Perfil de aminoácidos de la proteína unicelular de kluyveromyces marxianus var. Marxianus.

Gisela Páez, Eduardo Jiménez, Zulay Mármol, José Ferrer, Betzabé Sulbarán, Graciela Ojeda, Karelen Araujo y Marisela Rincón

Gisela Páez. Ingeniera Química y Magíster en Ingeniería Química, La Universidad del Zulia (LUZ), Venezuela. Profesora, LUZ, Venezuela.

Eduardo Jiménez. Ingeniero Químico, LUZ, Venezuela. Coordinador, SIMCA, Venezuela.

Zulay Mármol. Ingeniera Química y Magíster en Ingeniería Química, LUZ, Venezuela. Profesora, LUZ, Venezuela.

José Ferrer. Ingeniero Químico y Magíster en Ingeniería Química, LUZ, Venezuela. Profesor, LUZ, Venezuela.

Betzabé Sulbarán. Ingeniera Química y Magíster en Ciencia y Tecnología de los Alimentos, LUZ, Venezuela. Profesora, LUZ, Venezuela.

Graciela Ojeda. Ingeniera Química y Magíster en Ciencia y Tecnología de los Alimentos, LUZ, Venezuela. Profesora, LUZ, Venezuela.

Karelen Araujo. Ingeniera Química y Magíster en Ciencia y Tecnología de los Alimentos, LUZ, Venezuela. Profesora LUZ. Venezuela. Dirección: Laboratorios de Tecnología de alimentos y Fermentaciones Industriales. Facultad de Ingeniería de la Universidad del Zulia. Apartado 526. Maracaibo, Estado Zulia, Venezuela. e-mail: karelenaraujo@gmail.com

Marisela Rincón. Ingeniera Química y Magíster en Ingeniería Química, LUZ, Venezuela. Profesora, LUZ, Venezuela.

RESUMEN

Se estudió el perfil de aminoácidos de la proteína unicelular (PUC) de la levadura Kluyveromyces marxianus var. marxianus (ATCC 8554) utilizando lactosuero como sustrato. Los bioprocesos se llevaron a cabo por triplicado a pH 5,0; 30°C y 200rpm durante 12h en un biorreactor Bioflo^® 4000. Se caracterizó la humedad, lípidos y proteína cruda de la biomasa obtenida. Para el análisis del perfil de aminoácidos se utilizó un cromatógrafo líquido de alta resolución. La derivatización de los aminoácidos libres se realizó con fenilisotiocianato. Los resultados indicaron que el contenido de proteína cruda en K. marxianus es de 42,19%. El contenido de lisina (5,47 ±3,0%) y de treonina (15,21 ±2,6%) en esta proteína son mayores que en la proteína de la harina de trigo. El aminoácido encontrado en mayor cantidad es el ácido glutámico, característico de organismos unicelulares, mientras que la metionina es el aminoácido obtenido en menor proporción. El perfil de aminoácidos muestra una distribución equilibrada del contenido de éstos en la proteína unicelular de K. marxianus en comparación a los patrones de referencia internacionales de la FAO, lo que sugiere el uso potencial de esta proteína unicelular como fuente proteica.

Amino acids profile of the single cell protein from kluyveromyces marxianus var. Marxianus.

SUMMARY

The amino acids profile of the single cell protein from Kluyveromyces marxianus var. marxianus (ATCC 8554) growing in whey as substrate was studied. The bio-processes were carried out by triplicate to pH 5.0, 30°C and 200rpm during 12h in a Bioflo^® 4000 biorreactor. Humidity, lipids and crude protein content of the biomass obtained were measured. For the analysis of the profile of amino acids a liquid chromatograph of high resolution was used. The derivatization of the free amino acids was carried out with phenilisotiocianate. Results indicated a crude protein content in K. marxianus of 42.19%. The content of lysin (5.47 ±3.0%) and threonin (15.21 ± 2.6%) in this protein are higher than in wheat flour protein. The amino acid found in the highest amount is glutamic acid, characteristic of unicellular organisms, whereas the methionin is the amino acid obtained in smaller amount. The profile of amino acids obtained shows a reasonable distribution of the content of these in the unicellular protein of K. marxianus in comparison to the international reference patterns of FAO, which suggests the potential use of this unicellular protein like protein source.

Perfil de aminoácidos da proteína unicelular de kluyveromyces marxianus var. Marxianus.

RESUMO

Estudou-se o perfil de aminoácidos da proteína unicelular (PUC) da levedura Kluyveromyces marxianus var. marxianus (ATCC 8554) utilizando lactossoro como substrato. Os bio-processos se realizaram por triplicado a pH 5,0; 30°C e 200rpm durante 12h em um bioreator Bioflo^® 4000. Caracterizou-se a umidade, lipídeos e proteína crua da biomassa obtida. Para a análise do perfil de aminoácidos se utilizou um cromatógrafo líquido de alta resolução. A derivatização dos aminoácidos livres se realizou com fenilisotiocianato. Os resultados indicaram que o conteúdo de proteína crua em K. marxianus é de 42,19%. O conteúdo de lisina (5,47 ±3,0%) e de treonina (15,21 ±2,6%) nesta proteína são maiores que na proteína da farinha de trigo. O aminoácido encontrado em maior quantidade foi o ácido glutâmico, característico de organismos unicelulares, enquanto que a metionina foi o aminoácido obtido em menor proporção. O perfil de aminoácidos mostra uma distribuição equilibrada do conteúdo destes na proteína unicelular de K. marxianus em comparação aos padrões de referencia internacionais da FAO, o que sugere o uso potencial desta proteína unicelular como fonte protéica.

PALABRAS CLAVE/ Kluyveromyces marxianus/ Perfil de Aminoácidos/ Proteína Unicelular/

Recibido: 11/06/2007. Modificado: 25/02/2008. Aceptado: 29/02/2008.

Introducción

El alto contenido de proteína en la biomasa microbiana determina su uso potencial en la alimentación humana y animal, ya que actualmente las fuentes convencionales, agricultura, ganadería y pesca, no satisfacen la demanda de alimentos, situación que se ve agravada por el incremento alarmante de la población mundial.

Las levaduras de Kluyveromyces, Candida, Schwanniomyces, Lipomyces, Pichia, Rhodotorula y Saccaromycopsis son ideales para la producción de proteína unicelular (PUC). Se caracterizan (Anupama y Ravindra, 2000; Ferrer et al., 2004) por tener un metabolismo fermentativo débil, no presentan efecto glucosa y crecen sobre diferentes sustratos: melazas, lactosuero (Kluyveromyces), metanol (Pichia), hidrolizado ácido de bagacillo de caña de azúcar (Saccharomyces cerevisiae y Candida utilis), aguas residuales amiláceas (Shwanniomyces), licor sulfítico de la industria papelera o n-alcanos (Candida). Sin embargo, en la selección de un microorganismo para su uso en la producción de PUC se debe considerar criterios basados en el contenido proteico de las células, perfil de aminoácidos, velocidad de crecimiento en un sustrato determinado, toxicidad, valor calorífico, eficiencia de conversión de sustrato, digestibilidad y seguridad del producto. (De Cabrera y Rolz, 1980). La composición de la biomasa producida por levaduras varía según la especie, pero tiene en común un alto porcentaje de lisina y baja cantidad de aminoácidos azufrados; nutricionalmente es importante por el contenido de ácidos grasos insaturados (oleico y linoleico), de esteroles y vitaminas, especialmente del grupo B, a pesar de los altos niveles de ácidos nucleicos (Leveau y Bovix, 2000). La proteína obtenida de fuentes no convencionales puede suplementar o complementar dietas de los animales de granja tales como cerdos, pollos y pavos (De Cabrera y Rolz, 1980; FAO, 1974).

El objetivo de esta investigación fue determinar el perfil de aminoácidos de la proteína microbiana de Kluyveromyces marxianus var. marxianus utilizando lactosuero como sustrato para establecer su uso potencial como fuente proteica.

Materiales y Métodos

El estudio se realizó en el Laboratorio de Fermentaciones Industriales de la Facultad de Ingeniería y en el Laboratorio de Tecnología de Alimentos de la Facultad Experimental de Ciencias de la Universidad del Zulia, Venezuela.

Microorganismo

Se utilizó la levadura Kluyveromyces marxianus var. marxianus ATCC 8554, proveniente de la American Type Culture Collection (ATCC), activada y mantenida en tubos de cultivo de 25´150mm con YM Bacto agar en forma de cuña. Los tubos fueron incubados aeróbicamente en una incubadora Innova^® 4300 (New Brunswick Scientific; Edison, NJ, EEUU) por un lapso no mayor de 48h a 30ºC y luego almacenados a 5ºC por un periodo no mayor a ocho días, hasta su uso (Quintero et al., 2001).

Lactosuero

Se empleó suero de leche ácido, proveniente de la última etapa de producción (queso ricota), suministrado por la empresa Venelacteos, ubicada en Santa Rosa de Agua, Maracaibo, Estado Zulia, Venezuela. El suero fue desproteinizado utilizando una membrana de ultrafiltración (Muñi et al., 2005).

Producción de la biomasa

La fermentación se realizó por carga y triplicado en un bioreactor Bioflo^® 4000 (New Brunswick Scientific; Edison, NJ, EEUU) con un volumen de trabajo de 3 litros, a 30°C, pH 5,0 y 200rpm, durante 12h. El inóculo (10% del volumen total de trabajo) se preparó añadiendo a cada 100ml del medio el contenido de una cuña de microorganismo activador (10ml). Luego se incubó a 30ºC y 200rpm durante 8h en una incubadora Innova 4300 (Quintero et al., 2001).

La biomasa obtenida de la fermentación se filtró con papel Millipore^TM de 0,22 μm, luego se colocó en una estufa marca Memmert^® entre 95-100°C por 5h, hasta peso constante. La biomasa seca se trituró y tamizó hasta 25mm (malla #60).

Métodos de análisis

El pH del lactosuero se midió con un potenciómetro Metrohom modelo 744 (Herisau, Suiza). La concentración de lactosa se determinó según Dubois et al. (1956). El contenido de nitrógeno, la cantidad de proteína y de humedad se determinaron siguiendo los métodos establecidos por la AOAC (1994). Los lípidos se determinaron siguiendo la norma COVENIN 1219-8 (COVENIN, 1997).

Determinación de perfil de aminoácidos y amoníaco

El patrón utilizado para el análisis fue el AA-STD-18 (Sigma; St. Louis, MO, EEUU), constituido por: L-ácido aspártico, L-ácido glutámico, L-alanina, L-arginina, L-cisteína, L-fenilalanina, L-glicina, L-histidina, L- isoleucina, L- leucina, L-lisina, L-metionina, L-prolina, L-serina, L-tirosina, L-treonina, L-valina y amoníaco, en concentraciones de 2,5µmol·ml^-1 en 0,1N HCl, con excepción de la L-cisteína (1,25µmol·ml^-1). El procedimiento de preparación e hidrólisis de la muestra se basó en el método PICO-TAG™ de Waters Corporation (1995).

Se utilizó un cromatógrafo líquido de alta resolución, integrado por una bomba Waters 660, un detector UV Waters 996 y un equipo de inyección automática Waters 717; una columna C₁₈ (dimetiloctadecilsilil con silica amorfa) Nº 88131 de 3,9´150mm como fase estacionaria. La derivatización de los aminoácidos libres se realizó con fenilisotiocianato (PITC; reactivo de Edman) Pierce^® CAS 103-72-0. Se utilizó una solución amortiguadora de acetato/acetonitrilo a pH 6,40, (eluente A) y una de agua/acetonitrilo (4:6), (eluente B) como fase movil. El flujo fué de 1,0mL·min^-1 y la temperatura de la columna 30ºC. 25µl  de las  muestras y el patrón de aminoácidos se  diluyeron en una solución amortiguadora  de fosfato/acetonitrilo pH 7,40. La detección  se realizó a 254nm. Las corridas cromatografías se realizaron por triplicado.

Resultados y Discusión

En la Tabla I se presenta la caracterización del lactosuero. Los valores de pH, humedad y proteínas para suero fresco coinciden con los reportados por Badu (1999) y el contenido de lactosa en suero fresco (5,67 ±0,05) y desproteinizado (5,92 ±0,09) concuerda con los resultados de Araujo et al. (2007). Se observa que la concentración de lactosa se incrementa levemente luego de la desproteinización, mientras que el porcentaje de proteínas disminuye considerablemente, indicando la eficiencia del método empleado.

Los contenidos porcentuales de proteína (42,19 ±0,88) y de humedad (75,0 ±0,70) de la biomasa obtenida levadura de K. marxianus concuerdan con los valores reportados por la literatura (Quintero et al., 2001), mientras que el de lípidos (4,10 ±0,09) es mayor, pero se halla dentro del rango (2-7%) establecido para lípidos en biomasa generada por levaduras. (Quintero, 1993; De Cabrera y Rolz, 1980).

La separación cromatográfica de los aminoácidos contenidos en la biomasa obtenida se muestra en la Figura 1. Se aprecia una buena resolución debido a que no hay solapamiento de picos (Skoog y Leary, 1994). Las condiciones de gradiente optimizaron el espaciamiento entre los picos y disminuyeron el tiempo de análisis. Se demostró la linealidad de la reacción en el rango de interés analítico (Lindroth y Mopper, 1979; Skoog y Leary, 1994) para lo cual se derivatizaron e inyectaron al cromatógrafo cantidades de los patrones que variaron entre 0,0375 y 0,0750µmol. Se obtuvo una respuesta lineal en el rango mencionado y los coeficientes de correlación estuvieron en promedio alrededor de 0,999.

La Tabla II muestra la cantidad relativa de aminoácidos contenida en la biomasa producida por la levadura de Kluyveromyces marxianus var. marxianus ATCC 8554 en relación con otros microorganismos creciendo en diferentes sustratos y otras fuentes nutritivas. El aminoácido encontrado en mayor cantidad es el ácido glutámico, característico de organismos unicelulares (FAO, 1974; Fennema, 1996; Murria et al., 2004). Un comportamiento similar puede observarse en los valores para el resto de las levaduras reflejadas en la Tabla II. Las cantidades de los aminoácidos azufrados (metionina y cisteína) fueron bajas, algo común en levaduras y otros microorganismos utilizados para la producción de proteína unicelular (De Cabrera y Rolz, 1980; Quevedo et al., 1999). La metionina se encontró en menor proporción (1,73g/100g proteína) y por ello en algunas dietas es común agregar este aminoácido (Quintero, 1993), mientras que valina y cisteína no fueron detectables. El contenido de lisina es similar a la del huevo entero y superior a la del trigo (Civitelli et al., 1992), tendencia que se mantuvo en la leucina e isoleucina. Comparando este perfil con los obtenidos de otras fuentes de proteína unicelular se observó que la biomasa de K. marxianus posee una cantidad mayor de treonina a la reportada por otros autores (Quevedo et al., 1999; García et al., 1993).

La relación Thr/Lys resultó ser mayor (Tabla III) en comparación con algunas fuentes convencionales de proteína como el trigo, la harina de soya, girasol y leche descremada en polvo (Fennema, 1994; Van Der Broecke et al., 1994).

Conclusiones

El perfil de aminoácidos obtenido muestra una distribución equilibrada del contenido de éstos en la proteína unicelular de K. marxianus, al compararlo a los patrones de referencia internacionales (FAO) y a la proteína de huevo y otras fuentes convencionales de proteínas, lo que sugiere el uso potencial de esta proteína unicelular (PUC) como fuente proteica.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico (CONDES) de la Universidad del Zulia por el financiamiento de este estudio.

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