Caracterización polifásica de salmonella spp. Aislada de campos agrícolas de melón (cucumis melo) y cilantro (coriandrum sativum)

Evelia Acedo-Félix, Yolanda Núñez-Hernández, Rosalva Pérez-Morales, Claudia M. Iñiguez-Palomares y Lucía Castillón-Campaña

Evelia Acedo-Félix. Doctora en Ciencias, Universidad de Valencia, España. Investigador, Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A. C. (CIAD) Dirección: Carr. a la Victoria Km 0.6, Apdo. postal 1735. Hermosillo, Sonora. México. e-mail: evelia@ciad.mx

Yolanda Núñez-Hernández. Química-Bióloga, Universidad de Sonora (UniSon), Verificadora, Secretaría de Salud, Sonora, México.

Rosalva Pérez-Morales. Química-Bióloga, Unison, México. Técnico, CIAD, Hermosillo, México.

Claudia M. Iñiguez-Palomares. Doctora en Ciencias y Posdoctorante, CIAD, Hermosillo, México.

Lucía Castillón-Campaña. Química-Bióloga, Unison, México. Docente, Unison, México.

RESUMEN

Se evaluó la diversidad serológica y genética de cepas de Salmonella spp. aislada de campos de cultivo de melón Cantaloupe (Cucumis melo) y cilantro (Coriandrum sativum). Para identificar al patógeno se realizaron pruebas bioquímicas, serología, susceptibilidad a antibióticos y caracterización por PFGE. Se encontraron 11 muestras contaminadas de los campos de cilantro y 7 de los de melón. Se aisló Salmonella anatum y S. give, principalmente. Solo una de las cepas presentó resistencia a tobramicina. El PFGE mostró que cepas del mismo serogrupo, produjeron patrones electroforéticos similares y el análisis polifásico desplegó cinco grupos distintos con similitud menor al 35%. Es necesario intensificar las buenas prácticas agrícolas y de producción, ya que los serogrupos identificados han sido involucrados en brotes epidémicos. Por otro lado, el análisis polifásico mostró variabilidad genómica y además permite suponer que las cepas de S. give son clonales, no así para S. anatum, que estuvo presente en diferentes muestras.

 Polyphasic typing of salmonella spp. Isolated from cantaloupe melon (cucumis melo) and coriander (coriandrum sativum) fields

SUMMARY

The serological and genetic diversity of Salmonella spp. strains isolated from Cantaloupe melon (Cucumis melo) and coriander (Coriandrum sativum) fields were evaluated. Biochemical test, serology, antibiotic resistance and PFGE were performed to identify isolated strains. Eleven contaminated samples from coriander fields were found, and seven from melon fields. The serogroups identified were mainly Salmonella anatum and S. give. Only one strain was resistant to tobramicyn. PFGE showed five electrophoretic profiles, in agreement with the identified serotypes and in the polyphasic analysis five clusters were observed (<35% similarity). It is necessary to implement good agricultural and production practices, since identified serogroups have been involved in epidemic outbreaks. Moreover, the polyphasic analysis showed genomic variability and also suggests that strains of S. give are clonal. It is not the same for S. anatum strains, which were isolated from different samples.

Caracterização polifásica de salmonella spp. Isolada de campos agrícolas de melão (cucumis melo) e coentro (coriandrum sativum)

RESUMO

Avaliou-se a diversidade sorológica e genética de cepas de Salmonella spp. isolada de campos de cultivo de melão Cantalupo (Cucumis melo) e coentro (Coriandrum sativum). Para identificar ao patógeno foram realizadas provas bioquímicas, sorologia, suscetibilidade a antibióticos e caracterização por PFGE. Encontraram-se 11 amostras contaminadas dos campos de coentro e 7 dos de melão. Isolou-se Salmonella anatum e S. give, principalmente. Somente uma das cepas apresentou resistência à tobramicina. O PFGE mostrou que cepas do mesmo sorogrupo, produziram padrões eletroforéticos similares e a análise polifásica desprendeu cinco grupos distintos com similitude menor a 35%. É necessário intensificar as boas práticas agrícolas e de produção, já que os sorogrupos identificados têm sido envolvidos em surtos epidêmicos. Por outro lado, a análise polifásica mostrou variabilidade genômica e além disso permite supor que as cepas de S. give são clonais, não sendo assim para S. anatum, que esteve presente em diferentes amostras.

PALABRAS CLAVE / Caracterización polifásica / Coriandrum sativum / Cucumis melo / Salmonella spp. /

Recibido: 24/09/2008. Modificado: 23/05/2009. Aceptado: 26/05/2009.

Introducción

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) solían asociarse al consumo de alimentos de origen animal. Sin embargo, los brotes relacionados con los alimentos de origen vegetal son cada vez más comunes. En Estados Unidos, la incidencia de ETAs está frecuentemente asociada al consumo de frutas y verduras frescas, tanto de origen doméstico como de importación. La contaminación de los vegetales proviene principalmente de los utensilios para pelarlos y cortarlos, agua de riego y tierra de cultivo (Brandl y Mandrell, 2002).

En los últimos 18 años, tanto en México como a nivel internacional, se han producido epidemias que se relacionan con melones Cantaloupe y varios serotipos de Salmonella. Algunos de los frutos cosechados en México han sido involucrados con brotes epidémicos por S. chester y en Texas se han asociado con gastroenteritis por S. poona. En ambos casos, la causa fue el consumo de ensaladas de frutas frescas (CDC, 2002). Bowen et al. (2005) realizaron una revisión completa donde se encontró que de 1984 a 2002, se presentaron 23 epidemias en que 1434 personas enfermaron, 42 de ellas requirieron hospitalización y dos murieron. Los agentes etiológicos incluyeron cinco serogrupos de S. enterica, Campylobacter jejuni, Escherichia coli O157:H7 y norovirus. El cilantro (Coriandrum sativum), se ha visto involucrado en menos ocasiones con brotes epidémicos que el melón; sin embargo, un brote por S. thompson debido al consumo de salsa en un restaurante hasido resgistrado (Campbell et al., 2001).

Por otra parte, la diversidad entre las salmonelas ha sido estudiada usando varios métodos, como perfiles de resistencia antimicrobiana y tipeado de fagos, y por métodos genómicos, incluyendo electroforesis de campo pulsado (PFGE del inglés), polimorfismo de fragmentos amplificados (AFLP del inglés), análisis de perfiles de plásmidos, etc. La tipificación genómica de Salmonella ha sido reconocida como una herramienta importante en epidemiología, ya que ayuda en la identificación de las fuentes de infección, la detección de contaminación cruzada, el reconocimiento de cepas particulares y el monitoreo de estrategias de intervención. Entre los métodos genómicos, la PFGE está considerada como el método estándar para el tipeado del ADN de Salmonella spp. y otros patógenos, por lo que ha sido propuesta como un sistema para diferenciar cepas epidémicas de las endémicas (Bennasar et al., 2000; Bender et al., 2001). El objetivo de este trabajo fue evaluar la diversidad serológica y genética de Salmonella spp. aislada de muestras ambientales (agua y tierra), melón Cantaloupe (Cucumis melo) y cilantro (Coriandrum sativum) para determinar la clonalidad de las cepas identificadas.

Materiales y Métodos

Para los muestreos se seleccionaron dos campos agrícolas de melón de la Costa de Hermosillo y dos de cilantro ubicados en el poblado de Zamora, con una distancia de ~70km entre los dos sitios. Se tomaron 66 muestras de melón, 38 de cilantro, 21 de tierra y 52 de agua de riego. Las muestras fueron colectadas en bolsas de plástico estériles, de acuerdo a FDA (1998), las cuales fueron trasladadas en hieleras al laboratorio e inmediatamente procesadas.

Aislamiento e Identificación de Salmonella spp.

Se tomaron 25g o 25ml de cada muestra, que se agregaron a 225ml de caldo lactosado (Difco-Becton Dickinson & Co., Sparks, MD, EEUU) para realizar el pre-enriquecimiento, siguiendo el procedimiento descrito en la norma SSA (1995). Después del aislamiento de las colonias puras, se seleccionaron al menos tres de cada placa para realizar la caracterización bioquímica de acuerdo a la norma anteriormente mencionada.

Detección por PCR

De las colonias sospechosas se amplificó un fragmento de 163pb del gen, que corresponde al origen de replicación del ADN de Salmonella spp., con los iniciadores Sal1 5´-TTA TTA GGA TCG CGC CAG GC-3´ y Sal2 5´-AAA GAA TAA CCG TTG TTC AC-3´. Se utilizaron las condiciones de 94ºC/1min, 50ºC/1min y 72ºC/1min, todo repetido por 36 ciclos (Espinoza et al., 2006).

Serología

La determinacion del serogrupo se realizó en el Instituto Nacional de Referencia Epidemiológica (INDRE), México, por el método de aglutinación somática y flagelar (Popoff et al., 1991).

Susceptibilidad antimicrobiana

Se analizó la susceptibilidad de las salmonelas a diferentes antibióticos de amplio espectro o específicos para bacterias gram negativas, por la técnica de difusión en agar Mueller-Hinton (Difco-Becton Dickinson & Co., Sparks, MD, EEUU), en NCCLS (2002). Se utilizaron discos de papel (Sensi-Disc) de la marca BD (Difco-Becton Dickinson) que incluyeron ampicilina 10mg (AM), ciprofloxacino 5mg (CIP), gentamicina 10mg (GE), tetraciclina 30mg (TE), sulfametoxazol-trimetroprima 23,75/1,25mg (SXT), ácido nalidíxico 30mg (NA), ceftriaxona 30mg (CRO), amikacina 30mg (AN), polimixina B 300U (PB), tobramicina 10mg (NN), Imipenem 10mg (IMN) y carbenicilina 100mg (CB).

Análisis de macrorestricción y PFGE

Para la purificación del ADN se embebieron las células de salmonela en agarosa de bajo punto de fusión (BMA, Rockland, MD, EEUU) y se utilizaron discos en los que se llevó a cabo una lisis de acuerdo a la técnica de Tenreiro et al. (1995). Cada disco de agarosa se digirió por separado con 10U de las enzimas de restricción XbaI y SpeI New England Biolabs, EEUU). Los discos digeridos se colocaron en los pocillos del gel de agarosa (Seakem GTG; FMAC) al 1% y se realizó electroforesis de campo pulsado utilizando el sistema CHEF-MAPPER (Bio-Rad, Hercules, CA, EEUU) en buffer TBE 0,5X, a 14°C y voltaje de 6V·cm^-2.

La separación de los fragmentos de ADN se realizó utilizando un programa en dos fases. En la primera los tiempos de pulso aumentaron progresivamente de 5 a 30s por 78h y en la segunda, de 60 a 90s, por 9h. Se incluyó un marcador de bajo peso molecular (Lambda Ladder PFG Marker, New England BioLabs). Los geles se tiñeron con bromuro de etidio (Bio-Rad) y se fotografiaron bajo luz ultravioleta (Fotodyne Inc.).

Análisis de resultados

La relación genómica de Salmonella spp. se estimó definiendo el número de bandas migrantes para cada una de las cepas, aplicando el coeficiente de similitud de Dice. Se incluyeron los resultados de la caracterización bioquímica y serológica. El dendrograma se calculó utilizando el método de medias aritméticas UPGMA (Unweighted-Pair Group Method), con el software BioNumerics (Applied Maths Ver. 3.0) y se determinó el porcentaje de similitud que existe entre cada una de las cepas aisladas de las diferentes muestras.

Resultados y Discusión

Aislamiento e identificación de Salmonella spp.

En la Tabla I se muestra las características de las cepas de Salmonella aisladas de los campos de melón y cilantro, así como el origen de las muestras contaminadas. Se aislaron 11 cepas de Salmonella a partir de las muestras del campo de cilantro y 7 del campo de melón. Las fuentes principales de contaminación en ambos casos fueron el agua de riego y la tierra, las cuales han sido reportadas como la principal fuente de contaminación de diferentes frutos y hortalizas. Gagliardi et al. (2003) realizaron un estudio para detectar la contaminación de melón Cantaloupe por Salmonella spp. en diferentes momentos del proceso poscosecha. Solo aislaron al patógeno del agua de riego y filtros, y suponen que la contaminación puede provenir de la fauna nativa de los campos agrícolas, como es el caso de aves y bovinos que generalmente forman parte de la vida de los habitantes del campo. Esta situación también fue observada principalmente en los dos campos de melón muestreados, donde los trabajadores generalmente contaban con ganado vacuno y canes en sus casas. Los represos o cuerpos de agua de riego estaban a cielo abierto y ahí bebían todos los animales, así como una gran variedad de pájaros y posiblemente otro tipo de fauna. Por otra parte, en los campos de cilantro no había casas de habitación, pero las personas encargadas de la recolección generalmente eran acompañados por los perros y el agua de riego era transportada por canales. Aún cuando se aisló mayor cantidad de cepas del campo de cilantro, en el campo y en el fruto de melón se aisló mayor variedad de serotipos.

Johnston et al. (2005) realizaron un análisis de las cadenas productivas de lechuga (Lactuca sativa), cilantro (C. sativum), perejil (Petroselinum crispum), repollo (Brassica oleraceae var. viridis), melón Cantaloupe (C. melo), mostaza (Brassica alba) y espinacas (Spinacia oleracea), demostrando que cada etapa de la cadena productiva (tierra de cultivo, agua de riego, lavados, personal, contenedores, empaques, etc.), desde el campo hasta el consumidor, puede afectar la carga microbiana de los productos de origen vegetal. Las cadenas que no presentaron contaminación fueron las de cilantro, mostaza y perejil.

Kubo et al. (2004) señalan que algunos compuestos volátiles del cilantro tienen efecto antimicrobiano, puesto que los compuestos alifáticos (2E)-alquenales y alcanales, característicos del cilantro (C. sativum) mostraron actividad bactericida contra Salmonella choleraesuis ATCC 35640. Posiblemente, por lo anterior no se pudo aislar al patógeno de ese vegetal en este trabajo. A pesar de las pobres prácticas de higiene en el cultivo del cilantro, Salmonella spp. ha sido muy poco aislada de este alimento y solo del agua de riego y de la tierra de cultivo. En el presente trabajo se pudo aislar la bacteria del melón; sin embargo, no se aisló del cilantro, posiblemente gracias a la presencia de su sistema de defensa natural con los compuestos aromáticos.

Identificación serológica

En la Tabla I se muestran los resultados de la caracterización serológica, donde se aprecia que el serogrupo que predominó fue S. anatum, tanto en los dos campos de melón, como en los de cilantro. Gutiérrez-Cogco et al. (2000) dieron a conocer que los serogrupos de Salmonella más frecuentes en México, aislados de muestras humanas y de alimentos, son typhimurium, enteritidis, derby, agona y anatum, mientras que en diferentes epidemias internacionales producidas por S. enterica han predominado los serogrupos enteritidis, typhimurium, anatum, virchow y hadar (Peters et al., 2003). Los resultados de Gutiérrez-Cogco et al. (2000) hacen suponer que algunos de los alimentos analizados fueron vehículos de ETAs, ya que en el 4,2% de las muestras humanas se encontraron los mismos serogrupos que en el alimento consumido.

El principal serogrupo aislado en este trabajo, S. anatum, se caracteriza por producir desórdenes intestinales con sintomatología similar a la fiebre tifoidea. En Gran Bretaña se presentaron 12 casos de infección en infantes de 1-11 meses por este serogrupo, que se diseminó por el consumo de una fórmula láctea (Threlfall et al., 1998). S. give, otro serogrupo identificado, comúnmente se detecta en heces, vísceras y carne de aves así como en harinas de carne (Hofer et al., 1997). Higgins et al. (1997) lo aislaron de heces diarreicas y alimento para bovinos, y de intestinos de caprinos y avestruz en diferentes regiones de Quebec. Por su parte, S. newport se asocia más con diarrea de bovinos adultos, produciendo pérdidas de peso y pobre producción, aunque también se ha asociado con brotes en humanos causados por cepas multiresistentes (Zansky et al., 2002).

Susceptibilidad a los antibióticos

Las 18 salmonelas analizadas no presentaron resistencia a los antibióticos, excepto una Salmonella del grupo H, que mostró resistencia intermedia a tobramicina (Tabla I). Lo anterior puede indicar que estas cepas han tenido poco contacto con ambientes contaminados con antibióticos, a diferencia de la mayoría de las de origen animal (Zansky et al., 2002).

Las salmonelas y otros patógenos de origen alimentario adquieren la resistencia a antibióticos por mutaciones cromosómicas al azar, mutaciones de genes existentes, y a través de mecanismos específicos tales como transducción, transformación y conjugación. Esos mecanismos involucran la transferencia de genes de resistencia a antimicrobianos por medio de ADN de plásmidos circulares, tales como factor R, plásmidos conjugativos o elementos cromosómicos (Poppe et al., 1996).

La tobramicina es un antibiótico aminoglucósido de amplio espectro especialmente destinado para combatir bacterias de tipo gram negativas. Los antibióticos se agregan al alimento de los animales (bovinos, porcinos y aves principalmente) y al agua en bajos niveles (15-25ppm) para mejorar su desempeño y en niveles altos (100-200ppm) para tratar enfermedades bacterianas específicas. La generalización del uso de antibióticos en alimentos para ganado ha provocado la emergencia de cepas resistentes de patógenos transmitidos por alimentos, tales como Salmonella, Escherichia coli y Campylobacter spp., así como bacterias endógenas de la microflora animal. Esas cepas resistentes pueden ser transmitidas a los humanos a través de los alimentos. Los aislamientos de Salmonella multiresistentes ya se han generalizado en forma alarmante a nivel mundial (Nayak y Kenney, 2002).

Análisis de macrorestricción y PFGE

En la Figura 1 se muestran los perfiles electroforéticos de las salmonelas aisladas. Se observaron cinco patrones de bandas diferentes, con la enzima de restricción SpeI, uno por cada serogrupo identificado. En la Figura 2 se muestra el dendrograma obtenido de la caracterización polifásica. Se obtuvieron 5 grupos principales. En el grupo 1 se encuentra la cepa de S. newport y las dos cepas del serogrupo H con un porcentaje de similitud del 50%. S. anatum pertenece al grupo 2, con 100% de similitud a pesar de que las cepas provinieron de campos diferentes y distantes. En el grupo 5 se encuentra S. give con 100% de similitud. Todas las cepas de este serogrupo se aislaron de agua de riego del campo de cilantro. La similitud entre los serogrupos fue <35%. Los grupos 3 y 4, que están formados por las cepas control, tuvieron poca similitud entre ellas y con las cepas obtenidas del campo.

La diversidad entre las salmonelas ha sido estudiada utilizando varios métodos como los perfiles de resistencia antimicrobiana, tipeado de fagos y PFGE (Poppe et al., 1996; Higgins et al., 1997; Peters et al., 2003). La tipificación genómica de este patógeno ha sido reconocida como una herramienta importante a nivel epidemiológico, ya que ayuda en la localización de las fuentes contaminantes en brotes epidémicos, detección de contaminación cruzada, reconocimiento de cepas particulares y monitoreo de estrategias de intervención.

El método principal, internacionalmente aceptado para identificación de Salmonella es el serotipeado, seguido de la tipificación de fagos para discriminar entre los serogrupos más comunes. Los perfiles de ADN se usan a menudo en brotes epidémicos, donde se necesita una mejor discriminación de las cepas. Entre los métodos genómicos, el PFGE está considerado como el método estándar para el genotipado de Salmonella y se ha propuesto como un sistema para diferenciar cepas epidémicas de las endémicas (Gebreyes et al., 2006). Higgins et al. (1997) estudiaron la presencia de S. give en bovinos, caprinos y avestruces en diferentes regiones; los patrones de susceptibilidad antimicrobiana, fagotipado y PFGE confirmaron que todos los aislamientos pertenecían al mismo clon.

En Estados Unidos se ha aplicado PFGE para el estudio de epidemias internacionales de S. enterica, que incluyen los serotipos enteritidis, typhimurium, anatum, virchow y hadar, los cuales han estado asociados a enfermedades transmitidas por alimentos. También se ha formado una red de tipificación del CDC con la técnica de PFGE tanto para E. coli O157:H7 como para Salmonella y el modelo ya se ha extendido a la región Asia Pacífico y Sudamérica (Peters et al., 2003). La PFGE también ha sido utilizada en otras partes del mundo para establecer las causas de las ETAs relacionadas con los serotipos typhimurium, paratyphi, agona, stanley, saphra y javiana (Little, 2001).

El uso de agua de riego contaminada, pobres prácticas de higiene en los trabajadores, falta de buenas prácticas agrícolas y de producción pueden favorecer la presencia de Salmonella spp en el producto final, en cualquier alimento de origen vegetal. La identificación exacta del agente causal puede permitir el control sanitario de los productos, principalmente los que son para consumo directo, como es el caso del cilantro y del melón. Desde el punto de vista epidemiológico, es necesario conocer cuáles son los serotipos circulantes y los de nueva introducción para poder determinar las acciones de prevención requeridas.

Conclusiones

La incidencia del serogrupo S. anatum es un fuerte indicio de que existen animales portadores (aves, ganado, animales domésticos, etc) en los campos estudiados o muy cercanos a ellos. Es necesario intensificar las buenas prácticas agrícolas y de producción, a fin de minimizar el riesgo de presencia de este patógeno en el producto final, ya que los serogrupos identificados han estado involucrados en brotes epidémicos en otros países.

El análisis polifásico permite suponer que las cepas de S. give son clonales, puesto que muestran 100% de similitud y fueron aisladas de la misma fuente y únicamente de los campos de cilantro. Caso contrario sucede con S. anatum, que a pesar de que el análisis polifásico mostró 100% de similitud entre las cepas identificadas, éstas provienen de fuentes diferentes y de campos de melón y cilantro distantes unos de los otros. Para confirmar que se trata de cepas clonales, habría que realizar análisis genómicos adicionales y buscar el origen de contaminación para ambos campos.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido financiado por el proyecto INVCIAD86 de la Fundación PRODUCE. Capítulo Sonora, México.

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