ser baja, repercutiendo en que su tasa de crecimiento sea lenta (Baas-Becking y Parks, 1927; Sánchez, 1999).

Diversos factores controlan el proceso de nitrificación en cultivos, tal como la cantidad de O₂ presente en el medio. El crecimiento de bacterias nitrificantes es nulo a valores <0,2mg·l^-1 O₂ y, por el contrario, no se observan efectos a concentraciones elevadas de O₂ disuelto, pudiendo llevarse a cabo el proceso de nitrificación a 60 mg·l^-1 O₂ (Mosquera-Corral, 1998). Otros factores a considerar son el pH del medio, que debe encontrarse entre 7,5 y 8,5; la temperatura (25-35ºC); la limitación por falta de sustratos (Anthonisen et al., 1976; Mosquera-Corral, 1998); los cambios en la alcalinidad del medio que ocurren en la etapa de nitritación, ya que por cada mol de NH₄⁺ que se oxida a NO₂^- se consumen ~2 moles de bicarbonato (Campbell et al., 1966; Carrera, 2001); la interacción con otro tipo de bacterias, como bacterias heterótrofas (Sánchez, 1999); y la cantidad de NH₃ libre, el cual inhibe a las BAO a concentraciones de 10 a 150mg·l^-1, mientras que para el caso de las BNO la inhibición se registra a concentraciones entre 0,1 y 1mg·l^-1 (Anthonisen et al., 1976)

El cultivo del salmón se desarrolla en varias etapas (Figura 1; Salgado, 2005). Se inicia con la obtención de ovas embrionadas a partir del desove de especies reproductoras, siendo necesaria la incubación de éstas durante un período de 26 a 100 días, dependiendo de la especie a cultivar. Posteriormente ocurre la etapa de alevinaje, que se extiende desde la salida del pez de la bandeja de incubación hasta la smoltificación, cuando el pez tiene ~11 meses. Una vez que los alevines absorben el saco vitelino, se inicia la primera alimentación. Durante esta etapa es necesario el control diario de limpieza de los estanques de cultivos y la extracción de los alevines muertos. Al momento de alimentar se debe tener cuidado de no exceder la capacidad real de consumo, pues el alimento no consumido se pierde en el fondo del estanque, alterando la calidad del agua. Transcurrida la smoltificación, etapa en la que se produce la aclimatación de las especies a agua salobre, y suspendido el suministro de alimento, los salmones son trasladados a los sistemas de crianza para su engorda (hasta 26 meses), con el objeto de que los peces en cultivo alcancen su peso comercial. Este proceso de engorda se puede llevar a cabo tanto en instalaciones terrestres (estanques circulares o rectangulares) como en instalaciones marinas (balsa-jaulas).

Por su parte el ciclo del nitrógeno, elemento fundamental para la vida, consta de varias etapas (Figura 2). La primera es la amonificación, en la cual se produce la conversión del nitrógeno orgánico en NH₄⁺. A continuación ocurre el proceso de nitrificación, en el cual el NH₄⁺ es oxidado por bacterias nitrificantes a NO₂^- y NO₃^-, siendo ésta una etapa de gran importancia, ya que el NH₄⁺ en altas concentraciones resulta ser tóxico para la vida acuática (Alonso y Camargo, 2003). En ausencia de O₂ se produce la desnitrificación, en la cual el NO₃^- es reducido a NO₂^-, siendo sus productos finales el óxido nitroso (N₂O) o nitrógeno molecular (N₂), vía que constituye pérdida de N₂ en forma gaseosa. La capacidad de las bacterias de reducir el NO₃^- a NO₂^-o N₂ ocurre en presencia de bajos niveles de O₂, y en esta etapa el aceptor final de electrones es el NO₃^- en lugar del O₂ para la respiración, siendo necesario que el medio no cuente con O₂ libre (Knowles, 1982; Capone, 2000).

Metodología

Consorcio bacteriano

Como inóculo para la realización del cultivo in vitro se utilizaron sedimentos superficiales colectados bajo balsa-jaulas de zonas marinas de cultivo (39-44ºS). Una vez extraídas las muestras de sedimentos, estas fueron trasladadas en recipientes herméticos al laboratorio de biotecnología ambiental del Centro de Ciencias Ambientales EULA-Chile, en Concepción, Chile.

Sistemas de cultivo

Los cultivos de bacterias nitrificantes se realizaron en sistemas de tipo discontinuo o sistemas batch, implementados en matraces Erlenmeyer (0,5l) para cada tipo de cultivo de bacterias amonio oxidantes (BAO) y nitrito oxidantes (BNO), cada uno con 2 replicas (BAO-1, BAO-2; BNO-1, BNO-2). La oxigenación se mantuvo constante, siendo suministrada mediante un difusor de aire que promueve la formación de pequeñas burbujas y al mismo tiempo asegura la mezcla completa al interior del sistema de cultivo. Cada matraz se inoculó con 5ml de sedimentos y se mantuvieron en oscuridad, debido a la sensibilidad a la luz de este tipo de bacterias. La alimentación de los cultivos se realizó por medio de un sustrato sintético elaborado para cada tipo de bacterias nitrificantes. Para el caso de los cultivos de BAO, la alimentación fue en base a 1g·l^-1 (NH₄)₂SO₄; 2,0g·l^-1 NaCl; y 6,0g·l^-1 CaCO₃. Para los cultivos de BNO el sustrato se elaboró a partir de 2,0g·l^-1 NaNO₂; 0,5g·l^-1 NaCl; y 0,007g·l^-1 CaCO₃. En ambos sustratos se adicionaron las concentraciones de microelementos especificadas en la Tabla I, complementados con agua destilada y agua de mar en relación 4:6 (Austin, 1990). La alimentación se realizó mediante ciclos. Para BAO la alimentación fue en dos ciclos (I y II), con tiempos de duración de 48 y 113 días, respectivamente. Para BNO la alimentación se realizó en 3 ciclos (I, II y III) de 62, 71 y 28 días, respectivamente. Durante el tiempo de cultivo se controlaron parámetros físico-químicos, manteniéndolos entre 25-35ºC, pH de 7,2-7,5 y concentración de O₂ disuelto (OD) de 7-8mgO₂·l^-1.

Biodegradación de sustratos

Durante el tiempo de operación de los cultivos se evaluó la evolución de los mismos, a través del consumo de sustratos suministrados y generación de productos (Ec. 1). Para calcular las velocidades de biodegradación, se realizó el cálculo de la pendiente de la línea recta mediante el cociente de los incrementos de la concentración del producto o consumo de sustratos y el tiempo, considerándose los puntos entre los cuales se observó un cambio significativo en el comportamiento de la recta

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dónde r_x: velocidad máxima de producción o de consumo de sustratos tanto para cultivos de BAO y BNO (mg·l^-1·día^-1 N), X: concentración de sustrato consumida o producto generado (mg·l^-1 N), y t: tiempo de operación del cultivo (días).

Para los cultivos BAO-1 y BAO-2 solo se determinó la producción de NO₂^-, no pudiendo cuantificar el consumo de NH₄⁺ por falta de exactitud de la técnica, debido a lo cual se realizó una curva teórica del consumo de NH₄⁺ y con estos el comportamiento del cultivo. Por el contrario, para los cultivos BNO-1 y BNO-2 se cuantificó tanto el consumo de NO₂^- como la producción de NO₃^-.

Actividad nitrificante

La actividad nitrificante en cada cultivo fue determinada mediante análisis respirométricos, basados en la medición de la velocidad de consumo de O₂ (VCO) por las bacterias nitrificantes en el cultivo, al momento de oxidar los sustratos suministrados. El cálculo de la pendiente de la curva, mediante el cociente de los incrementos de la concentración de O₂ y el tiempo en el cual se inicia su consumo, proporcionará la cantidad de O₂ que es requerido por las bacterias al momento de iniciar las respectivas oxidaciones de sus sustratos, (NH₄)₂SO₄ para BAO y NaNO₂ para BNO (Ec. 2). La cantidad de O₂ consumido dependerá de la concentración de biomasa existente y la cantidad de sustrato disponible para ser degradado (Sánchez, 1999), considerándose en este trabajo concentraciones de biomasa de 1g·l^-1 SSV y concentraciones de sustratos de 50, 100, 150, 250 y 500mg·l^-1 N para cada tipo de cultivo.

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donde VCO:velocidad de consumo de O₂ durante el ensayo respirométrico (mg·l^-1 O₂), y t: tiempo en el cual se inicia la oxidación del sustrato (min).

Los respectivos valores de VCO obtenidos en los distintos ensayos respirométricos pueden ser expresadas en función del consumo de NH₄⁺ (Ec. 3) o NO₂^- (Ec. 4), en las cuales intervienen los factores estequiométricos de las etapas de nitritación y nitratación que componen el proceso de nitrificación, considerando la cantidad de O₂ requerida para llevar a cabo cada etapa. Para la etapa de nitritación (Sánchez, 1999) el consumo de O₂ corresponde a 48mg O₂ por cada 14mg N que son oxidados, resultando un cociente de 3,43mg O₂/mg N (f₁), mientras que para la etapa de nitratación se requieren 16mg O₂ por cada 14mg N, siendo este cociente de 1,14 mg O₂/g N (f₂).

  (3)

   (4)

Además, mediante estos ensayos respirométricos, se calculó el consumo neto de O₂ (CNO), calculado como

       (5)

donde CNO: consumo neto de O₂ (mg·l^-1), RT: respiración total de los microorganismos (mg·l^-1 O₂), y RE: respiración endógena (mg·l^-1 O₂).

El cálculo de la respiración total (RT) considera la respiración endógena (RE), en la cual las bacterias no degradan un sustrato presente en el medio, sino que emplean sustratos existentes en su interior y así producir la energía necesaria. Tanto RT como RE, se calculan de forma análoga (Ec. 6), pero RE se calcula entre los intervalos en que no hay oxidación de sustratos externos, es decir, cuando el consumo de O₂ alcanza valores constantes.

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donde R_t,e: respiración, ya sea total o endógena de las bacterias (mg·l^-1·min^-1 O₂); O₂: O₂ consumido (mg·l^-1); y t: tiempo (min).

Métodos analíticos

El NO₂^- se determinó por el método colorimétrico, medido a una longitud de onda de 543nm, utilizando espectrofotómetro modelo Spectronic Unicam UV-Visible Serie Genesis^TM 10. La generación de NO₃^- se cuantificó a través de la técnica potenciométrica, utilizándose un eléctrodo de ión selectivo Cole-Pamer. En ambas determinaciones se siguieron los métodos estandarizados (APHA, 1989). Para realizar los análisis fue necesario desconectar los sistemas de cultivos y extraer muestras de 10ml. Para evitar la existencia de sólidos en suspensión que pudieran sesgar los resultados, cada muestra fue previamente filtrada en membranas de 0,45µm. El control de pH se realizó con el electrodo de pH WTW Sen Tix 41, y para el registro de O₂ disuelto se utilizó un eléctrodo específico (Oxi 330i). Mediante análisis respirométricos (Sánchez, 1999) se estudió la actividad nitrificante de cada cultivo, realizándose respirogramas a los cultivos de BAO y BNO, con volúmenes de muestras de 5ml para cada ensayo, los cuales fueron inyectados en el vial de ensayo termostatizado a 22ºC, para posteriormente introducir, al vial de ensayo, el sensor de O₂ 5331 conectado al monitor biológico de O₂ YSI 5300A, obteniéndose así el O₂ (mg·l^-1) consumido por la biomasa bacteriana al momento de suministrar las distintas concentraciones de sustratos.

Se realizaron ensayos al lodo sin adición de sustratos, obteniendo el consumo endógeno de O₂, y posteriormente se realizaron los distintos respirogramas del lodo con adición de las distintas concentraciones de sustratos (50, 100, 150, 250 y 500mg·l^-1 N) en forma de (NH₄)₂SO₄ para BAO o de NaNO₂ para BNO. Los análisis de consumo de O₂ fueron realizados por períodos de 15min, con registros cada 15seg.

Resultados y Discusión

Los estudios realizados para evaluar la nitrificación en sistemas de tratamiento de tipo discontinuo son menos abundantes que aquellos en sistemas de tipo continuo; en reactores de tipo discontinuo, al no existir regeneración del medio, el crecimiento celular se detiene presentándose algún tipo de limitación, ya sea por consumo de un nutriente, acumulación de productos tóxicos del metabolismo o limitación de O₂, entre otros, explicando las fases típicas del crecimiento celular en este tipo de cultivos (Mosquera-Corral et al., 2005). La Tabla II muestra la velocidad máxima de consumo de sustrato y la velocidad máxima de aparición de productos (Ec. 1) durante la operación de los cultivos, los cuales fueron alimentados mediante ciclos. Al inicio del primer ciclo del cultivo de BAO (Figura 3) no hay generación de nitritos debido a que estas bacterias se encuentran en la fase lag de su curva de crecimiento, etapa en la cual los microorganismos se están adaptando a las condiciones del cultivo. Realizada la segunda alimentación, al inicio del segundo ciclo del cultivo, ya no se observa la fase lag pues las BAO se encuentran adaptadas a las condiciones presentes en el medio, lo que se verifica con las velocidades de producción registradas (Tabla II). Para los cultivos de BAO se obtienen velocidades de producciones de 10,7 y 12,7mg·l^-1·día^-1 N (BAO-1 y BAO-2, respectivamente). Para BNO no se presenta una fase lag, por lo que una vez inoculados los cultivos y suministrado el sustrato, se inicia el consumo de nitritos y generación de nitratos, con velocidades máximas de producción de 34 y 19,3mg·l^-1·día^-1 N. En los ciclos II y III, el cultivo de BNO-1 alcanzan valores de 1,4 y 4,2mg·l^-1·día^-1, similares a las de BNO-2. La disminución de estas velocidades se explicaría por la ubicación en la fase de crecimiento de los cultivos, que se encontrarían ya en la fase de crecimiento estacionario, comportamiento que se observa en las Figuras 4a y b (BNO-1 y BNO-2, respectivamente). Si estos resultados se comparan con los obtenidos a través de sistemas continuos, se aprecian diferencias en las eficiencias de la oxidación de los compuestos nitrificantes. En sistemas de tratamiento de lodos activados Campos et al. (1999) obtuvieron conversiones de amonio a nitrato entre 97 y 99%, con velocidades máximas de producción de nitratos de 42,5mg·l^-1·día^-1 N, mientras que para la producción de nitritos obtuvieron velocidades máximas de producción de 24,5mg·l^-1·día^-1 N. También se ha estudiado mediante lodos activados el efecto de aguas residuales con elevadas concentraciones de amonio y el efecto de la sal sobre el proceso de nitrificación, pudiendo oxidar 4g·l^-1·día^-1 N de amoníaco a nitratos, con eficiencias de remoción del 99,5%, lo cual demuestra que esta tecnología de tratamiento opera eficientemente con altos rangos de nitrificación (Campos et al., 2002). Li et al. (2005) evaluaron la oxidación de un influente con 19 y 39mg·l^-1·día^-1 N-NH₄⁺, mediante un sistema de tratamiento de tipo discontinuo SBR o SDS (reactor discontinuo secuencial), obteniendo un efluente de concentración de 4,4mg·l^-1·día^-1 N-NH₄⁺ y una eficiencia de remoción del 88,6%. Esto demuestra que en cultivos de tipo continuo las bacterias nitrificantes presentan mayor eficiencia en la oxidación de compuestos y generación de productos.

En el presente estudio, debido a la tecnología implementada, no fue posible obtener una gran oxidación de los sustratos suministrados y generación de productos, por la estabilización del lodo utilizado. Esto podría explicarse por el crecimiento simultáneo con bacterias heterotróficas, generando bajos rangos de nitrificación (Sánchez, 1999). En la Figura 3 se observa la evolución de los cultivos de BAO. No se cuantificó el consumo de amonio en los cultivos BAO-1 y BAO-2, por lo que se trazó una curva teórica de su consumo. La Figura 3a, muestra la evolución del cultivo BAO-1, obteniéndose una baja tasa de producción (36mg·l^-1 N-NO₂^-) para el ciclo I, valor que puede ser explicado por la ubicación del cultivo en la curva de crecimiento (fase lag). En el ciclo II, se registran las mayores tasas de producción de nitritos (197mg·l^-1), lo cual se explicaría por la adaptación del cultivo, observándose un aumento de manera exponencial en la generación de productos. La producción de nitritos se mantiene entre los días 69 y 97, para luego decaer, lo cual podría deberse a la baja cantidad sustrato disponible para ser oxidado. Un comportamiento similar se observa para BAO-2 (Figura 3b) con pequeña diferencia en la producción máxima (206mg·l^-1 N-NO₂^-) y sin una fase estacionaria, lo cual se podría deber a la falta de sustrato (Mosquera-Corral et al., 2005). Antileo et al. (1997) señalan que en efluentes pesqueros con altos contenidos iniciales de amonio (220 y 700mg·l^-1), al ser tratados mediante reactores de tipo discontinuos por 22h, se obtienen producciones de nitrito de 75 y 80mg·l^-1, respectivamente.

La Figura 4 muestra la etapa de oxidación de nitrito a nitrato de los cultivos BNO. A diferencia de los cultivos de BAO (Figura 3), no hay presencia de fase lag, por lo que una vez inoculado el cultivo y suministrado el sustrato, se inicia el consumo de nitritos y generación de nitratos. Pese al consumo de nitrito que se observa, no hay una elevada producción de nitrato, la que es constante a lo largo del desarrollo de cada cultivo. Las mayores producciones de nitratos se obtienen en el ciclo III (404mg·l^-1) en el caso de BNO-1 (Figura 4a). El mismo comportamiento se observa para el cultivo BNO-2 (Figura 4b), registrándose las mayores producciones durante el desarrollo del ciclo II (631mg·l^-1) y posteriormente la producción tiende a disminuir hasta el momento que se realiza la última alimentación. Antileo et al. (1997), obtuvo en sistemas de tipo discontinuos producciones aproximadas de 42 y 80mg·l^-1 N-NO₃^- a partir de concentraciones iniciales de 220 y 700mg·l^-1 N-NH₄⁺ y en tiempos de operación de 80 y 120h, respectivamente.

Si los valores obtenidos en el presente trabajo, tanto para BAO-1 y 2 como para BNO-1 y 2, se comparan con los resultados obtenidos por Antileo et al. (1997), se puede indicar que la actividad de las bacterias nitrificantes presentes en sedimentos marinos bajo balsa-jaulas es considerablemente baja. Esto es corroborado por los periodos de experimentación en cada caso, siendo de hasta 102h para Antileo et al. (1997), con un período previo de estabilización del inóculo de 7 días, mientras que en este trabajo las experiencias se llevaron a cabo por 161 días, con un tiempo de estabilización del inóculo de 27 días solo para el caso de los cultivos de BAO.

La velocidad de crecimiento de las BNO es mayor que la de las BAO, siendo esta una de las razones por la cual el nitrito no suele acumularse en grandes cantidades durante los procesos de tratamiento biológico (Wiesmann, 1994). De esta forma se podría explicar la mayor generación de productos obtenidos para los cultivos BNO en comparación a los cultivos BAO.

La Tabla III muestra las respirometrías realizadas, observándose que BAO registran mayores consumos de O² a la concentración más baja de sustrato suministrado (50mg), correspondiendo a 1,09mg·l^-1 O₂. A medida que aumenta la concentración del sustrato la capacidad de las bacterias para oxidar estos compuestos disminuye. Al final del tiempo de operación del cultivo de BAO, se obtuvo una biomasa de 4,6g·l^-1 SSV, con un aumento de un 93%. El conocimiento de la biomasa final permitió calcular la respiración específica, que correspondió a 236,9mg·l^-1 O₂ por g·l^-1·SSV. Lo mismo se explica para las respirometrías realizada a BNO, si se considera las concentraciones entre el intervalo de 50-150mg·l^-1 N, aunque con consumo de O₂ inferior a los obtenidos para BAO, siendo éste de 0,32mg·l^-1 O₂, con una respiración específica de 6,7mg·l^-1 O₂ por g·l^-1·SSV. Los valores obtenidos para las concentraciones de 250 y 500mg·l^-1 N no son considerados debido a que sus respectivas respirometrías no se realizaron en el mismo periodo que las concentraciones anteriores. Por esto, las bacterias utilizadas en dichos ensayos podrían haberse encontrado en condiciones distintas, como por ejemplo menor inactividad debido a la presencia de sustrato u aireación. Los resultados obtenidos concuerdan con los de Kim et al. (2004), quienes obtuvieron mayores consumos de O₂ para BAO (4,51mg·l^-1), mientras que para BNO fue de 2,16mg·l^-1, utilizando como sustrato 5mg·l^-1 N-NH₄⁺.

Mediante los ensayos respirométricos fue posible además determinar las VCO (Tabla IV) de la biomasa presente en los cultivos (Ec. 2) tanto para BAO como para BNO, a distintas concentraciones de alimento. Las máximas VCO se registran a la concentración de 50mg·l^-1 N, con valores de 0,08mg·l^-1·min^-1 O₂ para BAO, mientras que para BNO, entre 50 y 150mg·l^-1 N se presentan valores bajos de VCO (0,031mg·l^-1·min^-1 O₂. Sin embargo, para 250 y 500mg·l^-1 N esta tendencia no se observa, como se explicó anteriormente.

Por medio de la VCO cuantificada para cada sustrato, se determinó el CNO (Ec. 5), a partir de las diferencias entre las VCO entre los distintos ensayos respirométricos. La Figura 5 muestra, para ambos tipos de bacterias nitrificantes, los valores de CNO. En ambos casos se registraron máximos para la concentración de 50mg·l^-1 N, correspondiendo a 0,055 y 0,0122mg·l^-1·min^-1 O₂ BAO y BNO, respectivamente. Estos valores coinciden con los obtenidos a lo largo de las distintas respirometrías, ya que las máximas actividades de la biomasa nitrificante, se registran a la más baja concentración de sustrato (Kim et al., 2004). Los resultados obtenidos en este estudio corroborarían la cantidad de O₂ requerida en las distintas etapas del proceso de nitrificación, siendo mayor el consumo en la etapa de nitritación realizada por BAO (3,43mg O₂ por mg N), mientras que en la etapa de nitratación la cantidad de O₂ requerida por BNO es menor (1,14mg O₂ por mg N; Brauer y Hefni-Omar, 1988; Garrido et al., 1996; Sánchez, 1999).

Conclusiones

Se logró obtener cultivos de BAO y BNO y evaluar su actividad nitrificante, pudiendo determinar las respectivas velocidades de consumo de sustratos y generación de productos, por parte de este tipo de bacterias. Los bajos valores de nitritos y nitratos obtenidos corroborarían la baja tasa de crecimiento que presentan las bacterias nitrificantes.

Los ensayos respirométricos, resultaron ser una herramienta eficaz para la determinación del consumo de O₂ y por ende la actividad nitrificante presente en los sedimentos, pudiéndose determinar la VCO, respecto del factor estequiométrico.

Se concluye que, pese a que los cultivos se realizaron bajo condiciones óptimas de laboratorio, las bacterias nitrificantes presentes en estos sedimentos marinos no fueron capaces de oxidar eficientemente las concentraciones de amonio y nitrito suministradas. De este modo, los consorcios bacterianos de los distintos cultivos presentaron bajas velocidades de crecimiento y de producción de nitritos y nitratos. Estudios complementarios en situaciones más cercanas a las de los cultivos marinos (microcosmos), podrían aportar en el futuro información valiosa a fin de determinar la capacidad máxima de los sedimentos del fondo marino para oxidar la cantidad de compuestos nitrogenados generados por esta actividad acuícola.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a Adolfo Acuña su valiosa ayuda en la obtención del sedimento marino. Este trabajo fue financiado por el proyecto FONDECYT 1040987.

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