Parásitos Protozoarios entéricos en ambientes acuáticos: Métodos de concentración y detección

Walter Q. Betancourt ¹  y Luis J. Querales ²

¹ PhD. Ciencias Marinas, Universidad del Sur de Florida, EEUU. Investigador, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), Venezuela. Dirección: IVIC, Centro de Microbiología y Biología Celular. Laboratorio de Genética Molecular. Apartado Postal: 20632. Caracas, Venezuela 1020A. e-mail: wbetanco@ivic.ve

² Estudiante Doctoral del Postgrado en Ciencias Biológicas, Mención Microbiología. IVIC, Venezuela. e-mail: lquerale@ivic.ve

RESUMEN

La transmisión de parásitos protozoarios patógenos a través del agua representa uno de los problemas de salud pública más prominentes en el mundo entero. Los estudios sobre presencia de parásitos protozoarios en aguas son fundamentales para conocer a fondo la epidemiología de enfermedades que afectan a poblaciones humanas en diferentes zonas geográficas. De esta manera, se pueden implementar en todo el mundo las medidas de salud pública que permitan el control y prevención de enfermedades transmitidas a través del agua. Los métodos corrientes para el monitoreo de Cryptosporidium parvum, C. hominis y Giardia intestinalis son empleados para la detección de Toxoplasma gondii y Cyclospora cayetanensis en ambientes acuáticos. La combinación de nuevas técnicas de filtración y concentración junto con los métodos moleculares y cultivo celular forma parte de la estrategia científica dirigida a evaluar la significancia de microorganismos patógenos actuales y emergentes de interés para la salud pública. Este artículo revisa avances recientes en métodos de concentración y detección de protozoarios patógenos transmitidos a través del agua, cuya aplicación reviste importancia en ambientes acuáticos de toda América Latina, donde se requiere mayor investigación científica en esta área.

Waterborne enteric Protozoan Parasites: Concentration and detection methods

SUMMARY

Waterborne transmission of pathogenic parasitic protozoa represents one of the most prominent public health issues worldwide. Studies on occurrence of waterborne protozoan parasites are fundamental to the understanding of the epidemiology of waterborne diseases affecting human populations in different geographical regions. Thus, public health measures can be implemented to control and to prevent waterborne infectious diseases. Current methods for monitoring waterborne Cryptosporidium parvum, C. hominis and Giardia intestinalis are being applied for assessing the occurrence of waterborne Toxoplasma gondii and Cyclospora cayetanensis. The combination of novel filtration and concentration techniques along with molecular and tissue cell culture methods is part of the approach aimed to evaluate the public health significance of current and emerging waterborne pathogens. This paper reviews recent advances in concentration and detection methods that could be applied to assess occurrence of waterborne protozoan parasites in Latin America, where further research in this field is needed.

Protozoários Parasitas patogênicos em ambientes aquáticos: Métodos de concentração e detecção

RESUMO

A transmissão de patógenos pela água representa um dos problemas de saúde pública mais proeminentes no mundo. Os estudos sobre ocorrência de parasitas patogênicos são importantes para entender a epidemiologia das doenças que afetam populações humanas em regiões geográficas diferentes. Assim, as medidas de saúde pública podem ser implementados para controlar e prevenir a transmissão de doenças pela água. Os métodos atuais para detectar Cryptosporidium parvum, C. hominis e Giardia intestinalis são usados para determinar ocorrência de Toxoplama gondii e Cyclospora cayetanensis em ambientes aquaticos. A aplicação de novas técnicas para filtração e concentração junto com métodos moleculares e de cultura de células é parte da estratégia para avaliar a importância de parasitas patogênicos correntes e emergentes em águas. Em este artigo se faz uma revisão dos avanços recentes em métodos de concentração e detecção de protozoários patogênicos transmitidos pela água. A aplicação desses métodos em ambientes aquáticos da América Latina é importante, pois se requer maior pesquisa nessa área.

PALABRAS CLAVE / Aguas / Concentración / Detección / Métodos / Protozoarios /

Recibido: 27/11/2007. Modificado: 10/05/2008. Aceptado: 13/05/2008.

La transmisión ambiental de microorganismos patógenos constituye un medio altamente efectivo para la diseminación de enfermedades a una gran proporción de la población. La Organización Mundial de la Salud estima que un 24% de las enfermedades que ocurren en el mundo están asociadas con factores ambientales, entre ellos el agua de calidad insegura y precarias condiciones higiénicas (WHO, 2007). Los cuerpos de aguas naturales que reciben desechos fecales de animales y humanos contienen numerosos microorganismos patógenos capaces de sobrevivir fuera de su hospedero. Estos microorganismos son transmitidos indirectamente a poblaciones susceptibles a través de las aguas de distribución inadecuadamente tratadas o a través de aguas recreacionales fuertemente impactadas con aguas residuales y desechos fecales de animales domésticos (Hurst y Murphy, 1996).

Los parásitos protozoarios Giardia intestinalis (sinónimo para G. lamblia y G. duodenalis), Cryptosporidium parvum y C. hominis son patógenos intestinales excretados con las heces de humanos y animales infectados en concentraciones de hasta 1×10⁹ (oo)quistes por gramo de heces (Danciger y López, 1975; Pickering et al., 1984; Jokipii y Jokipii, 1986; Chappell et al., 1996; Morgan-Ryan et al., 2002; Chappell et al., 2006). Los (oo)quistes (abreviación para ooquiste y quiste) son las formas infectantes y constituyen un estadio del ciclo de vida de estos parásitos que los capacita para sobrevivir en el ambiente acuático y resistir los procesos de tratamiento de aguas de distribución y aguas de desecho doméstico (Betancourt y Rose, 2004). La ingestión no intencional de (oo)quistes infecciosos con las aguas y alimentos contaminados, así como la ingestión inadvertida de aguas contaminadas durante las actividades recreacionales, puede ocasionar problemas de salud pública. En países en vías de desarrollo, las enfermedades causadas por Cryptosporidium y Giardia forman parte del complejo grupo de enfermedades parasitarias que, junto con las enfermedades bacterianas y virales, son un factor que impide el avance potencial y el progreso social y económico de sus habitantes. Estos parásitos fueron incluidos recientemente en la Iniciativa de la Organización Mundial de la Salud para las enfermedades desatendidas (Savioli et al., 2006). La Iniciativa persigue abordar enfermedades parasitarias y otras enfermedades tropicales (entre ellas las helmintiasis intestinales, esquistosomosis, leishmaniasis, leptospirosis, etc.) de manera integrada a fin de garantizar el manejo efectivo (control y eliminación) de estas enfermedades (www.paho.org, www.who.int).

Numerosos brotes epidémicos de enfermedades gastrointestinales han ocurrido por transmisión indirecta de los parásitos protozoarios Giardia y Cryptosporidium a través de aguas de distribución y cuerpos de aguas naturales y artificiales (lagos, ríos, playas y piscinas) empleados para recreación (Thompson et al., 1993; MacKenzie et al., 1994; Fayer et al., 2000; Rose et al., 2002; Nygård et al., 2006). De igual manera, los protozoarios Cyclospora cayetanensis y Toxoplasma gondii han estado asociados con brotes de enfermedades transmitidas a través del agua (Benenson et al., 1982; Rabold et al., 1994; Bowie et al., 1997; Isaac-Renton et al., 1998; Aramini et al., 1999; Dubey, 2004; Schuster y Visvesvara, 2004; Karanis et al., 2007). A esta lista se suman los protozoarios intestinales Entamoeba histolytica y Balantidium coli, los cuales son considerados patógenos de atención para la salud pública y con potencial de transmisión a través de las aguas, particularmente en países en vías de desarrollo (Ashbolt, 2004; Karanis et al., 2007). En poblaciones de zonas urbanas y rurales de estos países son comunes las protozoosis intestinales ocasionadas por todos los parásitos anteriormente mencionados (Chacín-Bonilla et al., 1998, 2006a, b; Díaz et al., 2000; Xiao et al., 2001; Alarcón de Noya et al., 2003; Seppo et al., 2005).

La transmisión de los protozoarios intestinales Cryptosporidium y Giardia a través del agua se considera uno de los problemas de salud pública más prominentes en el mundo entero (Rose et al., 2002; Carey et al., 2004). Esto es evidente al considerar las bajas dosis infecciosas de C. parvum (9-1042 ooquistes; DuPont et al., 1995; Okhuysen et al., 1999), de C. hominis (10-83 ooquistes; Chappell et al., 2006) y de G. intestinalis (10-100 quistes; Rendtorff, 1954) y su resistencia a los tratamientos. En Venezuela existen estudios sobre protozoarios entéricos en ambientes acuáticos (Arcay y Bruzual, 1993; Quintero-Betancourt y Botero, 2000); sin embargo, son pocos y se requiere de mayor información en zonas costeras y sistemas de tratamiento de aguas para suministro.

Existen numerosos métodos de concentración y detección de protozoarios entéricos en aguas, que aplicados en conjunto con los métodos moleculares y cultivo celular permiten determinar de manera eficiente y sensible las especies y genotipos asociados con enfermedades en humanos. Conocer la importancia relativa de vías específicas de transmisión de protozoarios intestinales, incluyendo las fuentes potenciales de contaminación ambiental, constituyen aspectos fundamentales que permiten entender la epidemiología de las enfermedades parasitarias, de esta manera se pueden aplicar medidas correctivas que minimicen la prevalencia e incidencia de estas enfermedades en la población.

Métodos para el Estudio de Protozoarios Entéricos en Aguas

Los métodos de detección de protozoarios intestinales en ambientes acuáticos, desarrollados en instituciones de diversos países, son evaluados constantemente con el fin de optimizar los diferentes procedimientos que permitan detectar de manera sensible y específica los protozoarios patógenos en aguas (Anónimo, 1999; EPA, 1999a, b, 2005). Inicialmente, los métodos fueron diseñados y aprobados para el monitoreo de la presencia de Cryptosporidium y Giardia en aguas de distribución y cuerpos de aguas naturales; sin embargo, han sido adaptados para el estudio y detección de Toxoplasma gondii y Cyclospora cayetanensis (Sturbaum et al., 1998; Quintero-Betancourt et al., 2002; Villena et al., 2004; Dumetre y Darde, 2005).

El método estándar para el estudio de Cryptosporidium y Giardia en aguas incluye tres procedimientos básicos: concentración, purificación y detección. Los procedimientos iniciales de concentración y purificación incluyen los siguientes pasos: 1) filtración de un volumen determinado de agua (10-1000 litros) con el propósito de capturar los (oo)quistes en una matriz de filtración; 2) lavado del filtro con soluciones detergentes para desprender los (oo)quistes capturados en la matriz de filtración; 3) centrifugación a velocidad moderada (1100-1500g) a fin de reducir el volumen de muestra (£5ml) y concentrar el material en suspensión junto con los (oo)quistes; 4) separación selectiva de (oo)quistes de los materiales inespecíficos en suspensión, utilizando partículas magnéticas conjugadas con anticuerpos específicos para protozoarios (separación inmunomagnética). La detección de (oo)quistes se realiza mediante microscopía de fluorescencia utilizando anticuerpos monoclonales o policlonales marcados con isotiocianato de fluoresceína (ITFC), lo que permite incrementar la capacidad de visualizar los (oo)quistes y diferenciarlos de materiales inespecíficos y algas microscópicas (microalgas) presentes en ambientes acuáticos. La confirmación de (oo)quistes aislados de ambientes acuáticos se lleva a cabo mediante microscopía por contraste de fases o también mediante microscopía de interferencia diferencial. Adicionalmente se aplican fluorocromos específicos para ácidos nucleícos tales como el 4`,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y el yoduro de propidio o PI por sus siglas en Ingles (Propidium Iodide). La microscopía por contraste de fases y de interferencia diferencial permite visualizar la morfología y estructuras internas de los (oo)quistes, tales como esporozoitos (Cryptosporidium) axonema y núcleos (Giardia). La tinción con los fluorocromos DAPI y PI permite no solo confirmar la presencia de (oo)quistes esporulados, sino que suministra además información acerca de la viabilidad de los (oo)quistes. Esto se debe a la habilidad que tienen los fluorocromos de penetrar de manera selectiva al interior de la estructura parasitaria (Campbell et al., 1992). El DAPI es un fluorocromo de tamaño pequeño que penetra fácilmente al interior de las células y tiñe selectivamente las regiones del DNA ricas en adenina y timina, por ello permite distinguir (oo)quistes esporulados potencialmente viables (Figura 1). El PI es un fluorocromo de gran tamaño que penetra el interior de las células únicamente cuando la continuidad de las barreras físicas (pared celular y membrana celular) han sido interrumpidas (Belosevic et al., 1997), de ahí que los (oo)quistes que han incluido PI se consideran no viables.

Figura 1. Fotomicrografías de Cryptosporidium parvum obtenidas con microscopía de inmunofluorescencia. Nótese en la imagen izquierda un ooquiste no viable de Cryptosporidium teñido con fluoresceína y yoduro de propidio. La micrografía a la derecha corresponde a cuatro ooquistes esporulados (DAPI+) teñidos con fluoresceína, Alexa fluor y DAPI (nótese los cuatro esporozoitos en el interior de los ooquistes) (imágenes digitales de Walter Q. Betancourt y G. D. Digiovanni).

En la Tabla I se describen los métodos estandarizados para el estudio de Cryptosporidium y Giardia en aguas. El método 1622 fue aceptado y aprobado para el estudio de Cryptosporidium por la Agencia de Protección Ambiental de los EEUU y forma parte de la regulación más reciente instaurada en ese país para el control de ese parásito en aguas. La regla LT2 establece un nivel de cero ooquistes en aguas tratadas o un requerimiento de 99% (2-log₁₀) de remoción de ooquistes cuando se emplea únicamente tratamiento por filtración (EPA, 2006). En el Reino Unido, la regulación vigente dictada en 1999 establece el monitoreo diario de Cryptosporidium en aguas tratadas. La regulación requiere un nivel máximo de 10 ooquistes por 100 litros y cualquier valor por encima constituye una ofensa criminal (Fairley et al., 1999).

Tabla I

Métodos Convencionales para la Concentraci ón, Purificaci ón y Deteci ón de Giardia y Cryptosporidium en Ambientes Acu áticos

El método 1622 fue rigurosamente validado por diferentes laboratorios y los principios generales se describen en la Tabla I. El método 1623, también validado, fue posteriormente desarrollado para la detección simultánea de Cryptosporidium y Giardia en aguas (EPA, 1999b). Existen variaciones de los métodos 1622 y 1623 que incluyen procedimientos alternos de filtración y separación inmunomagnética, así como diferentes anticuerpos monoclonales y métodos de detección. Los procedimientos alternos se describen en la Tabla II y pueden ser utilizados para el estudio y monitoreo de Cryptosporidium y Giardia en aguas una vez aplicados los controles específicos de calidad (EPA, 2005). Los controles de calidad son ensayos de laboratorio que permiten evaluar la eficiencia de recuperación tanto del método estándar como del método alterno. En estos ensayos se utilizan muestras de aguas sembradas con (oo)quistes, se cuantifican los (oo)quistes recuperados y se determina la eficiencia de recuperación. Los valores obtenidos deben satisfacer criterios de aceptación establecidos para que tanto el método estándar como el método alterno puedan ser utilizados por laboratorios de referencia en el estudio y monitoreo de Cryptosporidium y Giardia en aguas. Con el desarrollo reciente de controles positivos internos (ColorSeed, BTF Precise Microbiology, Australia) se puede evaluar simultáneamente la eficiencia de recuperación y el numero de (oo)quistes presentes en ambientes acuáticos. Los controles positivos internos consisten de (oo)quistes inactivados por irradiación gamma y marcados con un fluorocromo diferente al que se emplea para evaluar la presencia de (oo)quistes en ambientes naturales. Una vez procesada la muestra, los (oo)quistes se cuantifican con el microscopio de fluorescencia utilizando de forma simultánea filtros específicos para cada fluorocromo, de manera de diferenciar los (oo)quistes sembrados de los recuperados del ambiente. La eficiencia de recuperación se expresa en base al número y porcentaje de (oo)quistes recuperados. Con este procedimiento se determinan las interferencias que pueden ocasionar una baja eficiencia de recuperación y se estiman con mayor precisión la presencia y número de (oo)quistes en una muestra de agua (Quintero-Betancourt et al., 2003).

Tabla II

Métodos alternos para la concentraci ón y deteci ón de Cryptosporidium y Giardia en ambientes acu áticos

Detección de Protozoarios Entéricos en Aguas

La microscopía de inmunofluorescencia es el método estándar para la detección de Cryptosporidium y Giardia en aguas, tanto para el método 1622/1623 en los EEUU como para el Protocolo Operacional Estándar en Australia y el Reino Unido. En este método se utilizan anticuerpos monoclonales o policlonales conjugados con ITFC. Sin embargo, se ha determinado que existen diferencias significativas en cuanto a la avidez y especificidad de los anticuerpos disponibles comercialmente (Hoffman et al., 1999). Diversos estudios han demostrado que la detección de Cryptosporidium y Giardia en aguas es más eficiente cuando se emplean anticuerpos monoclonales de tipo IgG1, los cuales poseen mayor avidez y especificidad que los anticuerpos policlonales u otras clases de anticuerpos monoclonales (por ejemplo, IgG3 e IgM) (Ferrari et al., 1999; Weir et al., 2000; Quintero-Betancourt et al., 2003). Estas observaciones fueron confirmadas en muestras ambientales utilizando dos clases diferentes de anticuerpos monoclonales (IgG1 e IgM) marcados con isotiocianato de fluoresceína. La aplicación del anticuerpo monoclonal IgG1 (EasyStain, BTF Precise Microbiology, Australia) produjo mucho menos fluorescencia de trasfondo y la unión del anticuerpo a los (oo)quistes fue más específica que con el anticuerpo IgM (Waterborne Inc, New Orleans, EEUU). La distinción fue más evidente en muestras de agua que contenían altos niveles de microalgas y partículas minerales (Quintero-Betancourt et al., 2003). La Tabla III describe los diferentes anticuerpos disponibles comercialmente para la detección de Cryptosporidium y Giardia en muestras clínicas y ambientales.

Tabla III

Anticuerpos disponibles comercialmente para la deteci ón de Cryptosporidium y Giardia en muestras cl ínicas y ambientales

En Australia fue desarrollado un método para la detección y enumeración selectiva de ooquistes de Cryptosporidium que aplica citometría de flujo con activadores fluorescentes capaces de clasificar células según la fluorescencia y el tamaño (Vesey et al., 1997). Este método (Ferrari et al., 2000) mejora sustancialmente el proceso de detección, especialmente cuando se utilizan anticuerpos monoclonales de tipo IgG1 conjugados con ITFC (CRY104- ITFC) y ficoeritrina (CRY104-PE). Los anticuerpos monoclonales conjugados con estos fluorocromos facilitan la visualización de muestras ambientales bajo el microscopio, ya que se disminuye la fluorescencia inespecífica.

En Francia se desarrolló un equipo automatizado (ChemScan RDI, Chemunex, France) que utiliza amplificación de luz por emisión estimulada de radiación (Laser) capaz de localizar de manera específica ooquistes de Cryptosporidium y diferenciarlos de partículas y otros microorganismos inespecíficos (Rushton et al., 2000).

Para la detección de ooquistes de T. gondii y C. cayetanensis no se han desarrollado aun anticuerpos fluorescentes, sin embargo los ooquistes de ambos protozoarios son capaces de emitir fluorescencia (autofluorescencia) al ser excitados con luz ultravioleta (Lindquist et al., 2003). Este procedimiento facilita la visualización de las estructuras parasitarias bajo el microscopio de fluorescencia. No obstante, el procedimiento es muy tedioso, sobre todo cuando se trata de muestras ambientales en las cuales están presentes microalgas y materiales inertes capaces de emitir fluorescencia similar a los ooquistes. La tinción ácido-resistente, particularmente usada para el diagnóstico de Cyclospora en heces, tampoco se recomienda para la detección del ooquiste en ambientes acuáticos, debido a que muchas veces no permite ni siquiera la identificación correcta de ooquistes en muestras clínicas (Marshall et al., 1997; Mota et al., 2000).

La detección de quistes de E. histolytica en ambientes acuáticos resulta igualmente tediosa cuando se utilizan tinciones diseñadas para la detección de quistes en muestras clínicas de heces, tales como la solución de lugol (Healy y Ravdin, 1988), ya que la abundancia de microalgas de morfología y tamaño similar a los quistes dificulta la diferenciación bajo el microscopio de luz. A finales de los años 90 se desarrolló un anticuerpo monoclonal para la detección específica de quistes de E. histolytica en muestras de heces (Walderich et al., 1998); sin embargo, este anticuerpo no se encuentra disponible comercialmente. Hasta ahora, no hay trabajos sobre la aplicabilidad de este u otros anticuerpos monoclonales para la detección de quistes de Entamoeba en muestras ambientales. Más aun, son escasos los trabajos publicados sobre presencia de E. histolytica y otros protozoarios intestinales (Blastocystis hominis, Balantidium coli e Isospora belli) en aguas, a pesar de haber sido demostrada su asociación con brotes epidémicos de enfermedades gastrointestinales en humanos (Karanis et al., 2007).

Conclusión

La aplicación de métodos de detección de protozoarios patógenos en aguas ha sido fundamental en el esclarecimiento de aspectos que son importantes para entender la transmisión de protozoosis intestinales a través de ambientes acuáticos. Los nuevos sistemas de concentración (filtración y purificación) permiten recuperar selectivamente los (oo)quistes facilitando de esta manera el método subsecuente de detección. No se incluye en esta revisión las técnicas moleculares y cultivo celular, las cuales han permitido identificar modos de transmisión y fuentes de contaminación de los parásitos protozoarios intestinales Cryptosporidium y Giardia que constituyen hoy en día junto con otros protozoarios emergentes (Cyclospora, Toxoplasma) problemas de salud pública en el mundo entero. Estos métodos y su importancia para la determinación de riesgos de salud pública serán cubiertos en una revisión aparte.

Aun queda por establecerse el papel del agua en la transmisión de las protozoosis intestinales causadas por E. histolytica, B. hominis, B. coli, I. belli. De allí que el potencial de transmisión de los primeros protozoarios mencionados sea mayor en países donde los sistemas convencionales de tratamiento de aguas para suministro y aguas de desecho son inadecuados o inexistentes. Los parásitos unicelulares microsporidios que eran considerados protozoarios patógenos son incluidos actualmente dentro del phylum de los hongos, por ello no forman parte en esta revisión. No obstante su potencial de transmisión a través del ambiente acuático ha sido identificado y comprobado y por ello hoy en día se aplican los principios de los métodos de detección para Cryptosporidium y Giardia. En Venezuela y otros países de América Latina son muy limitados los estudios sobre parásitos protozoarios en ambientes acuáticos y la disponibilidad de métodos de detección de protozoarios entéricos en estos ambientes proporciona la estrategia científica requerida en estos países para enfrentar algunos de los desafíos que representan los patógenos entéricos en aguas.

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