Variabilidad intraespecifica de Azolla filiculoides, colectadas en la zona centro-occidental de Venezuela

Intra-specific variability in Azolla filiculoides collected in the west-center of Venezuela

Y. Espinoza¹ y R. Gutiérrez¹

1 Instituto de Investigaciones en Recursos Agroecológicos. INIA. Apartado 4653. Maracay 2101. estado Aragua, Venezuela. E-mail: orihuen@yahoo.com

Resumen

La existencia de Azolla filiculoides ha sido reportada en Venezuela; sin embargo, no existen estudios taxonómicos ni agronómicos acerca de esta especie en el país. Con el objetivo de determinar diferencias intraespecificas entre accesiones de Azolla filiculoides colectadas en el Centro-Occidente de Venezuela, se determinaron algunas variables (pH, CE, P, K, Ca, Mg y Fe) del ambiente (suelo y agua) donde se colectaron las muestras de A. filiculoides. Además, se determinó la tasa relativa de crecimiento (TRC), la tasa de fijación simbiótica de nitrógeno (TFN) y el tiempo de duplicación de la biomasa (TD). Así como el contenido de nutrimentos (N, P, K, Ca, Mg, Mn, Fe, Cu, Zn, Na) en el tejido vegetal, el cual se determinó en las accesiones de A. filiculoides creciendo bajo condiciones de invernadero, usando 0,5 g de Azolla en solución Hogland. De acuerdo al análisis de componentes principales las variables Cu, Fe, y Zn medidas en el tejido vegetal, la concentración de los elementos Ca y K en el suelo y Ca en el agua proveniente del ambiente donde se colectó la muestra de A. filiculoides fueron la que causaron mayor varianza. En base a estas variables y considerando la TFN, la TCP, y el tiempo de duplicación el análisis de cluster de las colectas analizadas reveló 3 grupos de A. filiculoides mostrando más de 65 % de similitud entre ellos Los dos grupos dominantes estuvieron formados por 68% de las muestras colectadas. Estos dos grupos son probablemente más exitosos en áreas de alta fertilidad natural, o donde se use fertilizante fosforados con altos contenidos de potasio. Bajo condiciones de alta fertilidad las colectas N^o 28, 29, 31 y 35 se perfilan como las más recomendadas como biofertilizantes nitrogenados para arrozales por su alta tasa de fijación de nitrógeno.
Palabras clave: Azolla filiculoides, accesiones, fijación simbiótica de nitrógeno, tasa de crecimiento, tiempo de duplicación, nutrientes.

Abstract

Azolla filiculoides have been reported as native plant in Venezuela, but there is no taxonomic or agronomic information about this species in the country. The objective of this study was to determine the differences among the Azolla filiculoides species collected in the west-central area of Venezuela. The variability of the environment where Azolla was collected was studied through chemical analysis (pH, CE, P, K, Ca, Mg y Fe) of the soil and water where the samples was found to live. The relative growing rate, nitrogen fixing rate, and the biomass doubling time Also the nutrient content ( N, P, K, Ca, Mg, Mn, Fe, Cu, Zn, Na) concentrations in the A. filiculoide leaf were determined by growing 0.5 g of Azolla in Hogland´s solution under greenhouse condition. According to principal component analysis the variables Cu, Fe, and Zn determined in the leaf and the concentration of P, Ca and K in soil and Ca in water caused greater variability among the Azolla samples. Cluster analysis based on these variables, and including nitrogen fixation rate, double time, and potential growth rate revealed 3 ecotypes of A. filiculoides that showed more than 65% similarity. The two dominant groups contained 68% of the samples taken. These two group will be more successful in areas with high natural soil fertility, or where phosphate fertilizers with high potassium rates are used. Under this condition samples # 28, 29, 31 y 35 are recommended as nitrogen bio-fertilizers in rice fields because of their high nitrogen fixation ability.
Key words: Azolla filiculoides, accessions, symbiotic nitrogen fixation, growth rate, doubling time, nutrients.

Recibido el 17-12-2001 l Aceptado el 7-11-2002

Introducción

Azolla es un helecho acuático que contiene a una cianobacteria, Anabaena Azollae, como simbionte en el lóbulo de su hoja dorsal, la cual es capaz de fijar nitrógeno atmosférico; por esta razón Azolla puede crecer en medio libre de nitrógeno y producir una biomasa rica en este elemento (13). Esta propiedad ha provocado que la simbiosis Azolla-Anabaena se perfile en el mundo como un biofertilizante y suplemento proteico para la alimentación animal (15).

El género Azolla fue establecido por Lamarck en 1783 en Moore (8), y fue inicialmente incluido dentro de la familia Salviniaceae Sadeb., pero recientemente los taxónomos la han asignado a la familia monotípica Azollaceae Chr. (21).

El género esta dividido en 2 secciones (subgéneros) y 6 especies, sobre la base de sus órganos reproductivos (8). Las secciones son EuAzolla y Rhizosperma. Las especies que pertenecen a EuAzolla son A. filiculoides Lamarck, A. caroliniana Willd., A. microphylla Kaulfuss y A. mexicana Presl., y las pertenecientes a Rhizosperma son A. pinnata Brown, y A. nilotica DeCaisne.

Azolla filiculoides Lam., esta ampliamente distribuida en el mundo, ha sido reportada en toda América, Hawai, Australia, Nueva Zelanda, Inglaterra, Alemania y Checoslovaquia (8). En Venezuela, de acuerdo a muestras (exsiccata) depositada en el Herbario Nacional de Venezuela (VEN), se ha reportado su existencia en Mucuchies, Estado Mérida por Pittier, nr. 12917, VEN 20355, Vareski y Pannier, nr. 1213a, VEN 32783; en Estado Tachira por Francisco Delacio y Helena de Delasio nr. 5023, VEN 135375; en el Estado Falcón por Melgueiro y Ballesteros nr. MB231, VEN 321286.

Para el estudio de las diferentes accesiones de Azolla filiculoides se consideraron solo aquellas muestras que fueron capaces de esporular en condiciones de umbráculo, ya que desde el punto de vista agronómico, es importante utilizar material vegetal que sea capaz de formar esporas. Según Quebral (12) los paquetes de esporas de Azolla pueden ser usados como material de siembra, además de facilitar la diseminación de la planta.

Payawal y De Macale (10) han descrito la importancia de conocer las diferencias entre las accesiones de la especie de Azolla filiculoides. De acuerdo a estos autores las condiciones donde se desarrolla la especie puede limitar su capacidad de ser usado como biofertilizante, ya que puede afectar su capacidad de producir biomasa y su fijación biológica de nitrógeno.

El objetivo del presente trabajo fue determinar diferencias intraespecificas entre las especies de Azolla filiculoides colectadas en Vene-zuela, considerando características tanto de la planta así como del suelo y el agua de donde fueron colectadas las muestras de A. filiculoides, así como tasa relativa de crecimiento, tasa de fijación simbiótica de nitrógeno y el tiempo de duplicación de la biomasa.

Materiales y métodos

Colecta del material vegetal. Durante el año 1992, se realizaron 5 misiones de muestreo de la asociación Azolla-anabaena en Venezuela. Los lugares muestreados correspondieron a lagunas, préstamos, canales de drenaje, y agroecosistemas, cuya lámina de agua osciló entre 15-90 cm de profundidad. Se colectaron 16 muestras de A. filiculoides dos en el estado Guárico , tres en Cojedes, una en Barinas, ocho en Portuguesa y dos en Apure. En cada uno de los sitios se tomaron muestras de suelo y agua. Las muestras de suelo fueron secadas al aire, para posterior determinación de pH, conductividad eléctrica (CE), materia orgánica por combustión húmeda, el P y el K fue extraído por el método de Olsen (9), y posteriormente se determinó el P por colorimetría utilizando el método fosfovana-datomolibdato (2). El Ca, Mg, K, Fe, Cu se determinaron utilizando un espectrofotómetro de absorción atómica Perkin Elmer 3100 (Perkin Elmer Corporation, Norwalk, Conneticut) , en el caso de Ca y Mg se uso lantano en HCl al 1%. Las muestras de agua al igual que las de suelo fueron tomadas en el mismo lugar de muestreo, las cuales se preservaron a temperaturas que oscilaron entre 5-10 ^oC hasta el momento de la determinación de las variables mencionadas.

Identificación del material vegetal. Para la identificación del material vegetal colectado (figura 1a) se consideraron características taxonómicas y morfológicas generales como planta algo alongada y las ramas en forma de pino, presencia de papila sobre todas las partes del cuerpo de la planta especialmente el tallo principal (20). Además, se consideró las características del órgano reproductivo masculino (microesporocarpo), el número de esporangios por microesporocarpo (40 a 65), el número de másulas por esporangio (3 a 8), presencia de menos de tres sectas sobre gloquidio en las másulas (figura 1b) y textura "punteada" (parecida a una bola de golf) del órgano reproductivo femenino (megaesporodermo) (figura 1c), como criterios de identificación de la especie A. filiculoides (20).

Tasa relativa de crecimiento, Tasa de fijación de nitrógeno y Tiempo de duplicacion de biomasa. Para la determinación de la tasa relativa de crecimiento (TRC) y tiempo de duplicación de la biomasa (TD), se sembraron 0,5 g de Azolla fresca en recipientes plásticos (95 cm² de superficie y 7 cm de profundidad) conteniendo 250 mL de solución nutritiva de Hogland modificado (sin nitrógeno), y se colocaron en el invernadero. La cosecha se realizó cuando las plantas cubrieron el 100% de la superficie del recipiente. Los tratamientos fueron arreglados en un diseño completamente aleatorio con tres replicaciones. El medio sin nitrógeno fue renovado a los 3 y 6 días de haber comenzado el ensayo, a partir de los 9 días y hasta la cosecha se agregaron 150 mL de solución nutritiva cada 3 días. El incremento del peso fresco de la biomasa fue tomado igualmente cada 3 días, para lo cual se utilizó una malla plástica para el filtrado del material. Luego de la pesada el material fresco era devuelto a los potes originales. Quince días después de la siembra, las frondas de Azolla fueron colectadas, lavadas con agua de chorro y luego con agua deionizada, secadas al aire por media hora. Posteriormente la muestra fue secada en un estufa a 90^oC hasta alcanzar peso constante y por diferencia de peso se determinó el contenido de humedad de la muestra. La tasa relativa de crecimiento y el tiempo de duplicación fueron calculados usando las siguientes formulas:

Donde, p₁ y p₂ son el peso seco inicial y final, respectivamente, y t es el periodo de observaciones en días (7).

Por otra parte, la tasa de fijación biológica de N (TFB) fue establecida luego de la determinación del N total en la planta, realizado a través del método Kjeldahl (4). La TFN fue calculada usando el % de N total determinado al final de la incubación y el tiempo de incubación (t) en días, cuando las plantas habían cubierto el 100% de la superficie del recipiente.

Análisis mineral del tejido vegetal.

a) Azolla filiculoides

b) Gloquidios sobre el órgano masculino

c) Organo femenino

Figura 1. a) Planta de Azolla filiculoides. b) Organo reproductivo masculino mostrando; los gloquidos con menos de tres septas sobre la másula del esporangio. c) Organo reproductor femenino. Textura punteada del megaesporodermo

Para la determinación de N, P, K, Ca, Mg, Mn, Fe, Cu, Zn, Na en el tejido vegetal las muestras se hicieron crece como se indico anteriormente, pero el crecimiento fue llevado a cabo solo por 15 días. Luego de cosechadas, las muestras de Azolla fueron lavadas una vez con agua de chorro y dos veces con agua deionizada, para prevenir cualquier contaminación de los elementos a determinar y posteriormente se secó a 70^oC por 3 días. El nitrógeno total se determinó por el método Kjeldahl (4), utilizando un bloque digestor Tecator 40 modelo 1016 y un destilador automático Tecator 1002, (Tecator, Hoganas, Suiza), la extracción del resto de los elementos se realizó por digestión seca (2). Para la determinación del P se utilizó el método colorimétrico fosfovanadatomolibdato (2). El Ca, Mg, K, Mn, Fe, Cu, Zn, Na se determinaron utilizando espectro-fotometría de absorción atómica, en el caso de Ca y Mg se uso lantano en HCl al 1%. Los resultados fueron reportados en base a peso seco. El diseño fue completamente aleatorio con tres repeticiones por tratamiento.

Análisis de datos. Los datos fueron analizados con procedimientos provistos por el Sistema de análisis estadísticos (SAS) (17). Proc Glm fue usado como un procedimiento para el análisis de varianza y separación de medias. Todos los resultados fueron considerados significativamente diferentes a P<0,05, al menos que se indique lo contrario.

Por otra parte, tanto los resultados obtenidos en los ensayos, así como la caracterización ecológica del lugar donde fue colectada cada accesión fueron tratados por medio de un análisis de factores principales y un análisis de clasificación (clusters). Los clusters fueron agrupados por el método de distancia promedio. El algoritmo de distancias promedio aplicado a las distancias Euclidianas entre las 16 colectas de A. filiculoides estudiados, permitió la elaboración del dendograma el cual agrupa a las accesiones de acuerdo a su similitud. Las accesiones, dentro de un grupo con 65% de similitud, fueron definidas como posibles ecotipos.

Resultados y discusión

Las características de las muestras de suelo y agua de las localidades donde se realizaron las colectas se muestran en el cuadro 1. En éste se observa que la especie Azolla se desarrolla en suelos y aguas muy uniformes en cuanto a pH, los suelos con tendencia a la neutralidad y las aguas hacía la alcalinidad. El resto de las características químicas presentan altos coeficientes de variación, lo que manifiesta la amplia gama de ambientes donde Azolla filiculoides es capaz de desarrollarse, lo cual coincide con lo señalado por San Valentín et al. (16).

En general, todas las accesiones de A filiculoides utilizadas en el experimento presentaron un crecimiento satisfactorio en el medio de cultivo utilizado El cuadro 2 presenta los rangos de concentración de elementos en el tejido vegetal de las 16 accesiones de A. filiculoides. Estos valores están en el rango reportado por Querubín et al. (11). La concentración de N está dentro del rango (4-6%) señalado por Kumarasinghe et al. (5), quienes trabajaron en condiciones similares a las señaladas en el presente ensayo. Existe una baja variabilidad (CV=12,3) en esta variable para las 16 accesiones, lo que sugiere una similitud en la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico. Sin embargo, la Tasa de Fijación de Nitrógeno de las accesiones de A. filiculoides analizadas mostraron diferencias significativas (P<0,05) (cuadro 3).

Cuadro 1. Rango y coeficiente de variación (CV) de algunas características de los suelos y aguas de la región centro-occidental de Venezuela donde se colectó Azolla filiculoides

* Conductividad eléctrica
** Materia orgánica.
***: Coeficiente de variación

Cuadro 2. Rango de variación de las características del tejido vegetal de las muestras de Azolla filiculoides crecidas en condiciones de invernadero

*CV= 12.3

La accesión N^o 29 proveniente de Guanare, estado Portuguesa mostró la más alta TFN (13,78 mg N g^-1 día^-1), y la accesión N^o 42 proveniente de Sabaneta, estado Barinas mostró la TFN más baja (10,32 mg N g^-1 día^-1). Contrariamente, la accesión N^o 42 mostró la TRC más alta y el TD más bajo (cuadro 3). Estos resultados sugieren que esta accesión de A. filiculoides es altamente eficiente en la producción de biomasa en corto tiempo requiriendo una baja cantidad de nitrógeno. De acuerdo a Quintero y Ferrara-Cerrato (14); Singh et al. (18), las características observadas en la accesión N^o 42, la perfilan como una fuente importante de materia orgánica para el suelo debido a su rápida multiplicación, utilizando nitrógeno atmosférico como fuente de N. El resto de las accesiones no mostraron una clara tendencia, en relación a la TFN y la TRC o el tiempo de duplicación de la biomasa.

Cuadro 3. Tasa de fijación simbiótica de nitrógeno (TFN), tasa relativa de crecimiento (TRC) y tiempo de duplicación (TD) de Azolla filiculoides Lam., colectadas en la región centro-occidental de Venezuela.