PCR Multiplex para detecção de staphylococcus aureus enterotoxigênicos isolados de alimentos de origem animal no sul do rio grande do sul, Brasil

Fernando Zocche, Rodrigo Correa França, José Antônio Guimarães Aleixo, Ângela Nunes Moreira e Wladimir Padilha Da Silva

Fernando Zocche. Médico Veterinário e Doutor em Ciências, Universidade Federal de Pelotas, UFPel, Brasil. Professor, UFPel, Brasil. Endereço: Laboratório de Microbiologia de Alimentos - UFPel. Campus Universitário s /n. Caixa Postal 354, 96010000, Pelotas, RS, Brasil. e-mail: fernandozocche@hotmail.com 

Rodrigo Correa França. Médico Veterinário e Bolsista FAPERGS, UFPel, Brasil. e-mail: rodrigodfranca@yahoo.com.br 

José Antônio Guimarães Aleixo. Médico Veterinário e Doutor em Microbiologia Aplicada, Purdue University (EEUU). Professor, UFPel, Brasil. e-mail: biotjaga@ufpel.edu.br 

Ângela Nunes Moreira. Nutricionista e Doutora em Biotecnologia, UFPel, Brasil. Professora, UFPel, Brasil. e-mail: angelanm@ufpel.edu.br 

Wladimir Padilha Da Silva. Médico Veterinário e Doutor em Ciência dos Alimentos, Universidade de São Paulo. Professor, UFPel, Brasil. e-mail: silvawp@ufpel.edu.br 

RESUMO

Este trabalho teve como objetivo desenvolver duas PCR multiplex (PCRm) para a detecção dos genes das enterotoxinas estafilocócicas (EE) A (sea), B (seb), C (sec) e D (sed) em Staphylococcus aureus isolados de alimentos de origem animal, bem como relacionar a presença desses genes com a origem do microrganismo. As duas PCRm foram padronizadas utilizando-se cepas de S. aureus cuja capacidade toxigênica foi previamente confirmada através de ELISA indireto, com o uso de toxinas e soros antitoxinas de referência. Em seis (12%) dos 50 isolados de S. aureus foi possível detectar um ou mais genes de EE, sendo que um isolado albergava os genes sea e seb, três isolados albergavam seb e dois albergavam sed. As duas PCRm desenvolvidas são eficientes para a detecção dos genes sea, seb, sec e sed e, considerando-se a associação existente entre S. aureus enterotoxigênicos portadores dos genes sea e seb e humanos, e genes sec e sed com outros animais, a origem mais provável da maioria dos isolados foram os manipuladores de alimentos.

Multiplex PCR for detection of enterotoxigenic staphylococcus aureus isolated from food of animal origin in south of rio grande do sul, Brasil

SUMMARY

The object of this work was to develop two multiplex PCR (mPCR) for the detection of genes of staphylococcal enterotoxins (EE) A (sea), B (seb), C (sec) and D (sed) of Staphylococcus aureus isolated from food of animal origin and to relate the presence of the genes with the origin of the microorganism. The two mPCR were standardized using strains of S. aureus whose toxigenic capacity was previously confirmed through indirect ELISA, with the use of reference toxins and serum antitoxins. In six (12%) out of 50 isolates of S. aureus it was possible to detect one or more genes of EE; one isolate harbored sea and seb genes, three isolates harbored seb and two harbored sed. The two sets of mPCR developed are efficient for the detection of the sea, seb, sec and sed, and, considering the existing association of enterotoxigenic S. aureus genes sea and seb with human beings and genes sec and sed with other animals, the most likely origin of the majority of the isolates are the food handlers.

PCR Multiplex para detección de staphylococcus aureus enterotoxigénicos aislados de alimentos de origen animal en el sur de río grande do sul, Brasil

RESUMEN

Este estudio tuvo como objetivo desarrollar dos PCR multiplex (mPCR) para la detección de los genes de enterotoxinas estafilococicas (EE) A (sea), B (seb), C (sec) y D (sed) en Staphylococcus aureus aislados de alimentos de origen animal, y relacionar la presencia de los genes con el origen del microorganismo. Las mPCR fueron estandarizadas utilizando cepas toxigénicas de S. aureus, cuya capacidad fue previamente confirmada por ELISA indirecto, con la utilización de toxinas y sueros de referencia. En seis (12%) de los 50 S. aureus aislados fue posible detectar uno o mas genes de EE, siendo que un aislado albergaba sea y seb, tres aislados albergavam seb y dos albergavam sed. Los dos conjuntos de mPCR desarrollados son eficaces en la detección de los genes sea, seb, sec y sed, y, teniendo en cuenta la asociación entre S. aureus enterotoxigénicos con genes sea y seb y humanos, y los genes sec y sed con otros animales, el origen más probable de la mayoría de los aislados son los manipuladores de alimentos.

PALAVRAS CHAVE / Contaminação / Enterotoxigenicidade / Intoxicação Alimentar / Marcadores Genéticos / Staphylococcus aureus /

Recebido: 20/08/2008.   Modificado: 18/06/2009.   Aceito: 20/06/2009.

Introdução

O gênero Staphylococcus é formado por 41 espécies e 24 subespécies (Euzéby, 2008). Entre as bactérias deste gênero, Staphylococcus aureus é a mais relacionada a casos e a surtos de intoxicação alimentar devido à sua capacidade de produzir enterotoxinas (EE) (Chen et al., 2004; Silva et al., 2005). Até o momento, já foram descritas e purificadas dez EE envolvidas com intoxicação alimentar: EEA, EEB, EEC₁, EEC₂, EEC₃, EED, EEE, EEG, EEH e EEI, as quais, após pré-formadas e ingeridas com o alimento, podem causar sintomas tais como náuseas, vômitos, dores abdominais e diarréia (Jorgensen et al., 2005). S. aureus pode produzir uma ou mais EE simultaneamente (Silva et al., 2005) e, apesar deste patógeno ser produtor de uma grande variedade de EE, 95% dos surtos são causados pelas enterotoxinas A, B, C, D e E (Letertre et al., 2003).

Leite e derivados lácteos são os alimentos mais envolvidos em casos e/ou surtos de intoxicação alimentar estafilocócica (Cenci-Goga et al., 2003; Fueyo et al., 2005) devido ao fácil acesso de S. aureus a matéria-prima, uma vez que este microrganismo é um dos principais agentes de mastite bovina (Zschöck et al., 2005). No entanto, outros alimentos de origem animal podem ser veículos do microrganismo e de suas enterotoxinas (Atanassova et al., 2001; Lancette e Bennett, 2001; Franco e Landgraf, 2002; Jay, 2005).

Nos últimos anos, diversos trabalhos reportaram o uso da amplificação in vitro do DNA pela reação em cadeia da polimerase (PCR; polymerase chain reaction), para a detecção de patógenos em alimentos (Blaiotta et al., 2004; Chen et al., 2004; Kwon et al., 2004; Gandra, 2006). Para S. aureus, a detecção e a genotipagem de genes de EE para serem utilizados como marcadores genéticos, têm sido realizadas através de PCR uniplex, PCR multiplex e, mais recentemente, através de PCR em tempo real (Sharma et al., 2000; Tamarapu et al., 2001; Nájera-Sánchez et al., 2003; Kwon et al., 2004; Chiang et al., 2008). Essas técnicas são rápidas, específicas, sensíveis e confiáveis quando comparadas às metodologias tradicionalmente utilizadas para a diferenciação e identificação deste microrganismo. Entre essas, destaca-se PCR multiplex (PCRm), que é uma variação da PCR, a qual utiliza dois ou mais pares de primers na mesma reação, permitindo a detecção de mais de um gene simultaneamente. Considerando o potencial da PCRm como meio de diagnóstico para identificação de S. aureus, além da importância de se determinar o tipo de EE como fator relevante na avaliação epidemiológica de casos e surtos de intoxicação estafilocócica, objetivou-se desenvolver duas PCRm para a detecção dos genes codificadores de EEA, EEB, EEC e EED em S. aureus isolados de leite in natura e de outros alimentos de origem animal, bem como relacionar a presença dos genes com a origem desses microrganismos.

Material e Métodos

Cepas e isolados bacterianos

Para a padronização da PCRm foram utilizadas quatro cepas de Staphylococcus aureus enterotoxigênicos (S. aureus FRI100, S. aureus FRIS6, S. aureus FRI361, S. aureus FRI472), uma cepa enterotoxigênica (S. aureus 4752) isolada no campo e uma cepa de Staphylococcus warneri, não produtora de enterotoxinas, como controle negativo. As culturas bacterianas utilizadas e o tipo de enterotoxina produzida podem ser visualizados na Tabela I.

Após a padronização, 50 isolados de S. aureus foram avaliados quanto a presença dos genes de EEA, EEB, EEC e EED, sendo 30 deles oriundos de leite in natura e 20 de diversos produtos de origem animal: queijo (n= 1), charque (n= 2), embutidos cárneos (n= 8) e carcaça de frango (n= 9). Os isolados foram identificados através de semeadura em ágar Baird-Parker (Acumedia^®), ágar Baird-Parker suplementado com acriflavina (7μg·ml^-1; Sigma^®), coloração de Gram, produção de coagulase em plasma de coelho, catalase e b-galactosidase (Sigma^®), conforme descrito por Gandra (2003) e Lancette e Benett (2001).

Extração de DNA

A extração de DNA genômico dos isolados de S. aureus foi realizada de acordo com o protocolo descrito por Matthews et al. (1997), com modificações. Inicialmente, transferiu-se uma alçada de uma cultura de S. aureus em ágar tripticase de Soja (TSA; Acumedia^®) incubado a 37ºC por 24h para 100µl de tampão Tris-EDTA (10mM Tris base e 5mM EDTA, pH 7,8) de forma a obter a turbidez 1,0 da escala de MacFarland. A lise do peptideoglicano celular ocorreu pela adição de 100µl de lisostafina (100μg·ml^-1; Sigma^®) e incubação a 37ºC em banho-maria por 45min. Para completar a lise celular, adicionou-se 20µl de tampão Tris-EDTA (50mM Tris base e 20mM de EDTA, pH 7,8) contendo 20% de dodecil sulfato de sódio (SDS; Pharmacia^®) e 3µl de proteinase K (20mg·ml^-1; Invitrogen^®), e incubou-se em banho-maria a 37ºC por 1h. A seguir, adicionou-se 200µl de solução NaCl 5M e agitou-se manualmente por 15sec. Separou-se o material intracelular através de centrifugação a 10.000 x g por 15 minutos a 4ºC e transferiu-se o sobrenadante para um novo microtubo. Adicionou-se fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1) para a liberação e separação de proteínas e, após centrifugação a 10000g por 15min, transferiu-se o sobrenadante para um novo microtubo. A precipitação do DNA foi realizada com 800µl de álcool etílico absoluto gelado, e manutenção em -20ºC por, no mínimo, 2h. Após, foi realizada nova centrifugação a 10000g por 15min a 4ºC, ressuspendendo-se o pellet com 30µl de água ultrapura estéril. A qualidade e a quantidade de DNA extraído foram estimadas por eletroforese em gel de agarose 1% e comparação com o padrão de massa molecular DNAl/HindIII (Invitrogen^®).

Primers e PCR multiplex

Foram utilizadas duas PCRm com os primers descritos na Tabela II. Na primeira PCRm utilizou-se 250mM de cada um dos primers ESA1 e 2, ESB1 e 2, femA1 e femA2, solução tampão para PCR, 5mM de cloreto de magnésio, 218µM de dNTPs mix, 1,5U de Taq DNA polimerase e 1µl do DNA alvo (10-20ng·µl^-1) em 40µl de volume final. Na segunda, utilizaram-se os mesmos constituintes, exceto pelos primers, os quais foram SEC1 e 2, SED1 e 2, femA1 e femA2 (250mM). Em todas as PCRm foram utilizados os primers femA1 e femA2 para a amplificação do gene femA, um gene que codifica uma proteína envolvida na resistência de S. aureus à meticilina, que está presente universalmente nesse microrganismo. Assim, a utilização destes primers conferiu um controle interno de amplificação (IAC) não competitivo à reação (Hoorfar et al., 2004), o que minimiza a possibilidade de resultados falso negativos.

A amplificação dos fragmentos alvo foi realizada em termociclador (MJ Research, PTC-100, Peltier Thermal Cycler), através de desnaturação inicial do DNA à 95°C por 5min, seguido de 37 ciclos (95°C - 1min; 44,5°C - 1min e 72°C - 1min), e de extensão final à 72°C por 10min. Os produtos de PCR foram submetidos a eletroforese em gel de agarose 2% contendo brometo de etídeo, e visualizados sob iluminação ultra-violeta. O marcador de massa molecular utilizado foi o 100pb DNA Ladder (Invitrogen^®).

ELISA indireto

Antes da padronização das PCRm, as enterotoxinas estafilocócicas A, B, C e D produzidas pelas cepas padrão de S. aureus utilizadas (Tabela I) foram detectadas e quantificadas através do método indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA indireto). Utilizou-se enterotoxinas puras e soros padrão antitoxinas (FUNED-MG) preparados em coelho, um conjugado composto de anticorpo de suíno anti-imunoglobulina de coelho ligado a peroxidase (Dako A/S^®) e uma solução bloqueadora a base de fluido ascítico produzido em camundongo por hibridoma secretor de IgG2b. Para a padronização do ELISA indireto, diferentes concentrações das EE purificadas, diluídas em sobrenadante de um cultivo de S. warneri em caldo brain hearth infusion (BHI; Acumedia^®) dupla concentração e adicionado de 1% de extrato de levedura, foram utilizadas para sensibilizar cavidades de placas de ELISA por 1h a 37ºC. Após a sensibilização, as placas foram lavadas 3 vezes com PBS (tampão fosfato salino, pH 7,4) contendo 0,05% de Tween 20 (PBST) e as cavidades bloqueadas por 1h a 37ºC com fluido ascítico diluído 1:20 em PBST. Repetiu-se a lavagem, adicionaram-se diferentes concentrações dos soros antitoxina diluídos em PBST, e incubou-se 1 hora a 37ºC. Nova lavagem foi feita e o conjugado diluído 1:1000 em PBST foi adicionado. Após incubação por 1h a 37ºC as placas foram lavadas 5 vezes e o substrato cromógeno foi adicionado, deixando-se reagir por 15min. Ao final da reação, a absorbância foi lida em um leitor de placas (Multiskan MCC/340; Titertek^®) a 450nm.

Resultados e Discussão

A avaliação da capacidade toxigênica das cepas padrão através de ELISA indireto confirmou a expressão dos genes de interesse (Tabela III).

Duas PCRm foram padronizadas para a detecção dos genes das EE clássicas (A, B, C e D) de S. aureus, bem como de um gene utilizado como controle interno de amplificação (gene femA). Os fragmentos dos genes sea, seb e femA foram amplificados através da primeira PCRm descrita neste estudo, e os fragmentos dos genes sec, sed e femA, através da segunda. Exemplos de produtos das amplificações destes genes podem ser observados na Figura 1.

Sharma et al. (2000) e Kwon et al. (2004) descrevem que, quando vários pares de primers são utilizados simultaneamente, um ou mais fragmentos de genes podem não ser amplificados, ou podem ocorrer amplificações inespecíficas dificultando a interpretação dos resultados, o que não foi observado neste estudo, uma vez que nas duas PCRm desenvolvidas, todos os genes alvo foram amplificados sem a ocorrência de amplificações inespecíficas.

Após a calibração das PCRm, 50 S. aureus isolados de distintos alimentos de origem animal foram avaliados quanto à presença de genes das EE clássicas, verificando-se que apenas seis (12%) albergavam um ou mais desses genes, como pode ser observado na Tabela IV. Destaca-se que o gene femA, utilizado como controle interno de amplificação (IAC), foi amplificado em 100% dos isolados.

A toxigenicidade de S. aureus é muito variável entre cepas e vários estudos epidemiológicos foram conduzidos para avaliar o percentual de cepas enterotoxigênicas em distintas fontes. Diversas hipóteses têm sido propostas para esclarecer essa variação, entre elas, a origem dos isolados (Chen et al., 2004). Neste estudo, a prevalência de S. aureus portadores dos genes codificadores de EEA, EEB e EED, foi baixa (12%), não tendo sido isolado S. aureus portador do gene sec. Na Dinamarca, Aarestrup et al. (1995), avaliaram 160 S. aureus provenientes de leite in natura, e não encontraram isolados toxigênicos, resultado semelhante ao deste estudo, onde não foram detectados isolados de S. aureus enterotoxigênicos em amostras obtidas a partir dessa mesma fonte. Outro estudo (Santana et al., 2006) também realizado no Rio Grande do Sul, Brasil, demonstrou baixa prevalência de S. aureus enterotoxigênicos em leite cru, ao contrário do evidenciado em outras regiões brasileiras, como por exemplo, em Pernambuco, onde Stamford et al. (2006) encontraram 77% de S. aureus enterotoxigênicos em leite in natura. Com relação ao isolamento em carcaças de frango, neste estudo observou-se que das 9 cepas de S. aureus analisadas, 4 apresentaram genes de EE (44,4%), um índice considerado elevado quando comparado ao descrito por outros autores. Hwang et al. (2007), analisando 87 S. aureus isolados de carne de frango, encontraram 5,7% de cepas albergando o gene sea, e nenhuma portando os genes das outras EE clássicas. Já Kwon et al. (2004) e Smyth et al. (2005), após avaliarem 39 e 15 S. aureus isolados de frangos, respectivamente, não detectaram cepas toxigênicas portadoras dos genes de EE clássicas.

É interessante ressaltar que através das PCRm desenvolvidas foi possível demonstrar que embora a prevalência de S. aureus portadores dos genes das EE clássicas seja baixa em alimentos de origem animal, na região avaliada, há ocorrência de distintos genótipos enterotoxigênicos desse microrganismo, e que há relação entre esses genótipos e a fonte de isolamento do microrganismo, o que é uma informação importante do ponto de vista epidemiológico.

Diversos estudos têm demonstrado que há relação entre a fonte de isolamento e o tipo de EE produzida por S. aureus. EEA e EEB são associadas com contaminação de origem humana (Adesiyun et al., 1998; Fueyo et al, 2005), enquanto EEC e EED, com contaminação proveniente de animais bovinos e suínos, respectivamente (Tollersrud et al., 2000; Stephan et al., 2001; Nájera-Sánchez et al., 2003; Jorgensen et al., 2005). Essa informação permite inferir a provável fonte de contaminação de um determinado alimento. Neste estudo, por exemplo, observou-se que o gene sed não foi detectado nos isolados provenientes de produtos de origem suína (lingüiça), entretanto, os genes sea e seb foram encontrados nesse tipo de produto (Tabela IV), sugerindo contaminação cruzada através de seres humanos, o que pode ser explicado pelo alto grau de manipulação sofrido por esses alimentos. O mesmo pode ser verificado quando se avaliam os isolados provenientes das carcaças de frango, nos quais apenas os genes seb e sed foram detectados.

Outra informação relevante confirmada neste estudo foi que um isolado de S. aureus pode albergar mais de um gene de EE. Observou-se que o isolado proveniente de lingüiça suína portava os genes sea e seb (Tabela IV), resultado semelhante ao relatado por Sharma et al. (2000), Nájera-Sánchez et al. (2003) e por Silva et al. (2005), que também utilizaram PCRm com esse objetivo. A presença de mais de um gene de EE em uma mesma cepa apresenta relevância epidemiológica, tendo em vista a possibilidade de haver produção simultânea das duas enterotoxinas, conforme já descrito por Silva et al. (2005), o que potencializa sua capacidade toxigênica, pois uma vez presente no alimento, pode ocorrer a expressão dos dois genes simultaneamente, com possível envolvimento de ambas toxinas em casos e/ou surtos de intoxicação alimentar.

Conclusões

As PCRm desenvolvidas são eficientes na detecção dos genes de EEA, EEB, EEC e EED de Staphylococcus aureus e permitiram verificar que a prevalência de S. aureus portadores dos genes sea, seb, sec e sed é baixa em alimentos de origem animal, na região sul do Rio Grande do Sul, Brasil e que a origem mais provável dos isolados de S. aureus nas amostras avaliadas são os manipuladores de alimentos.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, processo 478100/04-3, pelo suporte financeiro; à Fundação Ezequiel Dias (FUNED-MG) pelo fornecimento de enterotoxinas estafilocócicas purificadas e soros padrão antitoxinas; à CAPES e à FAPERGS, pela concessão de bolsa de doutorado e de iniciação científica.

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