Remoción de fenantreno por azolla caroliniana utilizando bioaumentación con microorganismos hidrocarbonoclastas.

Luis Alfredo Castro-Carrillo, Julián Delgadillo-Martínez, Ronald Ferrera-Cerrato y Alejandro Alarcón

Luís Alfredo Castro-Carrillo. Licenciatura en Biología, Universidad Autónoma Metropolitana, México. Químico, Laboratorios Schering-Plough México S.A. de C.V., Ciudad de México, México.

Julián Delgadillo-Martínez. Ingeniero Agrónomo, Universidad Autónoma Chapingo. Maestro en Ciencias en Edafología, COLPOS, México. Investigador, COLPOS, Montecillo, México. e-mail: juliandm@colpos.mx 

Ronald Ferrera-Cerrato. Químico Bacteriólogo Parasitólogo, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas (ENCB), Instituto Politécnico Nacional (IPN), México. Doctor en Ciencias en Microbiología, IPN, México. Profesor Investigador, Colegio de Postgraduads (COLPOS), Montecillo, México. Dirección: Área de Microbiología. Colegio de Postgraduados. Carretera México-Texcoco km 36.5. Montecillo, Estado de México. CP 56230, México. e-mail: ronaldfc@colpos.mx 

Alejandro Alarcón. Ingeniero Agrónomo, Universidad Veracruzana, México. Maestro en Ciencias en Edafología, COLPOS, México. Ph.D. en Horticultura, Texas A&M University, EEUU. Profesor, COLPOS, Montecillo, México. e-mail: alexala@colpos.mx 

RESUMEN

El objetivo de este trabajo fue conocer la capacidad de crecimiento y remoción de fenantreno (FEN) por el helecho Azolla caroliniana, utilizando bioaumentación con microorganismos hidrocarbonoclastas. A. caroliniana fue seleccionada de entre cuatro colectas de Azolla de México, por su tolerancia a concentraciones crecientes de FEN. Posteriormente, A. caroliniana fue expuesta a tres concentraciones de FEN: 20, 40 y 60mg·l^-1, e/o inoculada con el complejo microbiano Bacillus stearothermophilus y Oscillatoria sp. (BST+OSC) con tolerancia in vitro a 100mg FEN·l^-1 de medio de cultivo. A los 49 días después de la inoculación (DDI), la mayor producción de materia seca se presentó en el tratamiento con 20mg FEN y en el que se aplicó bioaumentación con BST+OSC en presencia de 40mg FEN. Ambos tratamientos superaron en 19,7% al testigo. Los tratamientos con mayor producción de materia seca presentaron mayor actividad nitrogenasa (7-12nmol C₂H₄·g^-1·h^-1), mientras que la menor actividad se observó en los tratamientos con 60mg FEN (3-4nmol C₂H₄·g^-1·h^-1). La menor remoción de FEN (45%) se observó en A. caroliniana sin BST+OSC con 20mg FEN; en contraste, la mayor remoción (80%) se presentó en A. caroliniana inoculada y/o sin inocular en presencia de 60mg FEN. Este trabajo es uno de los primeros reportes del efecto negativo de FEN sobre el crecimiento de Azolla y su microsimbionte, así como del potencial de remediación de FEN por A. caroliniana mediante el uso de bioaumentación.

Phenanthrene dissipation by azolla caroliniana utilizing bioaugmentation with hydrocarbonoclastic microorganisms.

SUMMARY

The aim of this work was to evaluate the ability of Azolla caroliniana to grow and to dissipate phenanthrene (PHE) by using bioaugmentation with hydrocarbonoclastic microorganisms. A. caroliniana was selected from four Mexican strains based on its tolerance to increasing concentrations of PHE. Afterwards, A. caroliniana was exposed to PHE concentrations of 20, 40 and 60mg·l^-1 and/or inoculated with the microbial consortium conformed by Bacillus stearothermophilus and Oscillatoria sp. (BST+OSC), strains previously tested for their tolerance to 100mg PHE·l^-1. After 49 days, the higher dry mass production was observed at the treatment with 20mg PHE and at that with BST+OSC in presence of 40mg PHE·l^-1; both treatments had 19.7% more dry mass than the control. Treatments with higher dry mass production also had higher nitrogenase activity (7-12nmolC₂H₄·g^-1·h^-1), whereas the lowest activity was observed at the treatments with 60mg PHE (3-4nmol C₂H₄·g^-1·h^-1). The lowest PHE dissipation (45%) was observed in A. caroliniana without BST+OSC in the presence of 20mg PHE; in contrast, the highest PHE dissipation (80%) was observed with A. caroliniana, either inoculated or not, when in presence of 60mg PHE. This is one of the first reports describing the negative effects of PHE on the growth of Azolla and its microsymbiont, as well as the potential of A. caroliniana for the dissipation of PHE with or without bioaugmentation.

Remoção de fenantreno por azolla caroliniana utilizando bioaumentação com microorganismos hidrocarbonoclásticos.

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi conhecer a capacidade de crescimento e remoção de fenantreno (FEN) pela Azolla Caroliniana (Azolla caroliniana), utilizando bioaumentação com microorganismos hidrocarbonoclásticas. A. caroliniana foi selecionada de entre quatro coletas de Azolla de México, por sua tolerância a concentrações crescentes de FEN. Posteriormente, A. caroliniana foi exposta a três concentrações de FEN: 20, 40 e 60 mg·l^-1, e/ou inoculada com o complexo microbiano Bacillus stearothermophilus e Oscillatoria sp. (BST+OSC) com tolerância in vitro a 100mg FEN·l^-1 de meio de cultivo. Aos 49 dias depois da inoculação (DDI), a maior produção de matéria seca apresentou-se no tratamento com 20mg FEN e naquele onde foi aplicada bioaumentação com BST+OSC na presença de 40mg FEN. Ambos tratamentos superaram em 19,7% ao testemunha. Os tratamentos com maior produção de matéria seca apresentaram maior atividade nitrogenase (7-12nmol C₂H₄·g^-1·h^-1), enquanto que a menor atividade foi observada nos tratamentos com 60mg FEN (3-4nmol C₂H₄·g^-1·h^-1). Observou-se a menor remoção de FEN (45%) em A. caroliniana sem BST+OSC com 20mg FEN; em contraposição, apresentou-se a maior remoção (80%) em A. caroliniana inoculada e/ou sem inocular na presença de 60mg FEN. Este trabalho e um dos primeiros relatórios a respeito do efeito negativo de FEN sobre o crescimento de Azolla e seu microsimbionte, assim como do potencial de remediação de FEN por A. caroliniana mediante o uso de bioaumentação.

PALABRAS CLAVE / Microorganismos Degradadores de HAP / Nitrogenasa / Remediación / Simbiosis /

Recibido: 19/03/2007. Modificado: 23/06/2008. Aceptado: 26/06/2008.

Introducción

El petróleo es una mezcla de variados hidrocarburos y otros compuestos orgánicos, incluyendo algunos organometálicos con V y Ni, principalmente. Es también uno de los recursos naturales no renovables más importantes para la humanidad y varía en composición y propiedades físico-químicas de acuerdo a su sitio de extracción. Los hidrocarburos del petróleo se clasifican, de acuerdo a su estructura y en orden de complejidad en alcanos, cicloalcanos, aromáticos y asfaltenos (Atlas y Cerniglia, 1995). La contaminación de los ecosistemas con petróleo es un problema que ha estado presente a través del tiempo y muchos estudios se han enfocado en la evaluación de la degradación de hidrocarburos persistentes en el ambiente, en especial los aromáticos polinucleares (HAP).

Algunas bacterias y cianobacterias, hongos y algas poseen diversas herramientas que les permiten utilizar HAP de bajo y alto peso molecular como única fuente de energía y carbono (Van Hamme et al., 2003). El fenantreno (FEN) es un hidrocarburo con tres anillos aromáticos que se encuentra en altos porcentajes en productos refinados del petróleo, tiene un peso molecular de 178 y solubilidad en agua de 1,29mg·ml^-1 (Irwin et al., 1997). La presencia de FEN en los ecosistemas se debe a la combustión incompleta de materiales orgánicos como carbón, petróleo, gasolina y madera. Una mínima porción es derivada de incendios forestales y erupciones volcánicas. Las fuentes antropogénicas de contaminación de ambientes acuáticos con FEN son los derrames de petróleo crudo o refinado, efluentes industriales o caseros, suelo acarreado por erosión hídrica y depósito directo desde la atmósfera (Valsaraj, 1988). El FEN y otros contaminantes pueden ser asimilados por las raíces de las plantas y acumulados, metabolizados o volatilizados (Reynolds y Skipper, 2005).

Son pocos los reportes de plantas acuáticas usadas en la limpieza de aguas residuales urbanas e industriales contaminadas con metales pesados y compuestos orgánicos (Salmon et al., 1998). Cerniglia et al. (1980) describieron las vías de degradación de naftaleno por la cianobacteria Oscillatoria sp.

Azolla es un helecho acuático que forma simbiosis con la cianobacteria Anabaena azollae, la cual vive dentro de su fronda y puede fijar de 100 a 1564kg de N₂·ha^-1·año^-1 (Quintero-Lizaola y Ferrera-Cerrato, 2000). Ha sido empleada en la limpieza de acuíferos por su habilidad de fijar N₂ y remover P de los ecosistemas (Shiomi y Kitoh, 1987). También se utiliza como biofiltro de elementos tóxicos en sistemas con agua circulante (Cohen-Shoel et al., 2002; Costa et al., 1999) y como acumulador de metales pesados (Sela et al., 1989, Ortiz-Catón et al., 1994). Su uso potencial en bioremediación se basa en sus estrategias de sobrevivencia y proliferación en acuíferos contaminados (Uheda et al., 1995). Ladha y Reddy (2003) mencionan que Azolla puede ser usado como purificador de agua y su aplicación biotecnológica requiere de selección de biotipos y desarrollo y mejoramiento de híbridos, además de mayor entendimiento de los mecanismos que inducen su esporulación y reproducción. Sin embargo, no se ha reportado el uso del helecho acuático Azolla, ampliamente distribuido en el territorio mexicano, en la limpieza de acuíferos contaminados con hidrocarburos del petróleo (Ferrera-Cerrato et al., 2006).

El presente estudio se enfoca hacia la selección de colectas de Azolla de distintas zonas de México, por su capacidad de crecer en presencia de y remover el FEN, al ser inoculadas con un consorcio degradador de hidrocarburos compuesto por Bacillus stearothermophilus y Oscillatoria sp.

Materiales y Métodos

Fase I. Selección de colectas de Azolla tolerantes al fenantreno. En esta fase se utilizaron cuatro colectas de Azolla de diferentes zonas de México, cuyas características se presentan en la Tabla I.

Se estableció un experimento completamente al azar con cinco diferentes concentraciones de fenantreno (Sigma^Ò 96% de pureza; FEN), de 0, 25, 50, 75 y 100mg·l^-1 en la solución nutritiva para cada uno de las cuatro colectas evaluadas. Las unidades experimentales con 5 repeticiones, fueron recipientes de plástico de 0,5l de capacidad y 86,5cm² de área, a los cuales se les añadieron 300ml de solución nutritiva Yoshida compuesta por (g·l^-1) 0,05 NaH₂PO₄·2H₂O; 0,09 K₂SO₄; 0,11 CaCl₂; 0,4 MgSO₄·7H₂O; 0,01 MnCl₂·H₂O; y ácido cítrico monohidratado 0,015g, y por (mg·l^-1) 0,1 (NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O; 1,1 H₃BO₃; 0,4 ZnSO₄·7H₂O; 0,04 CuSO₄·5H₂O; 9,6 FeCl₃·6H₂O. El FEN fue disuelto previamente en acetona para su distribución en la solución nutritiva y se colocó el helecho acuático hasta después de 24h, para permitir la volatilización del solvente. En cada recipiente se colocó 1g de peso fresco de las diferentes colectas de Azolla para cada recipiente. El experimento se llevó acabo en cámara de crecimiento (Lab-Line Biotronette^Ò) con temperatura de 27ºC y humedad relativa de 60%, fotoperíodo de 12h e intensidad lumínica de 280µmol·cm^-2·s^-1. Diariamente se mantuvo el nivel de solución nutritiva en cada unidad experimental.

Esta fase experimental concluyó cuando el helecho llenó la superficie del recipiente de la primera unidad experimental, ~28 días después de la inoculación (DDI). Se colectó la biomasa del helecho acuático y se secó a 70ºC durante 72h. Terminado este proceso de secado se pesó el material vegetal.

Fase II. Remoción de fenantreno por Azolla caroliniana utilizando bioaumentación con Bacillus stearothermophilus y Oscillatoria sp. De acuerdo a los resultados obtenidos en la Fase I, se seleccionó la colecta de Azolla que mostró mayor tolerancia a FEN.

El experimento se llevó a cabo en condiciones de invernadero. Se utilizaron recipientes de plástico (600ml de capacidad y 157,5cm² de área) conteniendo 300ml de solución Yoshida. Se inoculó un consorcio con dos microorganismos degradadores de FEN, Bacillus stearothermophillus y Oscillatoria sp. (BST+OSC). La bacteria B. stearothermophillus fue asilada de un suelo contaminado con petróleo de Minatitlán, Veracruz, México, y tiene la capacidad de producir un surfactante útil en la degradación de hidrocarburos del petróleo. Los biosurfactantes han sido considerados de importancia en la biorremediación de ambientes contaminados pues son biodegradables, de baja toxicidad y mejoran la biodisponibilidad de los compuestos tóxicos (Amézcua-Vega et al., 2004). La cianobacteria Oscillatoria fue previamente aislada de un acuífero contaminado con petróleo en Tabasco; es fijadora de N₂ atmosférico y tiene capacidad fotosintética. Para su inoculación, ambas cepas fueron propagadas por separado en medios de cultivo para bacterias (Merck^®) y cianobacterias (Allen, 1968) e incubadas durante 48 a 120rpm y 27^oC. De cada cultivo microbiano se tomaron 5ml (10⁹ células·ml^-1), para inocular las respectivas unidades experimentales.

El experimento factorial 3×2 tuvo un diseño experimental completamente al azar con 11 repeticiones por tratamiento. El factor inoculación del helecho tuvo dos niveles: 1) A. caroliniana (Tabasco) no inoculada y 2) A. caroliniana inoculada con BST+OSC. Para el factor FEN se consideraron tres concentraciones: 20, 40 y 60mg FEN por litro de solución nutritiva. Además, se incluyó un tratamiento testigo sin FEN y sin inoculación del consorcio microbiano.

Variables de crecimiento de A. caroliniana

Se determinó el peso fresco de A. caroliniana a los 49 DDI en las cinco repeticiones restantes de cada tratamiento y la fitomasa fue luego secada a 70^oC por 48h para determinar el peso seco. Se calculó el porcentaje de inhibición o estimulación del crecimiento del helecho por efecto de las diferentes concentraciones de FEN tomando en cuenta como 100% de crecimiento al promedio del tratamiento testigo. También, se determinó la tasa de crecimiento relativo y el tiempo de duplicación basado en peso seco, de acuerdo a la metodología utilizada por Quintero-Lizaola (1998) y Vidal et al. (1992). Para la tasa relativa de crecimiento se utilizó la ecuación TCR= (LnW2-LnW1)/(t), donde TCR: tasa de crecimiento relativo (g·g^-1·día^-1), LnW2; logaritmo natural del peso final, LnW1: logaritmo natural del peso inicial, y t: tiempo de crecimiento (días). En el caso de la tasa de duplicación, esta se calculó como TD=Ln2/TCR, donde TD: tiempo de duplicación expresado en días.

Actividad de la enzima nitrogenasa

A los 7, 14 y 21 DDI, se realizó la prueba de reducción de acetileno para determinar la actividad de la enzima nitrogenasa. Se colocó 1g de helecho acuático en frascos de vidrio de 25ml que fueron sellados herméticamente con un tapón de goma. Una hora después, se extrajo 10% del aire, remplazándolo por acetileno comercial. Se extrajo una muestra de la fase gaseosa y se transfirió a tubos al vacío (Vacutainer^®) de 10ml. Posteriormente, se determinó la cantidad de acetileno y etileno en un cromatógrafo de gases (Hewlett Packard 5890) con temperatura de columna de 60^oC y de detector de 70^oC. La actividad nitrogenasa fue estimada de acuerdo con la metodología propuesta por Ferrera-Cerrato et al. (1993).

Población microbiana en la rizósfera de A. caroliniana

A los 49 DDI, se determinó la población de algunos grupos microbianos en la rizósfera del helecho acuático, por el método de cuenta viable. Se prepararon diluciones decimales acuosas y siembra en placa de agar con el medio mineral mínimo modificado (Hernández-Acosta et al., 2003) derivado del medio fuente combinada de carbono (Rennie, 1981) y que consta de dos soluciones. Solución 1: 0,8g K₂HPO₄; 0,2g KH₂PO₄; 0,1g NaCl₂; 28,0mg Na₂FeEDTA; 25,0mg Na₂MoO₄; 0,25g extracto de levadura; y 900ml agua destilada. Solución 2: 2,0g MgSO₄; 0,06g CaCl₂; 100mg de FEN diluidos en 10ml de acetona y 100ml de agua destilada. Las dos soluciones se esterilizaron por separado a 18lbs·plg^-2 durante 18min y cuando tibias se mezclaron. Para degradadores de FEN que no fijan N₂ atmosférico se utilizó el medio de cultivo anterior más 1,5g NH₄NO₃. Se usó agar papa glucosa más rosa de bengala para hongos totales (Beever y Bollard, 1970).

Contenido de fenantreno

El análisis del contenido de FEN de la solución nutritiva se realizó semanalmente durante 49 días. Durante los primeros seis muestreos se utilizó solo una repetición por tratamiento. En el muestreo final se utilizaron cinco repeticiones. Para ello, a cada unidad experimental se le retiró el helecho, para ello se utilizó el método de extracción en fase líquida con embudo de separación. La solución nutritiva (~300ml) se depositó en el embudo y se mezcló con 150ml de diclorometano. Se agitó vigorosamente y se permitió la separación de las fases. El diclorometano se colectó en matraz balón de fondo plano y se concentró la muestra en un rotavapor. Este proceso se repitió dos veces adicionando diclorometano, agitando y concentrando la muestra. La lectura del FEN se realizó en espectrofotómetro UV-VIS (Hewlett Packard Modelo Chemstation) a 253nm. Se preparó una curva de calibración con 1; 0,8; 0,6; 0,4 y 0,2 mg FEN·ml^-1 de diclorometano (Soroka y Soroka, 2002). La degradación de FEN fue expresada como porcentaje.

Observación microscópica del microsimbionte Anabaena azollae

Se observaron los posibles cambios en la morfología microscópica de la cianobacteria en las frondas de A. caroliniana por efecto del contaminante. A los 28 DDI, se tomó una muestra de A. caroliniana en fresco de cada tratamiento. Una porción de frondas (0,1g) fueron cuidadosamente maceradas en portaobjetos. Se trató de retirar la mayoría de los fragmentos de tejidos de A. caroliniana y solo dejar la savia con las cianobacterias libres. Sin realizar tinción, se colocó un cubreobjetos y se observó en microscopio óptico, en campo claro y con el objetivo 40× para la toma de micrografías.

Análisis estadístico

Los datos de cada variable en cada fecha de muestreo, se sometieron a un análisis de varianza y prueba de comparación de medias (Tukey, a=0,05), mediante el programa SAS para windows versión 8.2, 1999-2001.

Resultados y Discusión

Selección de colectas de Azolla tolerantes al FEN

La presencia de FEN en la solución nutritiva, independientemente de su concentración, redujo significativamente el crecimiento de las cuatro colectas de Azolla. Las colectas de A. mexicana de Guamuchil (Sinaloa) y de Cerro Gordo (Veracruz) fueron las más susceptibles al FEN, el cual produjo la muerte de estas colectas aun en las concentraciones más bajas. A. caroliniana (Tabasco) mostró mayor tolerancia al FEN. El tiempo requerido para que esta colecta llenara la superficie del recipiente en presencia de 25mg FEN fue de 25 DDI, mostrando el mayor peso seco (0,16g). El tratamiento con 50mg de FEN tuvo 3,2g de peso fresco y 0,11g de peso seco, los cuales fueron mayores al testigo (2,7g de peso fresco y 0,06 de peso seco). En presencia de 75mg FEN la producción de biomasa del helecho fue similar al testigo. En contraste, A. caroliniana no mostró crecimiento en presencia de 100mg FEN, tratamiento en el cual las raíces de helecho estuvieron separadas y consecuentemente, la parte aérea estaba muerta (datos no presentados).

Aun cuando no se tienen reportes respecto al comportamiento de Azolla ante los HAP, la presencia de hidrocarburos del petróleo tiene efectos negativos en el crecimiento de este helecho acuático. Cohen et al. (2002) mencionaron que A. pinnata no fue capaz de tolerar la presencia de diesel a concentraciones de 2,4l·m^-2. Hasta donde pudimos conocer, el presente es de los primeros estudios que mencionan los efectos negativos del FEN en el crecimiento de cuatro colectas de Azolla, de las cuales A. caroliniana tuvo mayor tolerancia a concentraciones bajas.

Remoción de FEN por A. caroliniana utilizando bioaumentación con BST+OSC

En la segunda fase del estudio se utilizó el complejo de A. caroliniana (Tabasco) expuesta a concentraciones de FEN no mayores a 60mg por litro de solución nutritiva. A los 42 DDI, A. caroliniana llenó la superficie del recipiente en el tratamiento con 40mg FEN inoculado con BST+OSC. La producción de materia seca fue significativamente mayor (P<0,05) en los tratamientos de A. caroliniana con 20mg FEN y en A. caroliniana inoculada con BST+OSC en presencia de 40mg FEN, en comparación con el tratamiento de A. caroliniana inoculada con BST+OSC y 60mg FEN (Tabla II). El efecto negativo de los HAP como el fenantreno, en el crecimiento de microorganismos simbióticos ha sido demostrado previamente (Alarcón et al., 2006; Franco-Ramírez et al., 2007), denotando la toxicidad de los HAP en microorganismos simbióticos y en sus hospedantes, como fue el caso de Azolla-Anabaena.

Considerando la ausencia del consorcio microbiano (BST+OSC), la dosis de 20mg FEN estimuló 19,7 y 4,5% el crecimiento del helecho con respecto al testigo; sin embargo, conforme las concentraciones de FEN incrementaron, el crecimiento fue disminuyendo. Aun cuando no se observaron diferencias significativas entre los tratamientos inoculados con BST+OSC, el crecimiento de Azolla fue estimulado en 19,7% por la bioaumentación en presencia de 40mg de FEN (Tabla II). En contraste, en presencia de 60mg FEN e inoculación de BST+OSC, el crecimiento del helecho fue reducido en 6,67%.

La TCR fue significativamente mayor en los tratamientos A. caroliniana con 20 mg FEN y en A. caroliniana inoculada BST+OSC en presencia de 40mg FEN, mismos que presentaron menor TD en comparación con el resto de los tratamientos (Tabla II). Esto indica que la colecta de A. caroliniana tiene la capacidad de crecer mejor en concentraciones bajas de contaminante (20mg FEN) y que la inoculación del consorcio microbiano permitió el crecimiento de Azolla en presencia de 40mg FEN, lo que denota un efecto benéfico de la bioaumentación a esta concentración de FEN. Estos resultados representan uno de los primeros reportes acerca del beneficio de la bioaumentación con microorganismos hidrocarbonoclastas en Azolla expuesta a HAP.

El FEN, a excepción de la dosis de 40mg, inhibió la actividad de la enzima nitrogenasa en A. caroliniana con respecto al testigo (Figura 1). Por su parte, la inoculación del consorcio BST+OSC contribuyó a la disminución de la actividad enzimática, la cual fue en general muy similar a la observada en el testigo no inoculado (Figura 1). La actividad nitrogenasa en sistemas simbióticos como el caso de Azolla-Anabaena no ha sido previamente evaluada en presencia de HAP. No obstante, Stahl y Williams (1986) indicaron que la presencia de petróleo redujo significativamente la actividad nitrogenasa en el sistema simbiótico trébol-Rhizobium. Por otra parte, se tienen antecedentes de que esta actividad enzimática en raíces de trébol inoculadas con Rhizobium leguminosarum var. trifolii, puede ser estimulada en presencia de dosis bajas de Cr (10mg·kg^-1); sin embargo, dosis más altas (70mg·kg^-1) inhiben tanto el crecimiento de la bacteria como su actividad nitrogenasa (Casella et al., 1988). Por su parte, la actividad nitrogenasa y la absorción de N (NH₄⁺ y NO₃^-) en Nostoc muscorum son sensiblemente afectadas por la aplicación de Cr, Ni y Pb (Rai y Raizada, 1989). Además, la nitrogenasa en bacterias de vida libre fijadoras de N₂ atmosférico presenta variaciones en su inhibición y/o estimulación por efecto de plaguicidas, de manera particular la presencia de paraquat resulta en la inhibición de esta actividad enzimática (Jagnow et al., 1979).

Dado que las unidades experimentales no estuvieron en un sistema completamente cerrado, se consideró la evaluación de los microorganismos en la rizósfera del helecho. Las poblaciones de hongos totales (HT) y bacterias degradadoras (BD) de FEN (Figura 2) no presentaron diferencias significativas entre tratamientos. Sin embargo, la población de bacterias que utilizan FEN como fuente de carbono y que además fijan N₂ atmosférico, fue significativamente mayor (P<0,05) en aquellos tratamientos donde se utilizó la bioaumentación con BST+OSC, en todas las concentraciones de FEN (Figura 2b). Caudales et al. (1998) encontraron diferentes especies de Arthrobacter aisladas de la rizósfera de A. caroliniana, y mencionan que en aguas contaminadas se pueden presentar microorganismos versátiles y tolerantes a condiciones adversas cuyas funciones aun no están definidas.

La población tanto de HT y BD de FEN disminuyó conforme la concentración de FEN incrementó (Figura 2c), mientras que la población de BD de FEN que fijan N₂ atmosférico aumentó conforme la concentración de FEN incrementó (Figura 2b). Lo anterior resalta la importancia de la microflora de la rizósfera de Azolla como elemento que podría contribuir en la destoxificación de acuíferos contaminados. Hernández-Acosta et al. (2003) señalan que las bacterias fijadoras de N₂ atmosférico (BFNA) son importantes para biorremediar suelos contaminados, ya que incorporan N en el sistema. Sin embargo, no se tienen reportes del efecto de este grupo bacteriano en sistemas acuáticos y sobretodo, en presencia del helecho Azolla, por lo que se sugiere realizar más estudios al respecto a fin de evaluar la función de estas bacterias en la remediación de acuíferos. Contrario a lo esperado, el aumento en la población de BFNA no estuvo correlacionado con un aumento en la actividad nitrogenasa en el sistema simbiótico Azolla-Anabaena, sugiriendo la proliferación de bacterias fijadoras de N₂ atmosférico con mayor actividad degradadora de FEN, especialmente en las concentraciones de 20 y 40mg FEN (Figura 1). No obstante, la actividad fisiológica de estas bacterias en la fijación del nitrógeno atmosférico requiere de mayor estudio, de forma que se pueda estimar su actividad nitrogenasa y su contribución en la incorporación del N₂ en el sistema contaminado.

La remoción de FEN a los 49 DDI fue >50% en todos los tratamientos (Figura 3). La inoculación de los microorganismos hidrocarbonoclastas solo mejoró la remoción del contaminante en los tratamientos con dosis de 20mg FEN, mientras que en las dosis restantes, la remoción fue similar con o sin la aplicación de la bioaumentación (Figura 3). Doong y Lei (2003) mencionan que diversos surfactantes incrementaron la biodisponibilidad del pireno y, por ende, su degradación en el suelo. Sin embargo, en ambientes acuáticos, al compararlos con el testigo, estos surfactantes redujeron la degradación del contaminante, debido a que los microorganismos pudieron haber utilizado al surfactante como fuente de carbono fácilmente asimilable. Lo anterior podría explicar la limitada capacidad de remoción del FEN en los tratamientos con bioaumentación, denotando que en ambientes acuáticos la inoculación de microorganismos productores de surfactantes como B. stearothermophilus puede reducir la degradación de hidrocarburos. Aunado a esto, Gentry et al. (2003) mencionan que es común aislar y seleccionar microorganismos degradadores de hidrocarburos. En la mayoría de los casos, su inoculación en sitios contaminados no produce ningún efecto en términos de degradación de contaminantes, lo cual puede ser debido también a fenómenos de competencia con otros microorganismos nativos. No obstante, se sugiere mayor investigación con respecto a las interacciones microbianas durante la remediación y degradación de contaminantes en sistemas acuáticos.

No se presentaron cambios en el microsimbionte por la exposición del helecho a 20 y 40mg FEN, en comparación con el testigo sin FEN. Sin embargo, en el tratamiento con 60mg FEN se observaron cadenas de la cianobacteria con menor número de células y heterocistos (células especializadas en fijación de N₂ atmosférico) desprendidos de la cadena (Figura 4). Estos resultados denotan el efecto negativo del FEN en la cianobacteria simbionte de Azolla, lo que puede explicar a su vez, el limitado crecimiento o incluso la muerte del helecho cuando estuvo expuesto a 75 y 100mg FEN en la primera fase del experimento. Estos resultados muestran por primera vez que la morfología estructural de las cianobacterias simbióticas en Azolla es afectada por efecto de la aplicación de 60mg FEN en una solución nutritiva.

Conclusiones

Se observaron diferencias en la tolerancia de colectas de Azolla hacia concentraciones crecientes de FEN. A. caroliniana fue la colecta con mayor tolerancia a FEN, propiciando la remoción de éste de la solución nutritiva. La presencia de FEN produjo disminución significativa en el crecimiento, TD y actividad nitrogenasa en el simbiosistema Azolla-Anabaena. La aplicación de bioaumentación con Bacillus stearothermophilus y Oscillatoria sp. produjo mayor degradación de FEN en concentraciones de 20mg·l^-1, pero su efecto fue limitado en concentraciones >40mg FEN. Más aun, la presencia de FEN produjo cambios morfológicos en la cianobacteria Anabaena azollae, cuyas cadenas de células fueron mas cortas y los heterocistos se encontraron libres, lo que denota toxicidad en la simbiosis y muerte del helecho en concentraciones de FEN >60mg·l^-1.

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo es parte del Proyecto SEMARNAT-CONACyT 2002-C01-0023 "Microorganismos simbióticos de la rizósfera de leguminosas y gramíneas en la fitorremediación de suelos contaminados con petróleo".

REFERENCIAS

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