Identificación de virus que se transmiten a través de semillas de caraota (Phaseolus vulgaris L.) y fríjol (Vigna unguiculata (L.) Walpers) en áreas productoras de Venezuela

Identification of seed borne viruses in growing areas of beans (Phaseolus vulgaris L.) and cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walpers) in Venezuela

Z. Peña y G. Trujillo

Autor para correspondencia email: zpeña@inia.gov.ve
Barquisimeto, Edo. Lara. INIA Lara. Apdo. 592.

Resumen

Para conocer la incidencia de virus que se transmiten a través de la semilla en áreas productoras de caraota y fríjol, se evaluaron 53 materiales usados como semilla. Se seleccionaron aislamientos virales provenientes de las semillas sembradas en umbráculo protegido contra insectos; identificándose los aislamientos virales de caraota como: "Colombiana 1", "Colombiana 2" y "Tucutunemo" y el de fríjol como "Ojo negro". Para este estudio se multiplicó el material, se realizaron las pruebas de estabilidad en savia, se estudió la transmisión a través de insectos, se estudió el rango de hospedantes, microscopía electrónica y se realizaron pruebas serológicas con los antisueros disponibles. En tres aislamientos virales de caraota se identificó, el virus del mosaico sureño de la caraota (BSMV) en muestra del Valle de Tucutunemo, estado Aragua, en un material procedente de Colombia colectado en Sanare, estado Lara, se detectó infección viral simple con el BSMV y doble el BSMV y el virus del mosaico común de la caraota (BCMV) . En fríjol se identificó el virus del mosaico severo del frijol (CpSMV) a partir de semilla de los estados Portuguesa y Falcón. Con este estudio se ratifica la necesidad del control fitosanitario para la exclusión de materiales nacionales o importados no aptos para la siembra y se corrobora la importancia de la certificación de semillas.

Palabras clave: virus, transmisión por semilla, incidencia, identificación, leguminosas

Abstract

With the purpose of knowing the incidence of seed borne viruses in production areas of beans and cowpea, 53 materials used as seed were evaluated. Viral isolations coming from seeds sowed in shelter protected against insects; being identified the beans isolations like: "Colombian 1", "Colombian 2" and "Tucutunemo"; and those of cowpea like "Black Eye", were selected. Material was multiplied, stability test in sap were carried out, vector transmission was studied, the hosts range was determined, serological tests with the available antibody were carried out. In three viral isolations of beans, the bean southern mosaic virus (BSMV) was identified in a sample of Tucutunemo Valley, Aragua state. In the material coming from Colombia collected in Sanare, Lara state, it was detected simple viral infection BSMV and double infection BSMV and bean common mosaic virus (BCMV). In cowpea, it was identified the cowpea severe mosaic virus (CpSMV) from seed of Portuguese and Falcon states. Through this essay was corroborated the necessity of establishing a phytopathological control, for the exclusion of national or imported seed materials not suitable for sows, and also the importance of seed certification.

Key words: virus, seed borne viruses, incidence, identification, leguminous

Recibido el 11-3-2004 l Aceptado el 15-2-2006

Introducción

En el rubro fabáceas el aspecto sanidad de la semilla ha sido señalado como una limitante del rendimiento, condición que le impide colocarse entre los renglones de rubros competitivos a nivel nacional (17). Cerca de uno de cada siete virus de plantas que existen son transmitidos a través de la semilla (22). Los virus llevados en la semilla constituyen una de las fuentes de inoculo primario que permiten la presencia de virosis desde muy temprano en los cultivos de caraota y fríjol, considerándose al: virus del mosaico común de la caraota (Bean common mosaic virus, BCMV) y el virus del mosaico del fríjol ojo negro (Blackeye cowpea mosaic virus, BeCpMV) pertenecientes al grupo Potyvirus, virus del mosaico sureño de la caraota (Bean southern mosaic virus, BSMV) grupo Sobemovirus, virus del mosaico severo del fríjol (Cowpea severe mosaic virus, CpSMV) grupo Comovirus, virus del mosaico del pepino (Cucumber mosaic virus, CMV) grupo Cucumovirus (3), virus del mosaico de la alfalfa (Alfalfa mosaic virus, AMV) (23) entre otros; como los de mayor importancia por esta forma de transmisión. Las pérdidas por ejemplo, causadas por el BCMV pueden variar entre 53 al 96% (10). De los 70 o más virus que afectan al cultivo de la caraota, siete se transmiten por la semilla (8); y existen por lo menos unos 15 virus que pueden ser transmitidos en cultivos sucesivos de fríjol a través de lotes de semilla infectada; particularmente semillas cuya calidad fitosanitaria ha sido descuidada (14).

La importancia del estudio de este tipo de transmisión radica en que las semillas constituyen un eficiente medio para la transferencia de microorganismos fitopatógenos. Además, más del 50% de las enfermedades importantes en caraota se pueden transmitir por semilla (10, 12). Los agricultores tienen que cambiar cada cierto tiempo sus cultivares debido a la "degeneración" de la semilla, lo que esta ligado a la transmisión de los virus BCMV y el virus del mosaico común necrótico de la caraota (BCMNV) por la semilla (7). Por la relevancia que tiene esta forma de transmisión en los procesos epidemiológicos se plantea el siguiente trabajo de investigación para conocer la incidencia de los virus que se transmiten a través de semilla de caraota y fríjol provenientes de diferentes áreas productoras del país.

Materiales y métodos

En el laboratorio de Virología Vegetal, en la Facultad de Agronomía de la Universidad Central de Venezuela, se llevo a cabo la evaluación de 53 materiales usados como semilla para conocer la incidencia de virus que se transmiten a través de semilla de las principales áreas productoras de caraota y fríjol. Fueron seleccionados 4 aislamientos virales de todos los materiales provenientes de semillas sembradas en umbráculo protegido contra insectos, para ser identificados plenamente, y por presentar los síntomas identificados en la población estudiada. Los aislamientos virales se identificaron como: "Colombiana 1", "Colombiana 2", "Tucutunemo" y "Ojo negro", proveniente los tres primeros de caraota y el último de semillas de fríjol respectivamente. Para el estudio: a) se multiplicó el material; b) se realizaron las pruebas de estabilidad en savia; c) se realizaron los estudios de transmisión a través de insectos con áfidos y coleópteros; d) se comprobó el rango de hospedantes y; e) se observó a través de microscopia electrónica y se realizaron pruebas serológicas con los antisueros disponibles en el laboratorio de Virología Vegetal de la Facultad de Agronomía, de la Universidad Central de Venezuela.

Reproducción de los síntomas virales. Se empleó la metodología de French y Hebert (11) con el fin de lograr la multiplicación de los síntomas virales, inoculando con jugo crudo de planta enferma un lote de 48 plantas sanas de 7 días de edad de la misma variedad, que crecieron en potes, a razón de tres plantas por pote y para su mantenimiento se realizaron dos riegos diarios cuando fue necesario, cada 8 días se hicieron aspersiones con abono foliar líquido (Nitrofoska foliar) y con una mezcla de insecticida, acaricida y fungicida. Para obtener el jugo crudo se tomó tejido enfermo preferiblemente de las hojas jóvenes, se pesó y, se cortó finamente; luego se maceró en un mortero frío esterilizado, en presencia de buffer fosfato de potasio, a pH 7,5 y 0,1 M en proporción de 1:4 (p/v). Las plantas con solo hojas primarias, fueron espolvoreadas con el abrasivo carborundo 600, y con la punta del dedo índice impregnado con el inoculo se realizaron frotamientos suaves en toda el área de la hoja primaria; luego, con una piseta con agua destilada se rociaron las hojas inoculadas, a fin de eliminar los excesos o restos del inoculo. Se dejaron 5 plantas control inoculadas de la misma forma con agua destilada.

Las inoculaciones se realizaron a partir de las cuatro de la tarde, a una temperatura de 22ºC, en estas condiciones las plantas inoculadas se mantenían por 24 horas; luego pasaban al umbráculo (26,4°C de temperatura y 77,6% de humedad relativa) hasta observar la aparición de síntomas virales que fueron evaluados a los 5, 10 y 15 días.

Aislamiento del virus. Con la finalidad de obtener material para ser empleado como aislamiento viral, se procedió a inocular un lote de 10 plantas sanas de cada variedad de caraota (`Tenerife', `Montalbán', `Tacarigua', `Magdaleno') y de fríjol (`Apure', `Orituco', `Tuy'). que fuese fácil de cultivar, que en corto tiempo produjera síntomas virales bien definidos para medir la infectividad.

Determinación de las propiedades biológicas para cada uno de los aislamientos virales

Pruebas de estabilidad en savia. Para determinar las propiedades físicas del jugo crudo de plantas enfermas se realizaron las pruebas: Punto Final de Dilución (PFD), Punto de Inactivación Térmica (PIT) y Longevidad In Vitro (LIV), utilizando la metodología descrita por French y Hebert (11). En cada una de las pruebas se utilizaron plantas sanas de caraota de la variedad Tacarigua para los aislamientos "Colombiana 1", "Colombiana 2" y "Tucutunemo", mientras que se utilizó fríjol de la variedad Tuy para el aislamiento "Ojo Negro". En la realización de estas tres pruebas se utilizó jugo crudo de tejido foliar de plantas inoculadas con cada uno de los aislamientos; macerando en un mortero frío, estéril y en presencia de buffer fosfato de potasio, a pH 7,5 y 0,1 M en proporción de 1:4 (p/v). Se filtró a través de gasa estéril. Estas pruebas se repitieron para confirmar los resultados obtenidos y se describen a continuación:

Punto Final de Dilución (PFD). En nueve tubos de 7,5 cm de largo, con 0,1 cm de espesor y 1 cm de diámetro, previamente esterilizados se le agregó nueve mililitros de agua destilada por tubo; luego al primer tubo se le adicionó un mililitro de jugo crudo y se rotuló como el tubo con dilución 10^-1, se agitó y se tomó con una pipeta estéril un mililitro de la dilución rotulada como 10^-1 y se añadió al tubo de dilución 10^-2, desechando esa pipeta, siguiendo igual procedimiento para el resto de los tubos con las diluciones: 10^-3, 10^-4, 10^-5 hasta la 10^-9; Luego se procedió a inocular tres plantas por pote, por dilución, y de igual forma se inocularon tres plantas con jugo crudo sin diluir y tres con agua destilada estéril como control. Para la inoculación de las plantas se comenzó con la dilución 10^-9 hasta llegar al jugo crudo puro, previa aplicación de Carborundo 600 y con la precaución de lavar el exceso de inóculo y carborundo, al igual que, las manos entre cada inoculación.

Punto de Inactivación Térmica (PIT). Se evaluó la siguiente serie de temperaturas: 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C, 90°C y 95°C. A los tubos utilizados se les agregó un mililitro de jugo crudo. Cada tubo se introdujo en un baño de María, por espacio de 10 minutos, luego se procedió a enfriar el jugo rápidamente en agua de chorro y se inocularon tres plantas por pote, por temperatura de igual forma se inocularon tres plantas con jugo crudo a temperatura ambiental y tres con agua destilada estéril, como control.

Longevidad In Vitro (LIV). Se obtuvo jugo crudo de tejido foliar de plantas inoculadas con cada uno de los aislamientos; macerando las hojas en un mortero frío, estéril y en presencia de buffer fosfato de potasio, a pH 7,5 y 0,1 M en proporción de 1:4 (p/v). Se filtró a través de gasa estéril, luego se inoculó con jugo crudo tres plantas por pote, por cada intervalo de tiempo (0, 24, 32, 48 y 72 horas) que el jugo crudo fue dejado a temperatura ambiente y protegido. Previamente al jugo crudo se le agregó 0,1 mL de merthiolate, a fin de evitar la presencia de agentes contaminantes.

Transmisión mediante insectos

Transmisión por áfidos. Aplicando la metodología descrita por French y Hebert (11) se utilizó áfidos provenientes de crías sanas de la especie Myzus persicae (Sulzer), familia Aphididae, subfamilia Aphidinae (identificados en el Instituto de Zoología Agrícola de la UCV) que fueron mantenidas sobre plantas sanas de fríjol de la variedad Orituco en una jaula protegida de insectos; los áfidos fueron tomados con un pincel fino humedecido y colocados en una placa de petri que contenía papel de filtro humedecido, y por espacio de 60 min. se sometieron los áfidos al ayuno; luego se les permitió un periodo para la adquisición del virus, para ello fueron introducidos en una placa de petri trozos de tejido de hojas enfermas tomados del material infectado con el virus, previamente identificado. Los áfidos se colocaron en contacto con el tejido enfermo por espacio de diez min.; luego, con la ayuda de un pincel, se colectaron y se transfirieron a las plantas sanas, colocando seis áfidos por planta. Transcurridos 120 min., se retiraron los áfidos de las plantas con la aplicación de un insecticida y las plantas se trasladaron al umbráculo para posterior observación de los síntomas.

Transmisión por coleópteros. Se colectaron en siembras de caraota en el campo experimental del INIA (Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas de Maracay, Edo. Aragua), coleópteros de la especie Andrector arcuatus (Oliver) familia Crisomelidae, subfamilia Galerucinae (identificados en el Instituto de Zoología Agrícola de la UCV); los coleópteros se colocaron en envases de vidrio tapados con tela de organza sujeta con cintas elásticas; se alimentaron con hojas sanas de caraota por espacio de dos días, con la finalidad de limpiar los coleópteros de algún virus que pudiese estar en el campo donde fueron colectados. Una vez transcurrido este tiempo se procedió a colocar los coleópteros sobre tres plantas sanas de nueve días de edad, como control de la prueba, se alimentaron durante 24 horas; luego se formaron cuatro lotes de seis coleópteros por frascos de vidrio que contenían hojas enfermas tomadas de plantas previamente inoculadas con cada uno de los aislamientos virales, y se sometieron a un periodo de alimentación de 24 horas para la adquisición del virus; transcurrido ese tiempo los coleópteros se transfirieron a plantas sanas de caraota o fríjol dependiendo del aislamiento viral que se deseaba transmitir, dos coleópteroslplanta^-1 sana, tres repeticiones por aislamiento viral, se dejaron alimentar por 24 h. Una vez transferidos los coleópteros a las plantas para su alimentación se cubrieron con una cámara plástica aislante diseñada para este tipo de inoculación. Al finalizar el periodo de alimentación o de inoculación del virus, los insectos fueron eliminados, y las plantas se llevaron al umbráculo para evaluar síntomas a los 5, 15 y 30 días. En aquellas plantas que manifestaron síntomas virales, la presencia de virus se comprobó mediante la prueba de recuperación del virus mediante inoculación mecánica, utilizándose para estas pruebas plantas sanas de caraota de la variedad Tacarigua para los aislamientos de caraota "Colombiana 1", "Colombiana 2" y "Tucutunemo", mientras que se utilizó fríjol de la variedad Tuy para el aislamiento de fríjol "Ojo Negro".

Evaluación de los hospedantes diferenciales. En la búsqueda de un buen hospedante para hacer despistajes rápidos se evaluó las especies de hospedantes diferenciales propuestos por Hampton y colaboradores (13) y Boswell y Gibbs (2). Fueron evaluadas plantas indicadoras de las familias: Amarantáceas (Gomphrena globosa L.), Quenopodiáceas (Chenopodium amaranthicolor Coste & Reyn, Ch. quinoa Willd. y Ch. album L.), Cucurbitáceas (Cucumis sativus L. y C. Pepo L.) y Solanáceas (Nicotiana tabacum L., N. glutinosa L., Datura stramonium L. y D. metel L.).

Pruebas serológicas. Para la realización de esta prueba existen agares especiales para serología, en nuestro caso fue utilizado agar noble a razón de 0,85 g que fue disuelto en 100 mL de agua destilada estéril; para evitar la acción de contaminantes se añadió 3 mL de azida de sodio, que se preparó a parte, agregando 0,25 g por cada 100 mL de agua destilada estéril; que se mezclaron con 97 mL de agar líquido en una fiola, el contenido de esta fiola se dividió en dos partes iguales, y a una de esas partes se le agregó 0,5% de sulfato dodecil de sodio (sodium dodecyl sulfate, SDS), y se llevó al autoclave. El SDS es un detergente aniónico usado con la finalidad de lograr el fraccionamiento del virus, en el caso de que se trate de virus flexuosos (5). Se procedió a vaciar el agar líquido en las cajas de petri, al solidificar se procedió a abrir celdas de cinco milímetros de diámetro; en el centro se abrió una celda para el antisuero y a su alrededor seis celdas equidistantes a las muestras a identificar, formando un círculo alrededor de la celda central de unos 2,5 cm. Para esta prueba se utilizó el antisuero del SBMV y el antisuero CpSMV del laboratorio de Virologia Vegetal de la Universidad Central de Venezuela, Facultad de Agronomía. Se realizaron observaciones a las 24 y 48 horas.

Microscopía electrónica. Aplicando la metodología de tinción negativa se colocó una gota de la suspensión viral a examinar diluida sobre una rejilla de cobre, que previamente se cubrió con una película muy delgada de nitrocelulosa (colodión) junto con carbón evaporado; se esperó por espacio de un minuto y luego, con un papel de filtro estéril, se limpió el exceso de líquido que estaba sobre la rejilla y se procedió a teñir con acetato de uranilo, después de dos minutos se retiró el exceso de acetato de uranilo con papel de filtro, las rejillas se observaron a través del microscopio de transmisión 30000x (Hitachi H-300) del INIA; para determinar la forma y tamaño de las partículas virales en estudio (6).

Resultados y discusión

Las diversas sintomatologías virales desarrolladas en las muestras estudiadas se agruparon en cuatro aislamientos virales representativos de la sintomatología general observada, y que a su vez, involucraron las áreas productoras de caraota y fríjol de interés. La selección de solo cuatro aislamientos obedece al tiempo y espacio necesario requerido para estudiar en forma precisa cada una las muestras.

Aislamientos provenientes de caraota

"Colombiana 1".

Aislamiento del virus. La multiplicación del virus en caraota de la variedad Tacarigua, fue eficiente permitiendo el mantenimiento y disponibilidad en material vivo durante la investigación; el comportamiento de esta variedad confirma lo señalado en estudios anteriores (18, 21).

Determinación de las propiedades biológicas del aislamiento.

Pruebas de estabilidad en savia. Al determinar las propiedades físicas del jugo crudo de plantas inoculadas con el aislamiento "Colombiana 1", El PIT resultó en 85°C en 10 min. este valor se encuentra en un rango aceptable para el SBMV, en descripciones anteriores se señalan valores de 85°C y de hasta 95°C (3; 4). En relación al PFD este estuvo entre 10^-5 y 10^-6, coincide con lo señalado para el SBMV (8), aunque Lamptey y Hamilton indican que la dilución final es en 10^-7 (16); La LIV fue de 168 horas a temperatura ambiente, existen numerosos reportes para el SBMV, señalando que éste se mantiene infectivo hasta por más de tres meses a temperatura ambiente (24).

Transmisión a través de insectos. El aislamiento "Colombiana 1" fue transmitido mecánicamente y a través del coleóptero A. arcuatus señalado en Venezuela como vector del SBMV (21).

Evaluación de los hospedantes diferenciales. Los síntomas observados durante la evaluación de la gama de hospedantes diferenciales coinciden con los descritos para el SBMV (3, 15, 24) (cuadro 1).

Las especies que no reaccionaron al ser inoculadas fueron: Chenopodium amaranthicolor, Ch. quinoa, Ch. album, Cucumis sativus, C. pepo, Nicotiana tabacum, N. glutinosa, Datura stramonium, D. metel, coincidiendo con lo señalado en caracterizaciones previas (2, 4, 8). Es de resaltar que Gomphrena globosa, no reaccionó (8); aunque ha sido reportada como la especie, no leguminosa, susceptible al virus (24).

Microscopía electrónica y pruebas serológicas. Se observó partículas virales de forma isométrica, por la forma de las partículas virales y en la prueba de inmunodifusión en agar la reacción de identidad frente al antisuero SBMV reafirman que se trata del SBMV (2, 15, 24). (cuadro 2).

"Colombiana 2"

Aislamiento del virus. Al inocular la variedad Tacarigua se observaron lesiones cloróticas de aproximadamente 0,2 mm de diámetro en las hojas primarias y mosaico sistémico en las hojas trifoliadas, enrollamiento y las hojas adquirieron un aspecto grasiento con presencia de ampollas. Esta variedad resulta excelente para la propagación del virus.

Determinación de las propiedades biológicas del aislamiento.

Pruebas de estabilidad en savia. El PIT a los 60°C en 10 min., se encuentra en el rango de 50°C a 65°C, señalado para el grupo BCMV (1, 3); El PFD coincidió con el alcanzado para el BCMV en diferentes estudios (10^-3-10^-4); En cuanto a la LIV fue de 24 horas, valor que se encuentra dentro del rango señalado para el BCMV (1, 2).

Transmisión a través de insectos. Se logró transmitir el virus a través del áfido M. persicae con un bajo porcentaje de transmisión; esto corrobora que este áfido transmite el virus en forma no persistente (18, 19) y que el porcentaje de transmisión puede ser variable, de acuerdo a la variedad empleada (20).

Evaluación de los hospedantes diferenciales. Durante la evaluación de la gama de hospederos diferenciales las especies que mostraron síntomas fueron: C. amaranthicolor y en C. quinoa. desarrollando lesiones locales cloróticas, que luego se necrosaron y rodearon de un halo amarillento; no se observaron síntomas sistémicos. La sintomatología desarrollada ha sido descrita para estas especies con anterioridad (1, 2, 3).

Cuadro 1. Reacción de hospedantes diferenciales ante los cuatro aislamientos virales.

Table 1. Differentials host reactions to four viral isolations.
 

Ns: No hubo síntomas;
Ss: síntomas sistémicos: mosaicos, ampollas;
Llc: Lesiones locales cloróticas;
Lln: Lesiones locales cloróticas que se vuelven necróticas, no presentan otros síntomas.

Microscopía electrónica y pruebas serológicas. Se observaron partículas virales de 722 nm de largo, de forma flexuosas o filamentosas, algunas con apariencia trucadas y agregadas. Las pruebas de inmunodifusión en agar entre el antígeno y los antisueros disponibles resultaron negativas (cuadro 2).

Cuadro 2. Propiedades biológicas, transmisión por insectos, serología y forma de la partícula de los cuatro aislamientos virales.

Table 2. Biological properties, insects transmission, serology and particle form of the four viral isolations.
 

Todo lo anterior coincide con lo descrito para el grupo del BCMV, que incluye los virus: Azuki bean mosaic virus, Blackeye cowpea mosaic virus, Cowpea (aphid-borne) mosaic virus, Cowpea vein-banding mosaic virus, Peanut blotch virus, Peanut stripe virus y algunos aislamientos en soya, además se distinguen varias razas de este virus (3).

"Tucutunemo".

Aislamiento del virus. Al inocular plantas sanas de P. vulgaris var. Tacarigua se observó un mosaico, donde se alternan tonalidades bien marcadas de verde claro y oscuro, a los pocos días, después que aparece el mosaico las hojas afectadas tienden a sufrir un estrechamiento con alargamiento y con la presencia de ampollas en la lámina foliar, los tallos son tan delgados que se produce un retorcimiento, lo que ocasiona la disminución del tamaño de las plantas. Esta variedad permite propagar el virus eficientemente.

Determinación de las propiedades biológicas del aislamiento.

Pruebas de estabilidad en savia. Se pudo constatar que este virus se inactivó a temperaturas por encima de los 90°C, la dilución máxima en la cual todavía se mantenía infectivo estuvo entre los 10⁴ y 10^-6 en las pruebas realizadas, además el virus en extracto crudo de savia a temperatura ambiente de 22°C, fue infectivo durante un periodo de 144 horas, coincidiendo con lo reportado para el SBMV (4, 8, 16).

Transmisión a través de insectos. El virus se logró transmitir mecánicamente y a través de coleópteros identificados como de la especie Andrector arcuatus (Oliver); realizándose la transmisión con un 33,33% de eficiencia (cuadro 2); la transmisión a través de áfidos fue negativa.

Evaluación de los hospedantes diferenciales Al inocular los hospedantes diferenciales, las especies que mostraron síntomas fueron Pisum sativum y Pisum lunatus. Las plantas de Pisum sativum inoculadas con el aislamiento se tornaron cloróticas, sobre todo las nervaduras de las hojas, luego la infección se hace sistémica, coincidiendo la sintomatología con la descrita por otros autores para esta especie (3); aunque también es señalada como hospedante susceptible, aunque no describe los síntomas (4). Mientras que, en las plantas de Pisum lunatus inoculadas aparecieron a los cinco días lesiones locales que luego al necrosarse se rodearon de un halo amarillo; no hubo manifestación de síntomas sistémicos, como ha sido reportado (24), sin embargo, esta especie ha sido señalada como inmune al BSMV (8).

Microscopía electrónica y pruebas serológicas. Fueron observadas numerosas partículas virales de aproximadamente unos 26,72 nm de diámetro y de forma isométrica, algunas de apariencia vacía y otras se observan llenas. En la prueba de inmunodifusión en agar, ocurrió una reacción de identidad al formarse una banda de precipitación bien definida entre el antígeno (aislamiento "Tucutunemo") y el antisuero contra el SBMV que reafirma que se trata del virus del mosaico sureño de la caraota (2, 15, 24).

Aislamiento proveniente de fríjol.

Ojo Negro.

Aislamiento del virus. Se confirmó que el virus se multiplica y mantiene eficientemente en la variedad Tuy (9), confirmándose las bondades de la variedad para la propagación y mantenimiento del virus.

Determinación de las propiedades biológicas del aislamiento.

Prueba estabilidad en savia.

Evaluación de los hospedantes diferenciales. Las especies que mostraron síntomas fueron: Chenopodium amaranthicolor, C. Quinoa, Nicotiana tabacum, N. Glutinosa, Gomphrena globosa, Phaseolus lunatus y Canavalia ensiformis. las hojas inoculadas a los cinco días presentaron lesiones locales cloróticas de aproximadamente un mm de diámetro, que luego se volvieron necróticas, no se observaron síntomas sistémicos, coincidiendo con otros autores (2, 3). Chenopodium album, no reaccionó aunque ha sido señalada susceptible al virus (2, 3).

Datura stramonium, Pisum sativum y Dolichus lablad desarrollaron lesiones cloróticas; Vigna radiata y Cajanus cajan desarrollaron mosaico y ampollamiento; el virus no infecto al grupo de leguminosas: Arachis hypogaea, Cicer arientum, Vicia faba, Lens culinaris; otras especies que no reaccionaron al ser inoculadas fueron: Cucumis sativus, C. pepo y Datura metel, coincidiendo con lo descrito para estas especies (2).

Microscopía electrónica y pruebas serológicas. Se observó una alta concentración de partículas virales poliédricas de unos 27,27 nm. de diámetro, de forma isométrica, mostrando algunas una apariencia vacía y agregación entre las partículas virales. En la prueba de inmunodifusión en agar frente al antisuero CpSMV la reacción resulto positiva. Todo lo anteriormente señalado, indica que se trata del CpSMV (3, 25); identificado por primera vez en el país en los valles del estado Aragua (9).

El PIT a los 65°C en 10 min. coinciden con lo señalado en caracterizaciones previas del CpSMV y que el valor del PIT se encuentra entre 65° y 70°C. El PFD entre 10^-4 y 10^-5 coincidió con los rangos señalados por varios autores (2, 3). La LIV fue de 4 días, se cree que influyeron tanto el cultivar empleado en la prueba como las condiciones ambientales; existen reportes de LIV de cinco días para caraota de la variedad Pinto; otros autores señalan que el virus puede permanecer infectivo de 3 a 5 días dependiendo de las condiciones ambientales (3, 25).

Transmisión a través de insectos. El virus fue transmitido por A. arcuatus reportado como vector del CpSMV (2, 3, 9).

Conclusiones

De los cuatro aislamientos representativos de la sintomatología viral estudiada, tres aislamientos virales provenían de caraota, se identifica el BSMV en dos de estos aislamientos; el primero proviene de una muestra del valle de Tucutunemo en el estado Aragua, mientras que el segundo, en un material de caraota negra procedente de Colombia colectado en Sanare, estado Lara, tomándose este hecho, como el primer reporte en el estado Lara.

En cuanto al cuarto aislamiento, se identificó en fríjol al CpSMV a partir de semilla de los estados Portuguesa y Falcón.

La presencia de los virus BSMV, BCMV y CpSMV en nuevas áreas productoras indican su diseminación en el país.

Se ratifica la necesidad, con respecto a las virosis, de un mayor control de la pureza en la semilla para la siembra y se corrobora la importancia de la certificación de semilla y de este tipo de transmisión de virus.

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