Aislamiento y caracterización estructural de un nuevo triterpeno del octocoral Plexaura Flexuosa Lamoroux.

Haydelba D´Armas, Douglas Bermúdez y Bernardo Méndez

Haydelba D'Armas. Ph.D. en Química, University of the West Indies (UWI). MSc. en Oceanografía Química, Instituto Oceanográfico de Venezuela (IOV), Universidad de Oriente (UDO). Docente e Investigador, UDO, Cumaná, Venezuela. Dirección: Dpto. de Química, Esc. de Ciencias, Núcleo de Sucre, Universidad de Oriente, Av. Universidad, Cumaná, Sucre 6101, Venezuela. e-mail: haydelba@sucre.udo.edu.ve, haydelba@yahoo.com.

Douglas Bermúdez. Lic. en Química, UDO. Profesor, Núcleo de Bolívar, UDO, Cumaná, Venezuela.

Bernardo Méndez. Dr. en Química, Universidad Central de Venezuela (UCV). Docente e Investigador, UCV, Caracas, Venezuela.

RESUMEN

Estudios previos de productos naturales de origen marino han demostrado que los octocorales producen una variedad de metabolitos con diversas estructuras químicas y bioactividades. Con el objetivo de estudiar al octocoral Plexaura flexuosa Lamoroux se analizó el extracto en acetona de un ejemplar colectado en la Bahía de Mochima, estado Sucre, Venezuela. Se evaluaron las propiedades antibacteriana, antifúngica y tóxica del extracto, revelándose una marcada actividad antibacteriana contra las bacterias Gram positiva Staphylococcus aureus y Bacillus cereus, así como una letalidad significativa mediante el bioensayo de Artemia salina. La fracción soluble en hexano de dicho extracto exhibió actividad antifúngica contra Candida albicans y Trichosporum sp. A partir de dicha fracción se aisló un sólido blanquecino, usando sucesivas cromatografías de columna eluidas con mezclas de hexano:AcOEt en diferentes proporciones. El compuesto se cristalizó con AcOEt, obteniéndose cristales blancos en forma de agujas con punto de fusión de 194,8-195,0°C. Para la identificación estructural de este sólido se realizaron análisis espectroscópicos (IR, RMN¹H, RMN¹³C, HMQC, HMBC y COSY¹H-¹H), los cuales evidenciaron la presencia de un esqueleto triterpenoidal tetracíclico con cadena lateral, ocho metilos, un doble enlace trisustituído y un grupo epóxido exocíclico. El análisis sistemático de los datos espectrales y su posterior comparación con estructuras reportadas permitieron establecer la estructura posible del compuesto como un derivado 3,5-epoxi del dinosterol.

Isolation and structural caracterization of a new triterpene from the octocoral Plexaura Flexuosa Lamoroux

SUMMARY

Previous studies of natural products of marine origin have showen that octocorals produce a variety of metabolites with diverse chemical structures and significant bioactivities. The acetone extract of the octocoral Plexaura flexuosa Lamoroux collected at Mochima Bay, Sucre state, Venezuela, was analyzed and evaluated for its antibacterial, antifungal and toxic properties, showing a significant antibacterial activity against the Gram positive bacteria Staphylococcus aureus and Bacillus cereus, and also a significant lethality in the Artemia salina bioassay. The hexane-soluble fraction of this extract exhibited antifungal activity against Candida albicans and Trichosporum sp. A white solid was isolated from this fraction by successive column chromatography with different proportions of hexane:EtOAc mixtures as eluting solvents. The compound was crystallized with EtOAc, forming needle-shaped white crystals with a melting point of 194.8-195.0°C. Subsequently, spectroscopy analyses were performed for the structural identification of this solid, employing IR, ¹HNMR, ¹³CNMR, HMQC, HMBC and ¹H-¹HCOSY, which revealed the presence of tetra-cyclical triterpene skeleton with a side chain, eight methyl groups, a trisubstituted double bond and an exocyclical epoxy group. Spectral data analysis and comparison with reported structures permitted the establishment of a of 3.5-epoxy dinosterol derivative as the possible structure of the compound.

Isolamento e caracterização estrutural de um novo triterpeno do octocoral Plexaura Flexuosa Lamoroux.

RESUMO

Estudos prévios de produtos naturais de origem marinho têm demonstrado que os octocorais produzem uma variedade de metabolitos com diversas estruturas químicas e bioatividades. Com o objetivo de estudar ao octocoral Plexaura flexuosa Lamoroux se analisou o extrato em acetona de um exemplar recolhido na Bahia de Mochima, estado Sucre, Venezuela. Avaliaram-se as propriedades antibacteriana, antifúngica e tóxica do extrato, revelando-se uma marcada atividade antibacteriana contra as bactérias Gram positiva Staphylococcus aureus e Bacillus cereus, assim como uma letalidade significativa mediante o bioensaio de Artêmia salina. A fração solúvel em hexano de dito extrato exibiu atividade antifúngica contra Candida albicans e Trichosporum sp. A partir de dita fração se isolou um sólido branco, usando sucessivas cromatografias de coluna eluídas com misturas de hexano: AcOEt em diferentes proporções. O composto se cristalizou com AcOEt, obtendo-se cristais brancos em forma de agulhas com ponto de fusão de 194,8 - 195,0°C. Para a identificação estrutural de este sólido se realizaram análises espectroscópicas (IR, RMN¹H, RMN¹³C, HMQC, HMBC e COSY¹H-¹H), as quais evidenciaram a presença de um esqueleto triterpenoide tetracíclico com cadeia lateral, oito metilos, um duplo enlace trisubstituído e um grupo epóxido exocíclico. A análise sistemática dos dados espectrais e sua posterior comparação com estruturas relatadas permitiram estabelecer a estrutura possível do composto como um derivado 3,5-epóxi do dinosterol.

PALABRAS CLAVE / Derivado 3,5-epoxi del Dinosterol / Octocoral / Plexaura flexuosa Lamoroux / RMN /

Recibido: 27/04/2007. Modificado: 04/08/2008. Aceptado: 05/08/2008.

Introducción

Los océanos cubren casi las dos terceras partes de la superficie de la tierra y los organismos que en ellos viven constituyen cerca del 2% de la materia orgánica presente en los mares. Se estima que los arrecifes coralinos albergan ¼ de las especies del mundo submarino. Los octocorales son unos de los invertebrados más abundantes en los ambientes marinos tropicales y subtropicales; los pertenecientes al orden Gorgonácea (abanicos marinos o corales gorgonios blandos), crecen en aguas relativamente someras y representan un estimado del 38% de las especies conocidas de los arrecifes de las Indias Occidentales (Bayer, 1961).

Los seres vivos son capaces de sintetizar gran variedad de compuestos, entre los que se encuentran los productos naturales o metabolitos secundarios propios de una especie, que en la mayoría de los casos no tienen utilidad aparente para el organismo que los sintetiza; a diferencia de los metabolitos primarios o productos bioquímicos que presentan una utilidad definida y son comunes a ellos, tales como los carbohidratos, lípidos, proteínas y otros (Marcano & Hasegawa, 2002).

Estudios químicos previos de productos naturales han demostrado que los organismos del medio ambiente marino son una fuente promisoria para la obtención de compuestos biológicamente activos (Coll, 1992; Schmitz et al., 1993). Estos estudios se han centrado básicamente en esponjas, tunicados, corales, algas, moluscos, briozoarios y microorganismos marinos. Específicamente, los octocorales producen una variedad de metabolitos con diversas estructuras químicas sin precedentes y con actividades biológicas significativas, tales como actividad antibacteriana, anticancerígena, antiinflamatoria, antitumoral, etc. Entre estos compuestos están los alcaloides, sesquiterpenos, diterpenos, ácidos grasos y, en algunos casos, esteroides altamente funcionalizados (Rodríguez, 1995).

Los octocorales de la familia Plexauridae (subclase Octocorallia, orden Gorgonácea) han sido estudiados durante las últimas tres décadas, en particular en cuanto a la química de productos naturales, habiéndose reportado prostaglandinas y nuevos terpenos. Los reportes de nuevos lípidos provenientes de estos organismos son, por contraste, muy limitados a pesar del del aislamiento de prostaglandina-A₂ (PGA₂) proveniente de la gorgonia Plexaura flava (Ravi y Wells, 1982). De una muestra de P. homomalla recolectada en las Bahamas, Growiss y Fenical (1990) aislaron la prostaglandina PGF_2a-9-0-acetatometiléster.

Ravi y Wells (1982) aislaron de P. flava recolectado en la Gran Barrera de Arrecifes de Australia, dos compuestos terpenoidales: la quinona aceitosa (2E,6E,10E)-2-metil-5-(3,7,11,15-tetrametilhexadeca-2,6,10,14-tetraenil)benzoquinona, y el (3E,7E,11E)-2,7-dimetil-2-(4,8,12-trimetiltrideca-3,7,11-trienil)-2H-coromen-6-ol.

De la especie Plexaura sp. recolectada en Puerto Rico y Tobago se han aislado cuatro terpenos tipo cembrano, plexaurolona, dihidroplexaurolona y dehidroplexaurolonas, cuyas actividades biológicas son desconocidas (Rodríguez, 1995).

El (-)-sarcophytol A (diterpeno tipo cembrano), aislado de P. flexuosa recolectado en Puerto Rico, es un promotor del (+)-sarcophytol A, el cual es un potente agente antitumoral, al igual que otro diterpeno aislado de esta especie, el (+)-marasol, habiéndose demostrado que ambos terpenos presentan actividad citotóxica contra células CHO-K1 y HeLa (Peniston y Rodríguez, 1991).

La capacidad que tienen los organismos marinos para biosintetizar una diversidad de metabolitos secundarios, así como el hecho de que el medio marino es una gran reserva de compuestos biológicamente activos con potencial biomédico (Faulkner, 2001, 2002; Blunt et al., 2003; Baker et al., 2007), impulsaron la realización de este estudio. En las costas de Venezuela, en la región denominada Indias Occidentales, habita una gran variedad de octocorales que no han sido estudiados químicamente y, por ende, presentan interés en el campo de los productos naturales. Es sabido que la composición química de un organismo depende de la fecha, el lugar, la salinidad y condiciones ambientales en el momento de realizar la recolección y, debido a que no hay reportes acerca de la composición química y la actividad biológica del octocoral P. flexuosa Lamoroux en Venezuela, se estudió la estructura de sus metabolitos secundarios y su posible utilidad terapéutica o como modelos para la síntesis de compuestos de uso comercial.

Materiales y Métodos

Muestreo

Los ejemplares del octocoral Plexaura flexuosa Lamourux se recolectaron a la profundidad de ~7m en la cesta de Punta Aguirre en la Bahía de Mochima, estado Sucre, región nororiental de Venezuela, entre 10º20’-10º24’N y 64º19’-64º22’O, durante agosto 2002. La muestra fue identificada en el Instituto de Investigaciones Marinas de Trinidad y Tobago (Nº IMA-1485).

Extracción

Para la obtención del extracto crudo del organismo y fracciones se procedió de la siguiente manera: el coral fresco se lavó con abundante agua destilada y se cortó en piezas para ser macerado en acetona (1,5l) durante 48h. Luego de filtrado el solvente, el residuo se maceró de nuevo por 24h, para asegurar la completa extracción de los metabolitos presentes. El filtrado total de las dos maceraciones fue evaporado y concentrado a presión reducida para la obtención del extracto crudo soluble en acetona. Seguidamente este extracto, obtenido como una suspensión acetona-agua, fue re-extraído sucesivamente con acetato de etilo; secado con Na₂SO₄ anhidro, filtrado y evaporado, obteniéndose un extracto gomoso.

El extracto soluble en acetato de etilo fue suspendido en una solución MeOH/H₂0 (9:1) y luego extraído con hexano. El filtrado total se secó con sulfato de sodio anhidro y, posteriormente, se evaporó a presión reducida para obtener la fracción soluble en hexano. La fase metanol-acuosa se extrajo de manera exhaustiva con acetato de etilo, a fin de obtener la fracción soluble correspondiente.

Aislamiento

La fracción soluble en hexano de P. flexuosa se fraccionó por cromatografía de columna con sílica-gel 70-230mesh; en una columna de 83,0´2,5cm. Se utilizaron 2,00g de la fracción y 60,03 g de sílica-gel en una relación muestra:sílica de 1:30. Se utilizaron como eluyentes hexano, mezclas en polaridad ascendente de hexano-acetato de etilo (AcOEt), ActOEt y metanol (MeOH), obteniéndose de esta cromatografía 78 eluatos de 50ml cada uno. A los eluatos se les aplicó cromatografía en capa fina (CCF, sílica gel 60 tipo GF) en hexano-AcOEt, en las proporciones 1:9, 1:1 y 9:1, obteniéndose ocho subfracciones por comparación de sus R_f, utilizando como revelador una solución ácida de molibdato de amonio.

Posteriormente, la subfracción eluida en hexano/AcOEt 9:1 se fraccionó por CC con sílica-gel 70-230mesh; utilizándose una columna de 93,0´1,0cm. Para la separación se usaron 192,1mg de la muestra y 9,70g de sílica-gel en una relación muestra:sílica 1:50. Se utilizaron como eluyentes hexano, mezclas en polaridad ascendente de hexano-AcOEt, ActOEt y MeOH. De esta cromatografía se obtuvieron 56 eluatos de 20ml cada uno. Aplicando CCF en hexano-AcOEt en proporciones 1:9, 1:1 y 9:1 a los eluatos obtenidos, se identificaron tres subfracciones.

La subfracción eluida en hexano/AcOEt 9:1 se obtuvo como un sólido blanquecino, el cual revelaba en CCF una sola mancha utilizando varios sistemas de solventes, siendo presumiblemente un solo compuesto. El sólido fue purificado en dos ocasiones mediante recristalización con acetato de etilo.

Caracterización estructural

La estructura del compuesto aislado se elucidó mediante el uso combinado de resonancia magnética nuclear (RMN) uni y bi-dimensional (¹H, ¹³C, HMQC, HMBC y COSY¹H-¹H) y espectroscopía infrarroja (IR). El metabolito fue analizado en un equipo de RMN Bruker de 400MHz y/o un aparato de RMN Varían de 500MHz, en la Universidad Central de Venezuela (UCV) y en el Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), respectivamente. Para la obtención de los espectros, la muestra fue disuelta en cloroformo deuterado (CDCl₃) y se colocó en un tubo de resonancia para ser introducida en el equipo de RMN. Los desplazamientos químicos (d) obtenidos en los espectros se reportaron en ppm, en relación a un estándar interno de tetrametilsilano (TMS) y las constantes de acoplamiento (J) se expresaron en hertz (Hz).

El espectro COSY¹H-¹H (COrrelated SpectroscopY) suministró las interrelaciones directas entre los hidrógenos vecinos. Del espectro HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) se obtuvieron las conectividades directas entre carbonos e hidrógenos. De el espectro HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity) se obtuvieron las conectividades entre carbonos e hidrógenos distanciados por n- enlaces, donde n= 2 ó 3.

Para los análisis de espectroscopía infrarroja (IR) se colocó el compuesto aislado, disuelto en CHCl₃, en pastillas de KCl y se analizó en un espectrofotómetro de FTIR 16PC Perkin Elmer, con 24 barridos a resolución de 2cm^-1. Este espectro se obtuvo en el Instituto de Investigaciones de Biomedicina y Ciencias Aplicadas (IIBCA) de la Universidad de Oriente, Venezuela.

Pruebas biológicas

La posible actividad biológica del extracto crudo en acetona y la fracción soluble en hexano del octocoral se evaluó mediante el uso de los siguientes bioensayos:

Antibiosis. Para detectar la presencia de metabolitos con actividad biológica fueron utilizadas cepas bacterianas pertenecientes a la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), a saber, tres cepas Gram negativas: Escherichia coli (ATCC 10536), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) y Salmonella typhimurium (ATCC 14028); y dos cepas Gram positivas: Staphyloccocus aureus (ATCC 25923) y Bacillus cereus (ATCC 9634). Se siguió la técnica de difusión en agar (Bauer et al., 1966). Igualmente se determinó la actividad antifúngica inoculándose con las cepas de hongos patógenos Candida albicans (ATCC 10231) y los fitopatógenos Fusarium oxysporum, F. decencellulare, Trichosporum sp. y Penicillum cristobum, según el procedimiento de Madubunyi (1995). Estas cepas de hongos patógenos y fitopatógenos fueron suministradas por el Laboratorio de Micología del Departamento de Biología de la Universidad de Oriente, Núcleo de Sucre, y el Servicio Autónomo Hospital Universitario "Antonio Patricio Alcalá" de Cumaná, estado Sucre, Venezuela.

Actividad fototóxica. Para verificar la presencia de principios fototóxicos en los extractos se empleó el método descrito por Daniels (1965), con modificaciones de Estaba (1986).

Letalidad. La letalidad del extracto crudo en acetona y la fracción soluble en hexano del octocoral fue evaluada en larvas del crustáceo de Artemia salina, siguiendo la técnica descrita por Meyer et al. (1982) y se analizaron los resultados con el método estadístico diseñado por Stephan (1977) para determinar la concentración letal media (CL₅₀).

Resultados y Discusión

Los bioensayos realizados permitieron evaluar los efectos del extracto crudo en acetona y la fracción soluble en hexano sobre los microorganismos ensayados.

Actividad antibacteriana y antifúngica, y fototoxicidad

Una de las actividades farmacológicas más significativas es la actividad antibacteriana. Se observó actividad bacteriostática (disminución de la tasa de crecimiento de la bacteria) y acción bactericida (muerte de la bacteria). El extracto de P. flexuosa no es fototóxico, ya que mostró una marcada actividad antibacteriana, antes de ser irradiado, tanto frente a B. cereus como a S. aureus (Tabla I). Para ambas cepas bacterianas, los halos de inhibición mantuvieron un diámetro prácticamente constante a pesar del efecto de la luz; sin embargo, el extracto en acetona de esta especie inhibió aún más el crecimiento de la bacteria B. cereus que el de S. aureus, observándose, además, halos de inhibición bacteriostáticos de ~40mm para B. cereus. Este efecto bacteriostático no se observó frente a S. aureus.

La fracción soluble en hexano presentó una moderada actividad frente a S. aureus y a los hongos C. albicans y Trichosporum sp, careciendo de actividad frente a las otras cepas de bacterias y hongos estudiados (Tabla II). Esto es un indicio de la posible presencia de compuestos bioactivos con propiedades antibacterianas y antimicóticas en esta fracción. No existen reportes de metabolitos del género Plexaura con estas actividades biológicas.

Actividad letal

La letalidad in vivo del crustáceo Artemia salina puede ser usada como un medio para la discriminación y fraccionamiento en el descubrimiento de nuevos productos naturales bioactivos (McLaughlin et al., 1991). Se ha reportado la presencia de compuestos anticancerígenos y antitumorales aislados de organismos marinos, los cuales previamente mostraron actividad tóxica en el ensayo de A. salina. Este es un bioensayo simple que en alguna forma se correlaciona con la citotoxicidad (Schmitz et al., 1993).

Los resultados obtenidos para el extracto de P. flexuosa (Tabla III) arrojaron un CL₅₀ de 24,70mg/ml, lo cual evidencia una toxicidad significativa (Meyer et al., 1982) para esta especie y conduce a presumir la existencia de compuestos o metabolitos con una alta actividad citotóxica. Estos resultados están en concordancia con lo reportado por Peniston y Rodríguez (1991), quienes aislaron de P. flexuosa diterpenos con actividad antitumoral. Por el contrario, la fracción en hexano del octocoral presentó una toxicidad insignificante en el ensayo con A. salina (resultados no reportados).

Este estudio proporciona resultados cualitativos de interés como base de orientación para quienes aborden, en un futuro, estudios biológicos o químicos más profundos.

Aislamiento y caracterización del metabolito

El componente analizado de P. flexuosa fue aislado de la fracción soluble en hexano como un sólido blanquecino (12,9mg) usando CCFP sucesivas, con una mezcla hexano:AcOEt (9:1) como solventes de elución. Como en la CCF se visualizó una sola banda o mancha, se cristalizó sucesivamente con AcOEt, obteniéndose unos cristales blancos en forma de agujas (8,5mg). El compuesto puro exhibió un punto de fusión de 194,8-195,0°C.

Posteriormente, se realizaron análisis espectroscópicos convencionales para la identificación estructural. El espectro IR mostró absorción a 3050cm^-1 debida al estiramiento C-H, donde el carbono tiene hibridación SP², así como también la presencia de dos otras señales, una a 1220cm^-1 debida al estiramiento asimétrico y otra a 1050cm^-1, debida al estiramiento simétrico del sistema C-O-C. Además, exhibió frecuencias a 2950 y 2820cm^-1 (estiramiento C-H del CH₂ y del CH₃), a 850cm^-1 (deformaciones C-H de dobles enlaces trisustituidos) y a 750cm^-1 (deformación CH₂).

En el espectro de RMN de ¹H del compuesto (Tabla IV) se observó un doblete, con una constante de acoplamiento de 9,5Hz, integrado para un protón olefínico a d_H 4,85 el cual fue consistente con la presencia de un doble enlace en la estructura del compuesto. A campo alto, a d_H 3,05 (J=10,5; 5,2), exhibió un multiplete como triplete de dobletes integrado para un protón asignable a un hidrógeno enlazado a un carbono unido a un átomo de oxígeno (H-C-O). Además mostró otro multiplete a d_H 2,32 integrado para un protón asignable a un hidrógeno alílico (H-C-C=C). A campo más alto, en la zona alifática desplegó ocho señales asignables a metilos, de los cuales cinco aparecieron como dobletes (vecinos a un hidrógeno) a d_H 0,93 (J=7,5); 0,91 (J=7,0); 0,89 (J=7,0); 0,82 (J=6,3) y 0,76 (J=6,3); y tres como singuletes a d_H 0,66; 0,81 y 1,48 (metilo enlazado a un carbono olefínico).

El espectro de RMN de ¹³C del compuesto (Tabla V) mostró desplazamientos químicos de 30 carbonos diferentes. Dado que este compuesto no mostró en el IR la banda de absorción característica del grupo hidroxilo, y poseía 30 átomos de carbono, se descartó la posibilidad de que fuese un esterol, proponiéndose la estructura de un terpeno tetracíclico con una cadena lateral y un doble enlace correspondiente a los carbonos a d_C 135,13 y 131,75. Además, dos señales a d_C 76,99 y d_C 76,74 asignables a carbonos enlazados a oxígenos (estas señales estaban superpuestas con la señal del solvente utilizado, el cual fue cloroformo deuterado). El resto de los desplazamientos corresponden a carbonos alifáticos, encontrándose ocho señales a campo más alto asignables a carbonos metílicos.

El protón unido a oxígeno (CH-O; d_H 3,05; J= 10,5; 5,2) asumido como H-3, apareció como un triplete de dobletes, lo cual sugirió dos acoplamientos axial-axial y un acoplamiento axial-ecuatorial, tal como se exhibe en el anillo de la estructura parcial A (Figura 1). El HMQC permitió asignar el carbono protonado oxigenado. Dicho carbono a d_C 76,74 esta enlazado directamente al protón H-3; además, mostró un pico cruzado HMBC (Tabla VI) con un protón a d_H 0,93 (J= 7,5) enlazado a un carbono con desplazamiento químico de 21,10ppm (C-29). De igual manera, los carbonos a d_C 76,99 (C-5) y 39,22 (C-4) mostraron pico-cruzado con el mismo protón; esto sugiere la existencia de un anillo heteroátomo entre los carbonos a d_C 76,74; 76,99 y 39,22 (Figura 2), lo cual confirma la existencia del sistema C-O-C; es decir, un puente etéreo entre los C-3 y C-5 en lugar de un grupo hidroxilo en la posición tres, en la estructura del triterpeno, como lo indicaron las absorciones del espectro IR. Este patrón de picos-cruzados indicó la presencia de un grupo metilo enlazado al carbono con desplazamiento químico de 39,22ppm (posición 4).

A partir de los espectros HMQC y RMN de ¹H, la señal metílica correspondiente (C-29), se observó como un doblete a d_H 0,93 (J= 7,5), lo cual estuvo de acuerdo con la presencia de un grupo metilo secundario. Este grupo metilo debía estar en posición a para que existiese concordancia con los acoplamientos observados para H-3 (d_H 3,05; J= 10,5; 5,2), el cual mostró a su vez correlaciones COSY ¹H-¹H con protones a d_H 1,68; 1,78 y 1,93 (Tabla VI; Figura 2), lo cual quiere decir que dos de éstos debían estar en posición axial y el otro en posición ecuatorial. H-4 (d_H 1,93) mostró acoplamiento vecinal axial con H-3. Por consiguiente, H-4 es axial y orientado en b y el grupo metilo en C-4 orientado en posición a (Figura 1).

El grupo metilo enlazado a un carbono olefínico (H-30; d_H 1,48) exhibió conectividad directa HMQC (Tabla VII) con un carbono a d_C 13,20 (C-30), el cual presentó correlaciones HMBC (Figura 3) con un carbono olefínico no protonado a d_C 135,10 (C-23), un carbono olefínico protonado a d_C 131,80 (C-22) y con un carbono metílico a d_C 50,14 (C-24). El protón unido al carbono con desplazamiento a d_C 50,14 presentó correlaciones COSY (Figura 3; Tabla VII) con un protón a d_H 0,76 (J= 6,3); y mostró picos cruzados HMBC con un carbono metílico a d_C 13,36 y con otro a d_C 16,91. El carbono a d_C 131,80 mostró (Tabla VII) conectividad directa con un protón a d_H 4,85 (H-22; J= 9,5) y correlaciones HMBC con las señales de protones a d_H 0,89 (H-21) y 1,48 (H-30). El protón del sistema C=C mostró correlación COSY (Figura 3) con una señal de protones a d_H 2,32 (H-20) y una correlación COSY a distancia con los hidrógenos del metilo olefínico a d_H 1,48, lo cual indicó que estos protones son vecinos al protón olefínico. Además, este carbono olefínico presentó picos-cruzados HMBC con protones a d_H 0,89 (J= 7,0) y 1,64 (H-24). El carbono olefínico no protonado (d_C 135,10) mostró picos-cruzados HMBC con una señal de protones a d_H 0,91 (H-28; J= 7,0) y 1,48. De esta manera se completó la asignación estructural de una cadena lateral con un doble enlace trisustituído, cuatro metilos y un metilo olefínico, como se muestra en la estructura parcial B (Figura 3).

Paralelamente al análisis sistemático de los datos obtenidos para el triterpeno, se realizó una revisión bibliográfica de compuestos de la misma naturaleza química, encontrándose que los datos espectrales de RMN ¹H y RMN ¹³C arrojados por los estudios hechos al triterpeno aislado en este trabajo eran muy similares a la mayoría de las señales obtenidas con esas técnicas para un compuesto 4µ-metilesterol acetilado (D´Armas, 2001, 2002), el cual corresponde al acetato del dinosterol. En las Tablas VIII y IX se aprecia la similitud en la mayoría de los desplazamientos químicos, a excepción de algunas variaciones en señales asignadas a carbonos cercanos al puente de oxígeno en el anillo A.

El análisis sistemático de los datos del estudio de este triterpeno y la comparación de las mismos con lo reportado en la literatura para esteroles C₃₀ llevan a proponer al derivado 3,5-epoxi del dinosterol como posible estructura del compuesto triterpenoidal. Para este compuesto se asumió una unión trans de los anillos A/B (Figura 1) y la orientación de los metilos en C-4, C-21 y C-24 se asumió como la misma del dinosterol. La estructura del compuesto se definió como un derivado 3,5-epoxi del dinosterol (Figura 4), la cual es única, ya que no ha sido reportada en la literatura.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Consejo de Investigación de la Universidad de Oriente (UDO) y al Departamento de Química (Núcleo de Sucre) por el financiamiento parcial del trabajo, a la Universidad Central de Venezuela (UCV) y al Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), por facilitar la realización de los análisis de RMN, y al Instituto de Biomedicina (IIBCA) de la UDO, por la realización de los análisis IR.

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