Evidencias de la transmisión acuática de Helicobacter Pylori

Milagro Fernández-Delgado ¹, Mónica Contreras ², María Alexandra García-Amado ³, Fabián Michelangeli ⁴ y Paula Suárez ⁵

¹ Licenciada en Bioanálisis, Universidad de Carabobo, Venezuela. Estudiante de Doctorado, Universidad Simón Bolívar, (USB) Sartenejas, Venezuela. e-mail: milagro.fernandez@gmail.com

² Doctora en Microbiología General, Université de Paris XI, París, Francia. Investigadora, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), Venezuela. e-mail: mocontre@ivic.ve

³ Doctora en Ciencias Biológicas, USB, Venezuela. Investigadora, IVIC, Venezuela. e-mail: magarcia@ivic.ve

⁴ Doctor en Fisiología, University of California, San Francisco, EEUU. Investigador, IVIC, Venezuela. e-mail: fabian@ivic.ve

⁵ Doctora en Ciencias Biológicas, USB, Venezuela. Profesora, USB, Venezuela. Dirección: Departamento de Biología de Organismos, USB, Caracas 1080, Venezuela. e-mail: psuarez@usb.ve.

RESUMEN

Helicobacter pylori es agente causal de gastritis y úlcera duodenal y juega un rol importante en el desarrollo del cáncer gástrico. Más de la mitad de la población mundial está infectada con este microorganismo, considerándose en la actualidad uno de los patógenos humanos de mayor importancia. En vista de la incertidumbre existente acerca de su transmisión ambiental y a la dificultad de su detección en fuentes no humanas, en este trabajo se realiza una revisión acerca de la presencia de H. pylori en distintas fuentes de agua y sus estrategias de supervivencia en ambientes acuáticos. Estudios epidemiológicos han establecido que el agua contaminada con materia fecal es una fuente de infección, principalmente en países en vías de desarrollo. Diferentes métodos han sido evaluados para su detección en muestras de agua. Se han desarrollado técnicas basadas en el cultivo en medios selectivos, inmunofluorescencia, hibridación in situ por fluorescencia y PCR. A pesar del éxito obtenido con algunos de estos métodos, hasta el presente no existe un procedimiento estándar para la detección de este microorganismo en el agua. La formación de biopelículas y la persistencia bajo el estado viable no cultivable (VNC) en el agua han sido propuestas como estrategias de supervivencia de H. pylori en el ambiente. Futuros trabajos deberían dirigirse a optimizar la detección de H. pylori en muestras ambientales para esclarecer la vía de transmisión asociada al medio acuático.

PALABRAS CLAVE / Biopelículas / Estado VNC / Helicobacter pylori / Técnicas de Detección / Transmisión Acuática /

Evidences of aquatic transmission of Helicobacter Pylori

SUMMARY

Helicobacter pylori is a causing agent of gastritis and duodenal ulcer, and plays an important role in the etiology of stomach cancer. This organism infects over one half of the world population and it is currently considered as one of the most important human pathogens. In view of the existing uncertainty about its transmission from the environment and the difficulty of detecting it in non-human sources, a review is made in the present paper about the presence of H. pylori in different water sources and its survival strategies in aquatic environments. Epidemiological studies have established that, mainly in developing countries, water contaminated with feces is a source of infection. Different methods for detection in water have been evaluated. Techniques have been developed based on culture in selective media, immunofluorescence, in situ hybridization by fluorescence and PCR. Despite the success obtained with some of these methods, to date no standard procedure exists for the detection of this microorganism in water. Bio-film formation and the persistence in a viable non-cultivable (VNC) state in water have been proposed as survival strategies of H. pylori in the environment. Future work should focus on optimizing the detection of H. pylori in environmental samples so as to clarify the transmission path associated with the aquatic medium.

Evidências da transmisão aquática de Helicobacter Pylori

RESUMO

Helicobacter pylori é agente causal de gastrite e úlcera duodenal, e tem um papel importante no desenvolvimento do câncer gástrico. Mais da metade da população mundial está infectada com este microorganismo, considerando-se na atualidade um dos patógenos humanos de maior importância. Em vista da incertidumbre existente sobre sua transmissão ambiental e a dificuldade de sua detecção em fontes não humanas, neste trabalho se realiza uma revisão sobre a presença de H. pylori em distintas fontes de água e suas estratégias de sobrevivência em ambientes aquáticos. Estudos epidemiológicos têm estabelecido que a água contaminada com matéria fecal é uma fonte de infecção, principalmente em países em vias de desenvolvimento. Diferentes métodos têm sido avaliados para sua detecção em amostras de água. Tem-se desenvolvido técnicas baseadas no cultivo em meios seletivos, imunofluorescência, hibridização in situ por fluorescência e PCR. A pesar do sucesso obtido com alguns destes métodos, até o presente não existe um procedimento estándar para a detecção de este microorganismo na água. A formação de biopelículas e a persistência sob o estado viável não cultivável (VNC) na água tem sido propostas como estratégias de sobrevivência de H. pylori no ambiente. Futuros trabalhos deveriam dirigir-se a aperfeiçoar a detecção de H. pylori em amostras ambientais para esclarecer a via de transmissão associada ao meio aquático

Recibido: 16/08/2007. Modificado: 02/05/2008. Aceptado: 05/05/2008.

Helicobacter pylori es una bacteria patógena que coloniza el estómago de la mayoría de los humanos. Más del 50% de la población mundial se encuentra infectada, con proporciones superiores a 90% en países en vías de desarrollo, donde la mayoría de los casos son asintomáticos (Frenck y Clemens, 2003). La infección por H. pylori se puede adquirir durante la infancia, siendo mayor su prevalencia en grupos familiares grandes con alto hacinamiento y bajos niveles socioeconómicos y educacionales (Parsonnet, 1995; Malaty et al., 2002). En la actualidad, es considerada la causa más común de gastritis, úlceras gástricas y duodenales, adenocarcinoma y linfoma gástricos (Marshall et al., 1985; Blaser, 1990; Forman et al., 1991; Parsonnet et al., 1994). La habilidad de este microorganismo para causar enfermedad puede depender de la virulencia de la cepa infectante, la genética del hospedador y de factores ambientales (Clyne et al., 2007).

El modo de transmisión de este patógeno ha sido fuertemente debatido y hasta el momento no se ha determinado con exactitud (Engstrand, 2001; Kivi y Tindberg, 2006; Azevedo et al., 2007b). Dado que este microorganismo coloniza el tracto gastrointestinal, en particular la mucosa gástrica, y que se ha demostrado la presencia de formas potencialmente infecciosas en la saliva y las heces de individuos infectados, se han propuesto dos rutas de transmisión: la fecal-oral, mediante aguas contaminadas, y la oral-oral, mediante la saliva por contacto persona a persona e intrafamiliar (Drumm et al., 1990; Thomas et al., 1992; Madinier et al., 1997; Parsonnet et al., 1999; Leclerc et al., 2002). Se ha sugerido que la bacteria puede existir de forma natural en el ambiente (West et al., 1990; Klein et al., 1991; Shahamat et al., 1993). Estudios más recientes han evidenciado que el ambiente acuático puede ser un reservorio de H. pylori (Cellini et al., 2004; Carbone et al., 2005). Sin embargo, ninguna ruta per se es capaz de explicar con exactitud su transmisión. ¿Cómo el microorganismo abandona a su hospedador y entra en el ambiente?, ¿dónde reside en el ambiente? y ¿cuándo las personas adquieren la infección? son preguntas que todavía no han tenido respuesta (Parsonnet et al., 1999).

Muchas evidencias han demostrado que H. pylori está bien adaptado para adherirse a la mucosa gástrica. Sin embargo, es difícil establecer que ésta sea su único nicho ecológico (Hegarty et al., 1999; Leclerc et al., 2002). Diversos estudios epidemiológicos y ambientales son consistentes en plantear que el agua juega un rol importante en la transmisión (Klein et al., 1991; Goodman et al., 1996; Bunn et al., 2002; Cellini et al., 2004). Se ha determinado que H. pylori está presente en diversas fuentes de aguas: lagos, ríos, agua potable superficial y subterránea, aguas municipales y residuales y ambientes marinos costeros, encontrándose también como microorganismo libre en el agua de mar y asociado a organismos planctónicos (Tabla I).

TABLA I

MÉTODOS DE DETECCIÓN DE Helicobacter pylori EN AMBIENTES ACUÁTICOS

En vista de la importancia que ha adquirido la infección por H. pylori en la salud pública mundial y la incertidumbre existente acerca de su transmisión acuática, en este trabajo se lleva a cabo una revisión acerca de la presencia de este patógeno en distintas fuentes de agua y sus estrategias de supervivencia en los ambientes acuáticos.

Evidencias de la Transmisión Acuática de H. pylori

Las primeras evidencias sobre la ruta de transmisión acuática de este microorganismo a humanos fueron aportadas por estudios epidemiológicos realizados en algunos países en vías de desarrollo (Perú, Colombia, Chile y Venezuela). En Lima, Perú, Klein et al. (1991) demostraron la asociación entre la prevalencia de H. pylori en niños (48%) y el consumo de fuentes externas de agua (drenaje comunitario). Un estudio similar desarrollado con niños en un área rural de los Andes Colombianos determinó una prevalencia de H. pylori del 69%, incrementando las tasas de infección con el uso de arroyos como fuente de agua potable (Goodman et al., 1996). Otro trabajo realizado en una población chilena, encontró que la seropositividad a este patógeno fue superior a 60% en los grupos socioeconómicos más bajos, asociada al consumo de vegetales no procesados, los cuales pudieron haber sido irrigados con aguas residuales (Hopkins et al., 1993).

En Venezuela, Domínguez-Bello et al. (2002) encontraron que la frecuencia de infección por H. pylori es significativamente más alta (96%) durante los meses de lluvia, sugieriendo que esto podría ser debido a un aumento en la densidad bacteriana y/o a cambios de formas cocoides en estado de latencia a formas bacilares en división celular. Los resultados de estos estudios indican que el agua puede ser un intermediario en la transmisión fecal-oral, actuando como un reservorio en el cual la bacteria puede permanecer por períodos prolongados antes de ser ingerida como agua potable, accidentalmente durante el baño o a través de alimentos contaminados.

Métodos de Detección de H. pylori en Ambientes Acuáticos

En los últimos 15 años, la mayoría de los estudios se han orientado al desarrollo de métodos que demuestren la presencia de H. pylori en el agua, los cuales han contribuido a la hipótesis de la transmisión acuática de este patógeno. El cultivo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la inmunofluorescencia y la hibridación in situ por fluorescencia (FISH) son los principales métodos que han sido utilizados para determinar la presencia de H. pylori en diferentes fuentes de agua (Tabla I). A continuación se describe brevemente cada uno de estos métodos.

Cultivo

El cultivo de H. pylori en ambientes distintos al estómago humano ha sido difícil, debido a cambios morfológicos de esta bacteria y al sobrecrecimiento o competencia de otros microorganismos. Se han realizado esfuerzos por cultivar esta bacteria en muestras de agua usando medios de crecimiento alternativos bajo condiciones microaerofílicas variables (Hulten et al., 1996; Lu et al., 2002; Degnan et al., 2003; Moreno et al., 2003; Carbone et al., 2005). Hasta el presente, se han reportado algunos casos de cultivo viable de este patógeno a partir de muestras de aguas residuales, agua marina y asociado al plancton, confirmando la presencia de H. pylori por análisis de secuencias del gen 16S del ARNr (Lu et al., 2002; Cellini et al., 2005; Fernández et al., 2007). Debido a las dificultades que presentan las técnicas tradicionales de cultivo en recuperar este microorganismo del ambiente, la PCR y la inmunofluorescencia han sido usadas exitosamente para la detección de H. pylori.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La PCR es un método que permite la amplificación de genes específicos para detectar H. pylori en distintas fuentes de agua. Algunos de ellos, como ureA (ureasa); hpaA (adhesina); cagA (gen que codifica para la proteína inmunodominante CagA en la isla de patogenicidad, PAI cagA); y glmM (fosfoglucosamina mutasa), son los comúnmente seleccionados con la finalidad de evitar la reactividad cruzada entre H. pylori y otras bacterias. Sin embargo, otras especies bacterianas estrechamente relacionadas y subespecies desconocidas del género Helicobacter podrían interferir en los ensayos de PCR (Engstrand, 2001).

Diversos trabajos han detectado por PCR a este patógeno en ambientes acuáticos de distintas partes del mundo, donde existe contaminación fecal animal o humana (Tabla I). Otros estudios han considerado la separación inmunomagnética como un paso previo a la PCR para mejorar la sensibilidad de este método molecular y obtener una mayor recuperación de ADN (Enroth y Engstrand, 1995; Hulten et al., 1996; Hulten et al., 1998). La separación inmunomagnética consiste en el uso de perlas magnéticas cubiertas de anticuerpos específicos para antígenos de superficie de bacterias patógenas, que se aplica para separar y concentrar estos microorganismos a partir de muestras heterogéneas (Enroth y Engstrand, 1995).

Inmunofluorescencia

Las técnicas inmunológicas, entre ellas la inmunofluorescencia, son usadas para detectar, identificar y cuantificar antígenos en diferentes muestras. Esta técnica ha sido aplicada por algunos autores para determinar la presencia de H. pylori metabólicamente activa en fuentes de agua de consumo humano, utilizando un anticuerpo monoclonal anti-H. pylori marcado con un fluoróforo. En estos estudios se identificó H. pylori en muestras de agua y su asociación con la colonización gástrica (Tabla I); sin embargo, no se mostraron evidencias de la viabilidad de la bacteria en el agua. En vista que existen pocos estudios realizados con inmunofluorescencia y que el número de muestras no es representativo, se considera necesario nuevas investigaciones para demostrar la sensibilidad y especificidad de esta técnica inmunológica.

Hibridación in situ por fluorescencia (FISH)

Otra técnica de gran utilidad para la detección de este patógeno en muestras de agua es la hibridación in situ por fluorescencia (Moreno et al., 2003; Piqueres et al., 2006), la cual ha demostrado ser efectiva para la visualización de ácidos nucleicos de microorganismos morfológicamente intactos en su ambiente. El proceso involucra marcar sondas de ADN o ARN acopladas a un fluoróforo, seguido de su hibridación con la muestra y finalmente la visualización de las células marcadas usando microscopía de fluorescencia (Amann et al., 1990).

Pocos estudios han evaluado la efectividad de FISH para la detección directa de células viables de H. pylori en muestras de agua dulce, potable, marina (Tabla I) y agua tratada con hipoclorito de sodio (Moreno et al. 2007). Aunque esta técnica necesita una evaluación más exhaustiva, ha demostrado ser sensible, específica, cuantitativa y rápida para detectar células completas de H. pylori en muestras ambientales.

Estrategias de Supervivencia de H. pylori en Ambientes Acuáticos

Varias hipótesis han sido propuestas para explicar las estrategias de supervivencia de las bacterias patógenas como H. pylori en ambientes acuáticos. La formación de biopelículas, la asociación al plancton y el estado viable no cultivable (VNC) han sido las estrategias más importantes reportadas para este microorganismo y se describen a continuación.

Biopelículas

Las biopelículas son comunidades complejas de microorganismos adheridas a superficies o asociadas a interfases (Davey y O’toole, 2000). La supervivencia de microorganismos patógenos, incluyendo a H. pylori, puede ser prolongada por la colonización activa de biopelículas como las encontradas en los sistemas de almacenamiento y distribución de agua potable. Las biopelículas le proporcionan a la microbiota asociada un sustrato que le permite su multiplicación, la adquisición de nutrientes, el mantenimiento de un ambiente fisicoquímico apropiado y la resistencia a agentes antimicrobianos (Davey y O’toole, 2000; Park et al., 2001).

Existen estudios in vitro que evidencian la formación de biopelículas por H. pylori en medio de cultivo (Mackay et al., 1999; Stark et al., 1999; Cole et al., 2004). Azevedo et al. (2003), utilizando una nueva tecnología basada en sondas fluorescentes denominada ácidos nucleicos peptídicos (PNA, por sus siglas en inglés), demostraron que H. pylori forma biopelículas con otros microorganismos en un modelo de sistema de agua potable.

Otros autores han determinado la formación natural de biopelículas de este microorganismo en el agua potable. Park et al. (2001) detectaron Helicobacter sp. en una biopelícula de agua potable tomada de un sistema municipal de distribución de agua localizado en el noreste de Escocia. Sin embargo, la detección por PCR no fue confirmada por análisis de secuencias y no excluye la posibilidad de falsos positivos. A diferencia del estudio realizado por Park et al. (2001), Bunn et al. (2002) y Watson et al. (2004) demostraron la presencia del ADN de H. pylori en material de biopelículas de sistemas de distribución de agua, mediante la confirmación de la secuencia del gen 16S del ARNr. Trabajos recientes realizados por Braganra et al. (2007) detectaron mediante FISH, células de H. pylori en forma espiral (forma activa de la bacteria) en biopelículas presentes en sistemas de distribución de agua potable. Estos resultados evidencian que el agua potable puede ser una ruta de transmisión de H. pylori y que las biopelículas pueden actuar como ambientes de acumulación pasiva de especies de Helicobacter o como un reservorio importante de infección.

Asociación de H. pylori al plancton

Se ha demostrado que las bacterias asociadas al plancton en ambientes acuáticos sobreviven por períodos más prolongados que en su forma libre, posiblemente como una adaptación a los bajos niveles de nutrientes. El plancton provee de una fuente de C y N, así como protección contra el estrés y los cambios ambientales. La asociación de H. pylori al plancton ha sido de particular interés en tres estudios desarrollados en ambientes marinos. Se ha observado igualmente que la presencia de H. pylori fue mayor cuando ocurre la surgencia de copépodos (crustáceos microscópicos que forman parte del plancton), sugiriendo que estos organismos podrían representar un microhábitat favorable para la bacteria (Cellini et al., 2004; Carbone et al., 2005; Fernández et al., 2007). Adicionalmente, Cellini et al. (2005) demostraron que H. pylori podía salir del estado VNC solamente en presencia de un copépodo marino (Tigriopus fulvus), aportando evidencias sobre el papel de estos crustáceos en la supervivencia y transmisión de H. pylori. Otros estudios experimentales han reportado que H. pylori es capaz de propagarse y permanecer viable por muchas semanas dentro de una amiba de vida libre (Acanthamoeba castellanii) bajo condiciones experimentales (Winiecka-Krusnell et al., 2002). De forma similar a lo que ocurre con el plancton, esta amiba le aporta nutrientes y condiciones favorables a la bacteria para su crecimiento, y puede contribuir a su persistencia y propagación en el ambiente.

Por otra parte, Azevedo et al. (2006) demostraron que H. pylori forma agregados que se adhieren a superficies abióticas expuestas al agua. Las superficies de cobre fueron especialmente favorables para la permanencia de la bacteria en su forma espiral, así como para la formación de un gran número de aglomerados. Los autores sugieren que la coagregación con los consorcios heterotróficos autóctonos existentes en el agua es necesaria para la supervivencia a largo plazo de H. pylori a biopelículas asociadas a sistemas de agua potable. El estudio de la adhesión de H. pylori al plancton y a otras superficies abióticas en los ambientes acuáticos es importante para descifrar sus mecanismos de supervivencia y es un área que requiere de mayor investigación.

Estado viable no cultivable

En respuesta a condiciones de estrés ambiental, algunas bacterias adoptan un estado que se ha definido como viable no cultivable (VNC); viable porque mantiene la capacidad de realizar funciones metabólicas, y no cultivable porque no puede aislarse mediante métodos de cultivo en el laboratorio. Si las condiciones ambientales vuelven a ser favorables, el microorganismo puede retornar al estado cultivable. Durante el estado VNC las bacterias pueden permanecer adheridas a la superficie del fitoplancton y el zooplancton, manteniéndose por períodos prolongados en el medio marino (Borroto, 1998; Cellini et al., 2005; Oliver, 2005).

Al entrar en contacto con el agua, H. pylori es capaz de adoptar el estado VNC, transformándose de la forma típica espiral a una forma cocoide que probablemente dificulta su cultivo (Oliver, 2005; Bellack et al., 2006). Algunos autores consideran que la transformación a la forma cocoide puede ser la manifestación de la muerte celular (Kusters et al., 1997; Azevedo et al., 2004; Bellack et al., 2006) mientras que otros autores consideran que este estado es una forma durmiente y viable (Mizoguchi et al., 1998; Sisto et al., 2000; Adams et al., 2003; Saito et al., 2003; Oliver, 2005; Queralt y Araujo, 2007). Recientemente, Azevedo et al. (2007a) demostraron que la transformación a la forma cocoide es un proceso biológico activo que le permite a la bacteria protegerse de las condiciones adversas del ambiente. Por otra parte, Chaput et al. (2006) y Nagai et al. (2007) demostraron que la conversión de H. pylori a su forma cocoide en las células gástricas e intestinales estimula el sistema inmune del hospedador, indicando que la morfología cocoide es una forma viable y activa de la bacteria. En todo caso, la transformación de la bacteria a la forma cocoide y al estado VNC debe ser motivo de investigaciones más exhaustivas a fin de comprender las estrategias que utiliza este microorganismo para sobrevivir en el medio acuático.

Azevedo et al. (2008) evaluaron la viabilidad de diferentes especies de Helicobacter en agua en condiciones in vitro mediante técnicas de cultivo y de integridad de la membrana. Estos autores demostraron que diferentes cepas de Helicobacter pueden sobrevivir en agua por periodos prolongados, observando que H. pylori posee el mayor tiempo de supervivencia, sin encontrar diferencias entre especies gástricas y enterohepáticas. Este trabajo aporta evidencia del rol del agua en la transmisión de diferentes especies de Helicobacter.

La determinación de la viabilidad de H. pylori en el agua ha sido difícil, debido a que los métodos usados y descritos anteriormente deben mejorarse para distinguir entre células vivas y muertas (Bellack et al., 2006). La presencia de esta bacteria es sobreestimada por PCR, ya que esta técnica puede detectar el ADN de células muertas no viables o VNC, mientras que las técnicas de cultivo subestiman la presencia de este microorganismo debido a que la forma cocoide podría ser no cultivable (Queralt y Araujo, 2007)

La asociación al plancton, la formación de biopelículas y el estado VNC se han reportado también para otras bacterias patógenas de transmisión acuática como Vibrio cholerae (). En V. cholerae se ha demostrado la importancia de estas estrategias para la supervivencia y transmisión de esta bacteria en el medio acuático (Lipp et al., 2002; Lipp et al., 2003; Faruque et al., 2006). Recientemente se reportó que V. cholerae y H. pylori pueden coexistir en un medio de cultivo para aislar H. pylori a partir de muestras de agua, plancton e invertebrados marinos en las costas de Venezuela (Fernández et al., 2007). Estos resultados evidencian que el agua puede ser una ruta de transmisión común para estas dos bacterias, aunque se requieren más estudios para demostrarlo.

Conclusión

Las evidencias epidemiológicas y microbiológicas indican la posibilidad que el agua actúe como un reservorio en la transmisión fecal-oral de H. pylori. La detección de este microorganismo en muestras de agua ha sido motivo de controversia, debido a que no existe una técnica estándar para su estudio. El cultivo de esta bacteria directamente del agua ha sido difícil, probablemente debido a su conversión a una forma no cultivable y al sobrecrecimiento de otros microorganismos en medios selectivos que arrojan resultados falsos negativos. Otras técnicas utilizadas para su detección en agua, tales como la PCR, FISH y la inmunofluorescencia, pueden arrojar resultados falsos positivos. Futuras investigaciones deberían dirigirse a optimizar las condiciones de cultivo de H. pylori en muestras de agua y continuar los estudios sobre los reservorios ambientales implicados en las vías de transmisión de este patógeno humano.

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