Respuesta de la microalga Chlorella sorokiniana al pH, salinidad y temperatura en condiciones axénicas y no axénicas

R. Moronta, R. Mora y E. Morales¹

¹Laboratorio de Microorganismos Fotosintéticos. Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela.

Resumen

El cultivo de microalgas de interés económico en condiciones no axénicas puede ser utilizado para acuicultura y tratamiento de aguas residuales; mientras que el cultivo axénico es utilizado para la extracción de productos comerciales. Sin embargo, el comportamiento de las microalgas axénicas puede variar con respecto a las cultivadas en condiciones no axénicas. El objetivo de este estudio es evaluar la respuesta de la microalga Chlorella sorokiniana en función del pH (5, 6, 7, 8 y 9), temperatura (25, 30, 37, 40 y 42°C) y salinidad (15, 25 y 35 ppm) en cultivos no axénicos y axénicos. Todos los bioensayos se realizaron con fotoperíodo 12:12h, 98µmol.quanta.m-2.s-1, 28ºC. Los cultivos no axénicos con medio ALGAL por triplicado se mantuvieron en volumen de 250ml, en matraces de 500ml de capacidad. Mientras que, los cultivos axénicos por cinco réplicas se realizaron en tubos de ensayo con volumen de 15ml, en condiciones autotróficas, mixotróficas y heterotróficas con medio organotrófico. En cultivos no axénicos, la microalga fue más sensible a la salinidad, temperatura y pH <5, con un crecimiento óptimo a 30ºC y pH 7-8 en medio no salino. En cambio, en condiciones axénicas, la microalga fue capaz de crecer hasta 42ºC, 35 ppm de salinidad, a partir de pH 3 alcanzando mayor crecimiento a pH 7-8, entre 0 y 25 ppm y a 37ºC en mixotrofía. La síntesis de clorofila fue mayor en cultivos no axénicos. Estos resultados sugieren que la respuesta de C. sorokiniana, al pH, temperatura y salinidad puede ser modulada por la flora bacteriana asociada.

Palabras clave: Chlorella sorokiniana, pH, salinidad, temperatura, axénico, no axénico.

Response of the microalga Chlorella sorokiniana to pH, salinity and temperature in axenic and non axenic conditions

Abstract

Microalgal culture in non axenic conditions can be used as food source for aquaculture species, wastewater treatment and in axenic conditions for the extraction of valuable chemicals. However, the response of the microalgae in axenics conditions can be modulated with respect to non axenic conditions. The aim of this study was to test the response of the microalga Chlorella sorokiniana in function of pH (5, 6, 7, 8 and 9), temperature (25, 30, 37, 40 and 42°C) and salinity (15, 25 and 35 ppm) in non-axenic and axenic cultures. All bioassays were carried out with photoperiod 12:12h, 98µmol.quanta.m-2.s-1, 28ºC. Non-axenic cultures in ALGAL medium and by triplicate were maintained at volume of 250ml in flasks with 500ml in capacity. Whereas, axenic cultures by fire replicas were carried out in test tubes with volume of 15ml in autotrophic, mixotrophic and heterotrophic conditions with organotrophic and ALGAL medium. In non-axenic cultures, the microalga was more sensible to salinity, temperature and pH below 5, with optimal growth at 30°C and pH 7-8 in non saline medium. Instead, in axenic conditions, the microalga was able to grow up to 42°C, pH above 3 and salinity up to 35 ppm in mixotrophy, reaching the highest growth at pH 7-8, between 0 and 25 ppm and 37°C. Chlorophyll synthesis was older in non axenic cultures. These results suggest that the response of C. sorokiniana, to pH, temperature and salinity can be modulated by associated bacterial flora.

Key words: Chlorella sorokiniana, pH, salinity, temperature, axenic, non-axenic.

Recibido el 24-4-2002     Aceptado el 22-7-2004

Introducción

La variación de las condiciones de cultivo, tales como el tipo y concentración de nutrientes, temperatura, pH, intensidad luminosa, fotoperíodo, régimen de cosecha de cultivos discontinuos, continuos o semicontinuos, manipulación genética, entre otros (15, 27 y 37) ha contribuido a establecer sistemas dirigidos hacia la obtención de biomasa microalgal (17 y 18). La respuesta de las microalgas al pH varía ampliamente, debido a que este factor determina la solubilidad del dióxido de carbono y de los minerales en los cultivos e influye directa o indirectamente en su metabolismo (28, 32 y 38). La temperatura no solo afecta las reacciones celulares, sino también los requerimientos nutricionales y la composición de la biomasa, así como la solubilidad de los gases en el agua (1, 14, 24, 37, 38 y 40).

Los cultivos masivos de microalgas se obtienen típicamente de manera fotoautotrófica, bien sea por el uso de estanques abiertos y luz natural o por una variación de sistemas más intensivos. Sin embargo, se presentan alternativas de producción de biomasa microalgal, tanto en condiciones mixotróficas como heterotróficas. Es decir, cuando son capaces de asimilar fuente de carbono orgánica exhibiendo un crecimiento organotrófico (26, 27 y 35).

Los cultivos mixotróficos producen una elevada cantidad de biomasa comparada a la autotrofía y heterotrofía y ello se debe posiblemente al efecto energético de la luz y del sustrato orgánico (19, 25, 28 y 36). Mientras que los cultivos heterotróficos, desde una perspectiva de ingeniería tienen ventajas sobre los sistemas fotosintéticos ya que se logra obtener proteínas, carbohidratos, lípidos, entre otros, a un menor costo, por prescindir de la iluminación (10 y 43).

Cuando las microalgas están asociadas a bacterias en la naturaleza (no axénicas), se ejerce una interacción que puede ser beneficiosa para ambos; de tal manera que la microalga es capaz de asimilar productos de la actividad bacteriana en el medio. Así mismo, la flora microbiana asociada está implicada en la regulación de parámetros fisiológicos como pH, temperatura y salinidad. En cambio, en condiciones axénicas, las microalgas no llegan a alcanzar un crecimiento óptimo, por carecer de la flora microbiana asociada; la cual le aportará factores esenciales para estimular el crecimiento (7 y 10).

En condiciones de laboratorio, las cepas de microalgas axénicas son de suma importancia en estudios bioquímicos, fisiológicos, genéticos y taxonómicos (19). Los trabajos realizados con microalgas desde el punto de vista fisiológicos son de gran interés, ya que permiten dilucidar si la microalga posee o no mecanismos fisiológicos que le permitan regular condiciones ambientales estresantes, tales como elevada salinidad, pH, temperatura, limitación de nutrientes, deshidratación, entre otros (12, 13 y 41). Es por ello que es necesario realizar estudios sobre la reacción de una microalga ante factores ambientales, la cual puede variar en función de la ausencia o presencia de bacterias asociadas.

Entre las microalgas de mayor importancia se encuentra Chlorella por su valor económico y nutricional, tanto a nivel animal como humano. Por ejemplo, Chlorella vulgaris ha sido utilizadapor su calidad proteica (28) e incluso presenta propiedades antitumorales (30). Actualmente, representa un sistema biológico ideal para diferentes líneas de investigación y además presenta una alta eficiencia por su fácil adaptación en condiciones de laboratorio (4, 5, 6, 9, 19, 21, 28, 31 y 32).

Los cultivos axénicos de microalgas de interés en biotecnología pueden ser utilizados para fines farmacológicos y de nutrición humana. Mientras que, los cultivos no axénicos en los cuales se mantiene la flora bacteriana asociada pueden ser seleccionados para acuicultura, nutrición animal o para biofertilizantes. Sin embargo, la respuesta de las microalgas para cada condición de cultivo es susceptible de ser modificada en función de diversos parámetros de cultivos. No obstante, actualmente se tiene poca información fisiológica de cepas de Chlorella cultivadas tanto en condiciones axénicas como no axénicas (32). En este sentido, se reporta el efecto del pH, salinidad y de la temperatura sobre el crecimiento y contenido de pigmentos de la microalga Chlorella sorokiniana en cultivos discontinuos axénicos y no axénicos y en condiciones mixotróficas y heterotróficas.

Materiales y métodos

Microalga estudiada. Se seleccionó la microalga Chlorella sorokiniana, procedente del Embalse de Tulé ubicado en la Costa Nor-Occidental del Lago de Maracaibo, Municipio Mara, estado Zulia, Venezuela y aislada mediante la técnica de dilución en serie en cultivo selectivo líquido y sólido. La ubicación taxonómica de la microalga se determinó mediante el uso de claves taxonómicas y estudio fisiológico y bioquímico realizado a la cepa (3, 19, 20, 21 y 44).

Descripción de Chlorella. Se describió la microalga Chlorella mediante la observación de sus células en un examen al fresco y en láminas fijadas a través del microscopio óptico. Además se observaron las características morfológicas coloniales de la microalga tanto en medio inorgánico como orgánico.

Obtención del cultivo axénico de la microalga Chlorella. Colonias de la microalga libres de bacterias se aislaron a partir de cultivos unialgales, mediante siembra en medio sólido inorgánico (figura 1). Las placas se incubaron a temperatura ambiente, bajo un sistema de iluminación continua a una intensidad luminosa de 98 mmol quanta.m-2.s-1. Posteriormente las colonias de la microalga aisladas se sembraron en medio de cultivo organotrófico (8), como control para garantizar las condiciones axénicas de la microalga en cultivo líquido y sólido.

 

Chlorella sorokiniana

Figura 1. Aislamiento de colonias de la microalga Chlorella sorokiniana.

Estudios fisiológicos. Todos los cultivos se realizaron con medio comercial ALGAL con un fotoperíodo de 12:12 h, a una intensidad luminosa de 98 µmol quanta.m-2.s-1, 28ºC y a pH inicial de 7. Los cultivos no axénicos con aireación constante, se iniciaron con un inóculo de 1x106 cel.ml-1 en un volumen de 250 ml en matraces de 500 ml de capacidad. Mientras que, los cultivos axénicos con agitación mecánica, se iniciaron por quintuplicado con 5x105 cel.ml-1 en un volumen de 15 ml en tubos con tapa de baquelita.

pH. El crecimiento y la producción de pigmentos de C. sorokiniana, se evaluaron a pH 1, 3, 5, 6, 7, 8 y 9, tanto en cultivos axénicos como no axénicos. Los cultivos no axénicos fueron tamponados con Tris HCl a 25mM. A cada tratamiento se le ajustó el pH dos veces por día, mientras que el control correspondió a cultivos sin ajuste de pH.

El pH en los cultivos axénicos se evaluó en medio de cultivo organotrófico con una intensidad luminosa de 98 µmol quanta.m-2.s-1, mediante la condición mixotrófica y en condiciones heterotróficas bajo oscuridad. El control correspondió a cultivos autotróficos realizados con medio inorgánico ALGAL.

Todos los cultivos se mantuvieron durante 15 días a 25 ± 2°C y al término del cual se determinó la densidad celular, contenido de pigmentos y el pH final. Los cultivos axénicos no fueron tamponados a fin de evitar efecto del mismo sobre las células libres de bacterias.

Salinidad. Este experimento se realizó tanto en cultivos axénicos como no axénicos y se utilizó agua de mar ajustada a las salinidades de 15, 25 y 35 ppm. El control consistió en cultivos no salinos. A los de 15 días de iniciado el experimento se determinó el crecimiento celular y el contenido de pigmentos.

Temperatura. Los cultivos se hicieron crecer a 25, 30 y 37°C en condiciones no axénicas, y a 25, 37, 40 y 42°C en condiciones axénicas. El medio de cultivo organotrófico se utilizó en cultivos mixotróficos y heterotrófícos, mientras que el control se mantuvo con medio inorgánico ALGAL y correspondió a los cultivos autotróficos.

Medios de cultivo: a) Inorgánico. Se utilizó agua destilada esterilizada mediante autoclave a 121°C y 15 psi durante 20 minutos. Posteriormente, el agua se enriqueció con medio de cultivo ALGAL a una concentración equivalente a 6,0 y 8,0 mM de NaNO3 (14). El medio sólido se realizó con agar-agar 1,5% suplementado con nutrientes ALGAL. b) Orgánico. Se preparó medio líquido en tubos con tapa de baquelita de capacidad 20 ml y medio sólido en placas de Petri. Luego de esterilizado el medio organotrófico conformado por extracto de levadura, peptona y glucosa a 5,0; 1,5 y 2,5 g.L-1 respectivamente, se procedió a adicionarle medio ALGAL a una concentración equivalente a 8,0 mM de NaNO3 (8).

Evaluación de la biomasa:

A) Recuento celular. El crecimiento se calculó mediante el recuento de células con un microscopio óptico binocular en cámara de Neubauer mejorada de 0,1 mm de profundidad (15).

B) Determinación de pigmentos. La clorofila a, b y los carotenoides totales se determinaron mediante extracción metabólica. La concentración expresada en pg.cel-1 fue determinada a partir de la ecuación propuesta por Wellburn (42).

Análisis estadístico. El crecimiento y la producción de pigmentos de la microalga en los cultivos no axénicos y axénicos se analizaron a través de la prueba de Scheffé mediante el programa estadístico Stat Most for Window versión 3.0 (Stat Most Corporation, 1995).

Resultados y discusión

Característica morfológica de Chlorella. Es una microalga unicelular inmóvil, sin constricción en la parte media de la célula, de forma esférica, con pared celular lisa y con un cloroplasto en forma de copa (4, 5 y 22). Las colonias de Chlorella a veces están rodeadas de mucílago y la modalidad de la agregación de la célula es característica de las especies lo que facilita su identificación. Aproximadamente, el 90% forman parte del plancton o del bentos de aguas dulces (16).

pH. El crecimiento de la microalga (densidad celular) tanto en cultivos axénicos como no axénicos, se incrementó con el pH. Para los cultivos no axénicos, se obtuvieron los mayores valores a pH 8 y 9, con 344,68±33,45 y 352,34±51,47x106 cel.ml-1, respectivamente (cuadro 1). Siendo el pH 1 y 3 letal para la microalga. Por el contrario, cuando el pH se incrementó a 5 comenzó el crecimiento de la microalga, pero aún con una inhibición del 81,79% respecto al control.

En condiciones axénicas, la microalga también incrementó su crecimiento en función del pH, lo cual indica que su densidad celular se optimiza en el rango alcalino, pero a diferencia de los cultivos no axénicos presentó tolerancia a pH 1 y 3, aunque el crecimiento se mantuvo inhibido a pH 1 la microalga fue capaz de crecer a partir de pH 3, en cultivos autotróficos, heterotróficos y mixotróficos con un incremento de 4; 77,5 y 169 veces respectivamente, en relación a la densidad celular (0,5x106 cel.ml-1) con la que se inició el cultivo (figura 2). Los cultivos mixotróficos y heterotróficos con un pH final de 7,8 produjeron los mayores valores de densidad celular con 122,64±1,33 y 109,43±1,48x106 cel.ml-1. A diferencia de éste último, en los cultivos autotróficos se encontró el valor más elevado de crecimiento celular a pH final de 8,2 y 9,6 con 15,29±0,03 y 16,87±0,04x106 cel.ml-1 respectivamente.

Cuadro 1. Densidad celular (x106 cel.ml-1) y contenido de pigmentos (pg.cel-1) de la microalga Chlorella sorokiniana en función del pH en condiciones no axénicas.
 

Cultivos realizados en condiciones axénicas. Control: no tamponado y no ajustado, con pH final de 9. Chlo/Caro: relación clorofila /carotenoides. Cultivos a pH 5,0 con un porcentaje de inhibición del 81,79% en relación al cultivo control. ND: no determinado por baja densidad celular.

Así mismo, el crecimiento de la microalga fue estimulado en función de la presencia de sustratos orgánicos en el medio de cultivo (autotrofía< heterotrofía<mixotrofía) (figura 2). Es decir, el medio de cultivo organotrófico con iluminación fue el que indujo un mayor crecimiento de la microalga Chlorella. Diversos reportes indican que la condición mixotrófica de crecimiento contribuye a una mayor producción de biomasa en diversas microalgas, con respecto a la heterotrofía y autotrofía (10, 11, 23, 33 y 38).

Estos resultados indicaron también que, el medio de cultivo además del pH, ejercieron influencia sobre el crecimiento. En el medio inorgánico, la mayor densidad celular se alcanzó a pH final de 9,6, mientras que en medio organotrófico con iluminación y bajo oscuridad, se produjo un pH final de 7,8 (figura 2). Es posible, que la carga neta de ciertos sustratos orgánicos en el medio de cultivo, varíe en función del pH, lo cual puede influir en el crecimiento. 

*Cultivo control con pH final de 8.9

Figura 2. Influencia del pH sobre el crecimiento (x106 cel.ml-1) de la microalga Chlorella sorokiniana en cultivos axénicos y no axénicos.

Por otra parte, el hecho de que esta cepa de Chlorella fuese capaz de tolerar un medio de cultivo en condiciones axénicas resultó de interés fisiológico. Sin embargo, en su hábitat natural, caracterizado por su asociación con bacterias, la microalga no creció y perdió viabilidad a pH inferiores a 6. Esto significa que en condiciones axénicas presentó mecanismos fisiológicos inherentes exclusivamente a la microalga, capaces de regular condiciones ambientales muy ácidas, las cuales muchos microorganismos fotosintéticos no son capaces de tolerar, aún cuando están libres de bacterias. En este sentido, se ha reportado que a las especies C. ellipsoidea y C. saccharophila crecen satisfactoriamente a pH entre 2 y 3 y que esta propiedad constituye además una característica taxonómica útil para separar especies dentro del género (21).

La producción de clorofila en condiciones no axénicas fue superior en el control y en los cultivos a pH 7 y 8, con diferencia significativa (P<0,05). En cambio, en condiciones axénicas, el pH no ejerció influencia en el contenido de clorofila, debido a que entre pH 3 y 9 se encontraron valores similares, entre 0,37 y 0,45 pg.cel1 (figura 3). Sin embargo, este pigmento se produjo más en condiciones no axénicas con diferencia significativa (P<0,05), con valores de 3,5; 5,3 y de 5,7 veces más superiores a los obtenidos en los cultivos axénicos mixotróficos, heterotróficos y autotróficos, respectivamente. Estos resultados se reflejan de igual manera por las elevadas relaciones clorofila/carotenoides registradas en los cultivos no axénicos. Es decir, la síntesis de clorofila fue estimulada en la medida que el pH aumentó, mientras que la concentración de carotenoides presenta tendencia a disminuir (cuadros 1 y 2).

Para el caso de los carotenoides se alcanzaron los valores más elevados a pH 7 independientemente de la condición axénica; aunque sin diferencia significativa entre ambos tipos de cultivos (cuadros 1 y 2). 

Figura 3. Influencia del pH sobre el contenido de clorofila (pg.cel-1) de la microalga Chlorella sorokiniana en cultivo axénicos y no axénicos.

Cuadro 2. Relación clorofila/carotenoides en cultivos mixotróficos y heterotróficos de la microalga Chlorella sorokiniana en función del pH, en condiciones axénicas.
 

ND: no determinado por baja densidad celular.

Los resultados indican que la mayor producción de clorofila en cultivos no axénicos posiblemente estuvo relacionada con el aporte de nutrientes ricos en fuentes nitrogenadas y de minerales que pudieron ser aportados por las bacterias asociadas a la microalga, a pesar de que el medio organotrófico en el cual se hizo crecer la microalga libre de bacteria, estuvo muy enriquecido con diversas fuentes nitrogenadas.

Salinidad. Las densidades celulares en fase estacionaria más elevadas se alcanzaron en medio no salino con 59,18±3,63x106 cel.ml-1 para los cultivos no axénicos y de 109,11±1,07 y 89,70±1,0x106 cel.ml-1 para los cultivos mixotróficos y heterotróficos con diferencias significativa (P<0,05) (figura 4). Sin embargo, el incremento de la salinidad produjo un efecto in hibitorio sobre el crecimiento de la microalga. A 25 y 35 ppm, la densidad celular disminuyó en un 97,9% y en un 98,5% respectivamente, en cultivos no axénicos. En cultivos mixotróficos, la microalga creció a todas las salinidades, con un descenso hasta del 61,8% cuando se cultivó a 40 ppm. En cultivos heterotróficos también creció a todas las salinidades, hasta crecer sólo 1,3% respecto a los cultivos no salinos.

Estos resultados indican que el efecto de la salinidad fue más drástico en cultivos axénicos autotróficos y heterotróficos que en los no axénicos. Sin embargo, cuando la microalga creció en cultivos mixotróficos fue capaz de mantener elevadas densidades celulares hasta salinidades de 25 ppm. En cambio, a 35 ppm llega a alcanzar el 62,3% del crecimiento obtenido en ausencia de salinidad (figura 4). Es importante indicar, que el medio de cultivo organotrófico utilizado favoreció el crecimiento de la microalga y al parecer, en presencia de iluminación, la microalga toleró más la salinidad. En este sentido, la salinidad ejerció un efecto más drástico bajo oscuridad, siendo la relación de crecimiento mixotrofia/heterotrofía 30 veces mayor. Es decir, en cultivos mixotróficos se produjo un aumento de la inhibición hasta 38,3%; mientras que, en los heterotróficos llegó a alcanzar hasta 98%.

Figura 4. Influencia de la salinidad (ppm) sobre el crecimiento (x106 cel.ml-1) de la microalga Chlorella sorokiniana en cultivos axénicos y no axénicos.

Asimismo, la salinidad produjo un incremento del contenido celular de clorofila y carotenoides totales, en condiciones no axénicas. Los valores más altos se alcanzaron a 25 y 35 ppm con relación a los cultivos no salinos (figura 5). Probablemente la mayor talla celular producto de una baja velocidad de crecimiento de la microalga con la salinidad, estuvo relacionada con la acumulación de metabolitos y por lo tanto, el contenido celular de clorofila y carotenoides fue superior a los encontrados en las células no expuestas a medio salino. La microalga acumuló 20 y 24 veces más clorofila y carotenoides en medio dulceacuícola, respecto a las cultivadas a 35 ppm en mixotrofía. Sin embargo, cuando creció en oscuridad sólo produjo 1,8 y 1,6 veces más clorofila y carotenoides respectivamente, comparadas con las mantenidas a 35 ppm (figura 5).

Figura 5. Influencia de la salinidad (ppm) sobre la producción de clorofila (pg.cel-1) en cultivos axénicos y no axénicos de la microalga Chlorella sorokiniana.

El análisis estadístico demostró que hubo diferencia significativa (P<0,05) en cuanto a clorofila, entre los cultivos a 35 ppm y los controles (cuadro 4). Para los carotenoides también se obtuvieron diferencias significativas (P<0,05) entre el control y los cultivos a 15 y 25 ppm. Esto se debió quizás a la presencia de sales de Mg, Ca, S04 y Fe en el agua de mar, con lo cual se logró una mayor disponibilidad de nutrientes para mejorar la producción de biomasa y de clorofila en microalgas como Chlorella.

En ambas condiciones de cultivos, la relación clorofila/carotenoides disminuyó con la salinidad (cuadro 3). El incremento de la salinidad estimuló la síntesis de carotenoides por efecto de estrés salino, de tal manera que aumentó la proporción de moléculas de estos pigmentos en relación a las de clorofila.

Aunque estos resultados sugirieron que la microalga fue sensible a la salinidad en su hábitat natural, en condiciones axénicas fue capaz de mantener un elevado crecimiento en un medio de cultivo enriquecido y hasta salinidades de 35 ppm. Se desconoce la razón por la cual las células toleran más la salinidad bajo iluminación que en oscuridad cuando crecieron en medio organotrófico.

Temperatura. En cultivos no axénicos la microalga creció a todas las temperaturas estudiadas, con un óptimo a 30°C. Sin embargo, a 37°C el crecimiento disminuyó en un 25,4% en relación a la temperatura óptima (figura 6). Las elevadas densidades celulares producidas entre 25 y 35ºC, indicaron la adaptación de esta microalga a cuerpos de aguas tropicales. Por lo tanto, esta cepa de Chlorella puede desarrollarse eficientemente en cultivos abiertos en nuestras zonas tropicales (26).

Cuadro 3. Relación clorofila/carotenoides en cultivos axénicos y no axénicos de la microalga Chlorella sorokiniana en función de la salinidad.
 

NC: No hubo crecimiento

En cultivos axénicos, Chlorella manifiestó un excelente crecimiento entre 25 y 42°C, con un óptimo a 37ºC. En condiciones mixotróficas se alcanzó el mayor crecimiento a 37ºC, el cual fue de 2 y 15 veces superior al obtenido en cultivos heterotróficos y autotróficos, respectivamente. De igual manera, a 40ºC y 42°C, la microalga exhibió un crecimiento elevado con 72,62±0,75 y 58,79±0,04 x106 cel.ml-1, mientras que en cultivos autotróficos la microalga sólo toleró temperaturas hasta de 37ºC, aunque el crecimiento fue siempre menor en relación a mixotrofía y heterotrofía (figura 6). Esto fue debido a que las microalgas en cultivos no axénicos, requirieron de nutrientes adicionales derivados de la flora bacteriana asociada. En este sentido, que su crecimiento no fue estimulado cuando estuvo libre de bacterias.

Estos resultados encontrados en relación a la temperatura coinciden con los reportados en cultivos axénicos de la microalga Tetraselmis suecica, donde también se produjo un bajo crecimiento en condiciones autotróficas, en ausencia de sustancias orgánicas (18).

Los resultados indicaron que esta cepa de Chlorella fue capaz de crecer a elevadas temperaturas entre 37 y 42ºC. Esta característica, además de la tolerancia a pH ácidos y elevada salinidad, también permitió ubicar a esta cepa en la especie C. Sorokiniana (17, 19, 38 y 39). En cultivos no axénicos de Chlorella vulgaris se ha reportado una temperatura óptima para su crecimiento de 32,4ºC (20 y 30). Sin embargo, el comportamiento de las microalgas en condiciones axénicas y unialgales en relación a la temperatura pueden variar, ya que en cultivos no axénicos de la especie de Chlorella estudiada, se obtuvo una temperatura óptima de 30ºC (resultados no reportados).

Es importante destacar que la elevada productividad de ciertas microalgas en condiciones mixotróficas está relacionada con la utilización simultánea y eficiente de compuestos orgánicos y de CO2 como fuente de carbono, y de luz como fuente de energía, de tal manera que la producción de biomasa fue incrementada respecto a cultivos heterotróficos o autotróficos (6 y 34).

Figura 6. Influencia de la temperatura en el crecimiento. (x106 cel.ml-1) de la microalga Chlorella sorokiniana, en condición axénica y no axénica.

Los cultivos axénicos de microalgas constituyen los de mayor rigidez científica; puesto que aportan resultados directos producto de diversos factores ambientales sobre su crecimiento, fisiología o bioquímica. Es así como, estos cultivos son necesarios para estudios taxonómicos (38), remoción de metales (2), biotransformación (29). En este caso, Chlorella sorokiniana en condiciones axénicas presentó características diferenciales con respecto a su comportamiento en presencia de su flora bacteriana asociada.

Conclusiones

La respuesta de la microalga Chlorella sorokiniana al pH, salinidad y temperatura, varió en función de la presencia o ausencia de su flora bacteriana acompañante. En condiciones no axénicas sólo fue capaz de crecer satisfactoriamente a pH entre 6 y 9, optimizar su densidad celular a 30ºC y crecer en ausencia de salinidad.

En condiciones axénicas cambió su respuesta de tolerancia a pH ácidos; a temperaturas de hasta 42ºC y de salinidades de 25 ppm.

Este comportamiento sugiere que la respuesta fisiológica de la microalga ante el ambiente natural, fue modificada cuando eximió la relación con sus bacterias asociadas. Además, la mixotrofía demostró ser la condición más adecuada que favoreció el crecimiento de la microalga frente a cambios ambientales.

Por lo tanto, esta microalga autóctona, bajo condiciones axénicas presenta un gran potencial biotecnológico por su capacidad de crecimiento en cultivos mixotróficos y heterotróficos en presencia de nutrientes orgánicos y a un intervalo de pH muy amplio. Esto puede servir como alternativa a la condición autotrófica de crecimiento para la producción de biomasa a elevadas temperaturas, con lo cual puede inducirse la producción de enzimas, de proteínas o de compuestos con actividad biológica con fines farmacológicos.

Agradecimientos

Los autores agradecen al FONACIT por el apoyo financiero através del proyecto S1-2000000786.

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1Autor de correspondencia email: everm@iamnet.com