MARCADOR RAPD ASOCIADO A LA RESISTENCIA A Fusarium oxysporum EN Musa

Asia Y. Zambrano, Gustavo Martínez, Zulay Gutiérrez, Edwin Manzanilla, José Luís Vicente-Villardón y Jhonny R. Demey

Asia Yusely Zambrano. Doctora en Ciencias Agrícolas. Universidad Central de Venezuela. Investigadora INIA-CENIAP. Maracay, Venezuela. Apdo. 4521. Maracay, 2101. Venezuela. e-mail: azambrano@inia.gob.ve

Gustavo Martínez. Master en Agronomía. Investigador INIA-CENIAP. Maracay, Venezuela.

Zulay Gutiérrez. Técnico Superior en Agropecuaria. Técnico Asociado a la Investigación INIA-CENIAP, Maracay, Venezuela.

Edwin Manzanilla. Técnico Superior en Agropecuaria. Técnico Asociado a la Investigación INIA-CENIAP, Maracay, Venezuela.

José Luís Vicente-Villardón. Doctor en Estadística. Profesor Titular Departamento de Estadística, Universidad de Salamanca, España.

Jhonny R. Demey. Master en Estadística. Bioestadístico. Centro de Biotecnología, Fundación Instituto de Estudios Avanzados IDEA. Caracas. Venezuela. Apdo. 4521. Maracay, 2101. Venezuela. e-mail: jdemey@reacciun.ve.

RESUMEN

La marchitez por Fusarium constituye una de las enfermedades más destructivas en Musa, siendo causada por el hongo del suelo Fusarium oxysporum f. sp. cubense. No se cuenta con control químico disponible, siendo la única medida posible la utilización de genotipos resistentes/tolerantes al patógeno. El desarrollo de las técnicas moleculares ha permitido la determinación de marcadores asociados a determinadas condiciones de importancia económica, constituyendo una estrategia de selección rápida, confiable y reproducible que acelera el mejoramiento a través del conocimiento, en estadios tempranos, de la reacción a una característica dada y su interacción con el genotipo. En este estudio se determinó un marcador RAPD asociado a la resistencia de Musa a F. oxysporum utilizando ocho clones susceptibles y diez clones resistentes/tolerantes evaluados en el campo para la reacción a la enfermedad. Se encontró que el patrón obtenido con el iniciador OPK-03 produjo un fragmento de amplificación específico de 485pb presente en los clones susceptibles y ausente en los clones resistentes/tolerantes. El estudio de las relaciones genéticas entre genotipos susceptibles y los resistentes/tolerantes a F. oxysporum, empleando iniciadores RAPD, definió la existencia de un patrón polimorfo asociado a la resistencia a la enfermedad.

IDENTIFICATION OF RAPD MARKER LINKED TO RESISTANCE OF Musa TO Fusarium oxysporum

SUMMARY

Fusarium wilt of banana is widely regarded as one of the most destructive plant diseases. It is caused by the soil-inhabiting fungus Fusarium oxysporum f. sp. cubense. There is no chemical control available and the only way to control it is to utilize cultivars that are resistant/tolerant to the pathogen. The development of molecular techniques allows the determination of markers linked to certain conditions of economic importance and constitutes a strategy for fast, reliable and reproducible selection, accelerating the improvement through knowledge, in early states, of the reaction to a given characteristic and its interaction with the genotype. In this study, a RAPD marker linked to resistance of Musa to F. oxysporum is reported. Eight susceptible and ten resistant/tolerant entrances evaluated in the field were used. The RAPD patterns obtained with the primer OPK-03 detected a major fragment of 485bp, only found in the susceptible entrances and absent in the resistant/tolerant entrances. The study of genetic relations between the genotypes susceptible and resistant/tolerant to F. oxysporum, using RAPD primers, defined the existence of an associated polymorphic pattern to the resistance to the disease.

MARCADOR RAPD ASSOCIADO À RESISTÊNCIA A Fusarium oxysporum EM Musa

RESUMO

A Murcha de Fusarium constitui uma das enfermidades mais destrutivas em Musa, sendo causada pelo fungo do solo Fusarium oxysporum f. sp. cubense. Não contamos com controle químico disponível, sendo a utilização de genótipos resistentes/tolerantes ao patógeno a única medida de controle possível. O desenvolvimento das técnicas moleculares tem permitido a determinação de marcadores associados a determinadas condições de importância econômica, constituindo uma estratégia de seleção rápida, confiável e reproduzível que acelera o melhoramento através do conhecimento, em estágios prematuros, da reação a uma característica dada e sua interação com o genótipo. Neste estudo se determinou um marcador RAPD associado à resistência de Musa a F. oxysporum utilizando oito clones susceptíveis e dez clones resistentes/tolerantes avaliados no campo para a reação à enfermidade. Encontrou-se que o padrão obtido com o iniciador OPK-03 produziu um fragmento de amplificação específico de 485pb presente nos clones susceptíveis e, ausente nos clones resistentes/tolerantes. O estudo das relações genéticas entre genótipos susceptíveis e os resistentes/tolerantes a F. oxysporum, empregando iniciadores RAPD, definiu a existência de um padrão polimorfo associado à resistência à enfermidade.

PALABRAS CLAVE / Banana / Mal de Panamá / Marcador RAPD / Selección Asistida por Marcadores /

Recibido: 12/02/2007. Modificado: 27/09/2007. Aceptado: 28/09/2007.

Introducción

Los plátanos y bananas son el cuarto cultivo más importante del mundo, después del arroz, el trigo y el maíz, siendo las frutas de exportación de mayor importancia del planeta (FAO, 2004). Además de constituir el alimento básico de cerca de 500 millones de personas, representan una importante fuente de empleo e ingresos en numerosos países en desarrollo. Se cultivan tanto en zonas tropicales como subtropicales, bajo diferentes sistemas, en 10 millones de ha en 120 países, con rendimientos entre 7 y 70ton·ha^-1 (FAO, 2004). Los países latinoamericanos y del Caribe producen el 90% del total de los plátanos y bananas que entran en el comercio internacional (FAO, 2004).

El genero Musa L., familia Musaceae, esta representado por un amplio rango de cultivares diploides, triploides y tetraploides de plátanos y bananas originados principalmente por hibridizaciones intra e interespecíficos de dos especies diploides silvestres, M. acuminate Colla y M. balbisiana Colla, con genomas A y B, respectivamente (Crouch et al., 2000; Silvana et al., 2003). Bananas y plátanos se producen en la mayoría de los países, crecen en un amplio rango de ambientes y producen frutos durante todo el año.

El hongo Fusarium oxysporum f. sp. cubense causa en Musa el marchitamiento o mal de Panamá, que es una de las enfermedades más destructivas en el cultivo y más ampliamente distribuida a nivel mundial. No hay control químico o cultural disponible, siendo la utilización de genotipos resistentes/tolerantes al patógeno (Buddenhagen, 1990; Javed et al., 2004) la única manera de combatirla. El avance de los métodos de mejoramiento convencionales en Musa es generalmente impedido por la esterilidad causada por la condición triploide o por factores genéticos en el caso de los diploides (Javed y Othman, 2005).

La selección en el campo de genotipos resistentes o tolerantes a la marchitez por Fusarium es un proceso tedioso, costoso, largo y de intensas labores (Ho, 1999; Asif et al., 2004), y los resultados necesitan ser confirmados por varios ciclos de selección. El desarrollo de estrategias de selección rápidas, confiables y reproducibles puede acelerar la selección y procurar consecuentemente el mejoramiento genético de los cultivos. Es aquí donde las técnicas de marcadores moleculares constituyen una poderosa herramienta a través de su uso, entre otros, en estudios de diversidad, caracterización de germoplasma, huellas genéticas y de marcadores moleculares asociados a una determinada característica.

La técnica de amplificación aleatoria de ADN polimórfico RAPD; (Williams et al., 1990, 1993; Welsh y McClelland, 1990) ha sido empleada en Musa con varios propósitos, entre los cuales se encuentran estudios de diversidad genética a fin de separar accesiones de genotipos AAB y ABB (Pillay et al., 2000, 2001; Visser, 2001; Uma et al., 2006), identificar genomas AA, AAA, AAB, ABB y BB (Howell et al., 1994; Thu et al., 2002), detectar variantes somaclonales (García y Jiménez, 1999; Martin et al., 2006; Ray et al., 2006; Venkatachalam et al., 2007), identificar enanismo en bananas Cavendish (Damasco et al., 1996; Gubbuk et al., 2004; Ramaje et al., 2004) y detectar mutantes obtenidos por irradiación (Kaemmer et al., 1992). Dicha técnica también ha sido utilizada en estudios de reacción a enfermedades en Musa, tales como identificación de genotipos resistentes y susceptibles a Sigatoca amarilla (Vidal y García, 2000), e identificación de genotipos resistentes/tolerantes y susceptibles a Fusarium oxysporum (Javed et al., 2004; Javed y Othman, 2005).

El presente estudio pretende localizar marcadores que se encuentren asociados a la resistencia de Musa al F. oxysporum utilizando clones susceptibles y resistentes/tolerantes evaluados en el campo para la reacción a la enfermedad, de modo que puedan ser empleados en un programa de mejoramiento.

Materiales y Métodos

Material Vegetal

Se utilizó tejido foliar joven de plantas del Banco de Germoplasma de Musáceas del Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas, Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA-CENIAP), Maracay, Venezuela. Se emplearon 10 clones referidos en la literatura como genotipos resistentes/tolerantes a F. oxysporum: Musa acuminata (AA), Pigmeo enano (AAA), Pigmeo gigante (AAA), Clon 58 (AAA), Clon 59 (AAA), Gran nai (AAA), Valery (AAA), Fhia-1 (AAAB), Fhia-2 (AAAA) y Fhia-3 (AABB) y 8 clones referidos como genotipos susceptibles: Higate (AAA), Cuyaco (AAA), Cambur manzano amarillo (AAB), Cambur manzano enano (AAB), Cambur manzano verde (AAB), Cambur manzano pseudo tallo morado (AAB), Cuyaco gigante (AAA) y Coco (AAA); (Ploetz, 1992, 1994; Stover y Buddenhagen, 1986; Companioni et al., 2005).

Extracción de ADN

La extracción de ADN se realizó en tejido foliar joven utilizando la metodología de miniextracción descrita por Zambrano et al. (2002), procediéndose a la determinación de su cantidad y calidad a través de electroforesis en geles de agarosa visualizados con bromuro de etidio.

Amplificación de RAPD

La amplificación de los RAPDs fue realizada según Zambrano et al. (2003) en una mezcla de reacción final de 25μl conteniendo 10mM Tris HCl (pH 9,0); 50mM KCl; 0,1% Triton^® X-100; 2,5mM MgCl₂; 200μM de cada uno de los dNTPs, 0,2µM de iniciador, 1ng de albúmina de suero bovino, 25ng de ADN genómico y 0,5U de Taq ADN polimerasa (Promega). La mezcla de reacción fue cubierta con 15μl de aceite mineral. Para la amplificación fueron utilizados los siguientes iniciadores de Operon Technologies: OPA-04, OPA-06, OPA-07, OPA-10, OPA-15, OPB-04, OPB-06, OPB-07, OPB-10, OPC-03, OPC-06, OPC-13, OPC-14, OPK-03, OPK-05, OPK-15, OPK-16, OPK-18, OPK-20, OPM-03, OPM-04, OPM-07, OPM-10, OPM-14, OPM-18, OPM-20, OPY-03, OPY-06, OPY-07 y OPY-18. La amplificación fue realizada en un termociclador MJ Research PTC 200, según programa señalado en Zambrano et al. (2003), empleando un ciclo de de-naturalización inicial a 94ºC por 5min, seguido de 45 ciclos de amplificación con un segmento de de-naturalización a 94ºC por 1min, un segmento de alineamiento a 36°C por 30s, y extensión a 72ºC por 2min, y un ciclo final de extensión a 72ºC por 7min. La separación de los productos de PCR se realizó en geles de agarosa al 1,5% corridos con buffer Tris-borato (1X) pH 8,30:por 1,5h a 70V y un máximo de 20mA, visualizados con bromuro de etidio bajo luz UV, usando como marcador de peso molecular ADN de fago l doblemente digerido con las endonucleasas HindIII y EcoRI. Con la finalidad de evaluar la reproducibilidad de los productos de amplificación de los RAPDs se realizaron tres repeticiones, seleccionando solo los polimorfismos que se mantenían en las tres réplicas. Los geles fueron digitalizados con un Gel Doc 2000 BIO RAD.

Análisis de Datos

Los fragmentos de amplificación obtenidos fueron codificados como 0 y 1 para fragmentos ausentes y presentes, respectivamente. Para determinar el nivel de polimorfismos y la capacidad discriminatoria de cada iniciador se calculó el porcentaje de bandas polimórficas, el contenido de información polimórfica (PIC) y el error estándar Bootstrap asociado a estos (Anderson et al., 1993). Se determinó la probabilidad de obtener parejas idénticas de alelos en los clones según metodología descrita por Wetton et al. (1987) y Ramakrishna et al. (1994), modificada por Demey et al. (2003). Las relaciones genéticas entre los clones de Musa fueron estudiadas a través de la representación gráfica generada por el análisis de coordenadas principales (ACoP) y el biplot logístico externo (Vicente-Villardón et al., 2006; Demey et al., 2006a) usando como medida de disimilitud la debida al coeficiente de Dice (Sneath y Sokal, 1973). Medidas de calidad de representación de individuos, grupos y variables (fragmentos de amplificación) fueron calculadas según metodología descrita por Demey et al. (2006a).

Todos los análisis se realizaron utilizando programas desarrollados en MATLAB versión 2006a (MathWorks, 2006).

Resultados y Discusión

El método de extracción de ADN fue simple, rápido y eficiente, produciendo entre 200 y 250ng/µl de ADN de buena calidad. De los treinta iniciadores de Operon Technologies utilizados solo ocho, OPB-07, OPK-03, OPK-05, OPK-15, OPM-04, OPM-10, OPM-14 y OPM-18 amplificaron, produciendo un total de 41 fragmentos reproducibles, de los cuales el 80,49% polimórficos con un tamaño entre 377 y 1346 pares de bases (pb) y una proporción de repetibilidad de 100%. La Tabla I muestra que los iniciadores OPB-07, OPK-03, OPK-05 y OPK-15 fueron los más informativos, con valores de PIC superiores al 70% del intervalo teórico de 0,01 a 0,50.

La capacidad discriminatoria evaluada a través de la probabilidad de que dos clones diferentes tengan igual identidad muestra que los iniciadores con mayor PIC tienen mayor capacidad discriminatoria, con excepción del OPK-03. La probabilidad media de que dos clones diferentes tengan igual identidad utilizando los 8 iniciadores es de 1,57x10^-71, estimación basada en el supuesto de que los fragmentos de amplificación generados por diferentes iniciadores no se superponen (Ramakrishna et al., 1994). Bajo este supuesto hasta 10⁷¹ clones pueden ser comparados simultáneamente en la región del genoma explorada con un alto grado de confianza en la identificación.

Los ocho iniciadores usados produjeron fragmentos polimórficos en los genotipos susceptibles y resistentes a F. oxysporum. Sin embargo, el iniciador OPK-03 produjo un fragmento de amplificación específico de 485pb presente en los genotipos susceptibles y ausente en los genotipos resistentes/tolerantes (Figura 1). Estos resultados concuerdan con los señalados por Javed et al. (2004) y Javed y Othoman (2005) referente a la asociación de un fragmento de amplificación RAPD específico en genotipos susceptibles a F. oxysporum de 400 y 300pb con los iniciadores OPA-03 y PRI-24, respectivamente, y de 1000pb con el iniciador PRI-21 en los genotipos resistentes al hongo.

La Figura 2 muestra la representación bi-dimensional generada por el análisis de coordenadas principales (ACoP), las dos primeras dimensiones explican el 87,79% de la inercia total. El diagrama de dispersión generado por la descomposición de la matriz de disimilitud debida al coeficiente de Dice para el iniciador OPK-03 revela una capacidad discriminatoria específica y permite la formación de dos grupos principales; el primero constituido por los clones resistentes/tolerantes con un promedio de similaridad genética de 0,9336 y un error estándar Bootstrap de 0,0106 y el segundo grupo con un promedio de similaridad genética de 0,9724 y un error estándar Bootstrap de 0,0091 conformado por los clones susceptibles. La calidad de representación de los dos grupos, calculada con los dos ejes retenidos, fue de 89,50% y 92,13%. La bondad de ajuste global, medida como porcentaje de clasificación correcta después de ajustar el biplot logístico, fue de 100%. Aunque el iniciador OPK-03 fue el de menor capacidad discriminatoria entre los más informativos (Tabla I), muestra especificidad en la separación de los clones respecto a la reacción a F. oxysporum.

Adicionalmente, la Figura 2 muestra las regiones de predicción para los fragmentos polimórficos basadas en las proyecciones de los clones sobre los vectores de cada fragmento usando la regresión logística. La ecuación de la regresión predice la probabilidad que ese fragmento de amplificación esté presente en ese clon. Los fragmentos de 485pb y 594pb son representados por líneas que señalan en la dirección de las predicciones en función de la probabilidad y su largo esta inversamente relacionado con la capacidad discriminatoria de cada fragmento, es decir, la capacidad de predecir la presencia o ausencia del fragmento de amplificación en cada clon. Esta metodología es una alternativa a la forma clásica de representación, ya que permite visualizar de manera confiable las relaciones entre individuos y/o variables (Demey et al., 2006a, b).

El análisis de la Figura 2 revela que el fragmento de 485pb es el de mayor capacidad discriminatoria, está negativamente correlacionado con el de 594pb y confirma la utilidad del iniciador OPK-03 en la diferenciación de clones resistentes/tolerantes a F. oxysporum. Así mismo, el fragmento de 594pb, que divide en dos subgrupos a los dos grupos principales señalados, se puede asociar a la ubicación de los grupos genómicos a su centro de diversidad. IPGRI (2006) señala el este de África como el centro de diversidad del genoma AAA, en tanto que el oeste y centro de África y Melanesia como el centro de diversidad de los genomas AAB, parte de AAA, diploides y tetraploides.

Este tipo de estudio representa una herramienta rápida, sencilla, económica y reproducible para detectar variación genética asociada a la resistencia/tolerancia a F. oxysporum en programas de mejoramiento de Musa asistido por selección utilizando marcadores moleculares. Los resultados demuestran la sensibilidad de la técnica RAPD para identificar marcadores asociados a características de interés agronómico. Adicionalmente se muestra que, aunque por su naturaleza de marcador dominante no permite discernir sobre el grado de co-dominancia, estos estudios son útiles en la discriminación de cultivares con niveles de ploidía variable.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen el financiamiento del Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA), Venezuela (Proyecto Nº 602-04001).

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