Estudio del grano de polen en especies del genero Heliconia L. bajo el microscopio óptico

Pollen grain study in species of the Heliconia L. genus under optical microscope

M.E. Sanabria¹, N. Maciel¹, L.J. Cumana² y R.E. Delgado²V

Autor para correspondencia e-mail: mesanabria@ucla,edu,ve
¹Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado", Postgrados de Agronomía, Barquisimeto, estado Lara.
²Universidad de Oriente, Herbario IRBR, Cumaná, estado Sucre.

Resumen

Los estudios palinológicos de las Zingiberales han tenido la limitante de la fragilidad que presentan las paredes de sus granos de polen. Con el objeto de realizarlos, se propuso la aplicación de los métodos para el tratamiento de dichas estructuras y obtener información sobre las características de los mismos. Las muestras consistieron en 5 anteras maduras separadas de las flores de Heliconia bihai (L.) L.; H. psittacorum L.; H. latispatha Bentham, H. platystachys Baker y H. rostrata Ruiz & Pavón naturales o cultivadas en los estados Sucre y Lara, Venezuela y fijadas antes de la dehiscencia en F.A.A. (75%) o en ácido acético glacial. Los granos de polen se observaron, fotografiaron y midieron en un microscopio Olympus BX40 con aumentos de 50 y 100X. La determinación de la forma se hizo en base a 25 medidas del diámetro ecuatorial (E) y polar (P) de granos seleccionados al azar en corte óptico meridiano y se calculó la relación P/E cuyo resultado se comparó con una tabla de índices establecidos. Los granos de polen de las especies estudiadas resultaron ser subesferoidales, asimétricos y con valores de P/E comprendidos entre 0,75 y 1,33 mm, La exina es microespinulada al igual que la intina, No se observaron diferencias entre los tamaños de los granos de polen provenientes de especimenes cultivados y silvestres y el patrón polínico observado fue semejante en las especies estudiadas.

Palabras clave: Polen, Heliconiaceae, morfología de polen.

Abstract

Zingiberales Palynologic studies have been limited because of the walls fragility of its pollen grain. In order to accomplish these studies, methods applying for these structures treatment was proposed and such a way to get information about its characteristics. Samples consisted on five mature anthers from flowers of Heliconia bihai (L.) L.; H. psittacorum L.; H. latispatha Bentham, H. platystachys Baker and H. rostrata Ruiz & Pavón nature or cultivated at Sucre and Lara states, Venezuela, fixed before dehiscence in F.A.A. (75%) or in glacial acetic acid. Pollen grains were observed, photographed and measured under microscope Olympus BX40 at 50 and 100X augmentations. Form determination was made basing on 25 measurements of equatorial diameter (E) and polar diameter (P) of at random grains in meridian optical cut and P/E relationship was estimated and this result was compared with an established index table. Pollen grains of evaluated species were sub spheroid, asymmetric and with P/E values between 0.75 and 1.33 µm. Exine and intine are micro spinulous. There were not observed differences between the sizes of pollen grains of cultivated and wild species and the polinic pattern observed was similar in the studied species.

Key words: Polen, Heliconiaceae, polen morphology.

Recibido el 11-6-2004 l Aceptado el 15-2-2006

Introducción

Existen aspectos relacionados con la familia Heliconiaceae que requieren ser evaluados, uno de estos es el palinológico, el cual sorpresivamente aún no ha sido estudiado con detalle, por el hecho de que las técnicas tradicionales, son de limitado valor para la determinación de la forma y el tamaño de los frágiles granos de polen de las Zingiberales (5 y 6).

Se han establecido similitudes entre el polen de géneros del orden Zingiberales. En la familia Heliconiaceae han sido descritos como: asimétricos, circulares u oblongos, con la región distal indistinta, la esporodermis radialmente estriada; una estructura ulceroide con granulaciones opacas en la superficie, con la intina transparente, la exina muy delgada y espínulas cortas (3).

Rowley y Skvaria (11) estudiaron la morfología del grano de polen del género Canna y encontraron que la intina y la exina eran muy delgadas y presentaban espínulas aisladas. Esta configuración impide a los palinólogos contar con la acetólisis como una herramienta para la preparación de los granos de polen para su estudio, igual opinión tienen Moncada y Salas (10).

Los granos de polen del género Heliconia L. en general se describen en base a trece especies estudiadas, como radialmente simétricos, heteropolares, de tamaño medio a grande (diámetro mayor: 57,45 a 129,60 mm). En los antecedentes se señala la presencia de una abertura distal simple en estas estructuras; sin embargo, en H. lacletteana y H. laneae, observaron aberturas que parecen ser intermedias entre los tipos monosulcados y bisulcados, constituida por un pseudosulco formado por una invaginación de la exina, que tiene un poro en cada extremo; en otras especies no se observó abertura alguna, como en el caso de H. farinosa donde se presentaron invaginaciones de la exina semejante a los poros por donde irrumpió el tubo polínico (13).

La ultraestructura de la exina de las especies de Heliconia colectadas en Guatemala, Panamá y Perú: H. collinsiana, H. irrasa y H. peru presentaron diferencias entre estas especies, en lo que se refiere a las características de la esporodermis y el protoplasto del grano de polen, las cuales podrían utilizarse para aclarar la taxonomía de estas plantas (7).

Los granos de polen de las especies de Heliconia L. son inaperturados, oblatos o esferoidales en vista ecuatorial y llegando a medir 80 mm, comúnmente espinulosos en la cara distal y con una prolongación de la delgada exina ulceroide la cual funciona como una abertura al momento de generarse el tubo polínico (5, 6 y 7). La arquitectura de la pared celular podría describirse como bizarra, la exina como homogénea y no podría considerarse como lo suficientemente fuerte como para ser la responsable de proteger el protoplasma celular. La intina es estratificada con dos o más capas.

El grano de polen de H. imbricata tiene una morfología única dentro del género; mientras, que los de otras especies son semejantes, como en H. bihai y H. rodriguesia (1). Este autor consideró los granos de polen como heteropolares con un hemisferio distal dominante o discordes, con los hemisferios diferenciados por la presencia de una escultura, y el distal ligeramente espinuloso con una depresión más o menos conspicua.

Los granos de polen de las plantas cultivadas fueron de mayor tamaño que, los de las planta silvestre; sin embargo, no se estableció en que estado de desarrollo fueron evidentes estas diferencias (13).

En esta investigación se estudiaron algunos aspectos de la morfología del grano de polen de cinco especies del género Heliconia L. (H. bihai (L.) L.; H. psittacorum L.; H. latispatha Bentham; H. platystachys Baker y H. rostrata Ruiz & Pavón) localizadas y recolectadas en los estados Sucre y Lara, Venezuela; para lo cual se esta blecieron los tres objetivos siguientes: a) Comparar los métodos establecidos por Erdtman (3), Santos (13); Mello (9) y Kress et al. (5) para el tratamiento de estas estructuras con fines de estudios morfológicos bajo el microscopio óptico; b) Describir los granos de polen utilizando un patrón polínico según Erdtman (2 y 3) y Santos (13) y c) En base a la morfología estudiada, establecer la relación existente entre estas especies y las posibles diferencias entre especimenes cultivados y silvestres.

Materiales y métodos

Las muestras consistieron en cinco anteras maduras separadas de flores de cada una de las especies, las cuales se recolectaron en diferentes localidades de los estados Sucre y Lara, Venezuela; algunas se usaron frescas y otras fueron fijadas antes de la dehiscencia en alcohol etílico 75%; en F,A,A, (formol: alcohol etílico: ácido acético glacial al 75%) ó en ácido acético glacial (50%).

El estudio se realizó en el laboratorio de microtecnia del posgrado de Biología de la Universidad de Oriente, Cumaná, en Cerro del Medio, estado Sucre y en el laboratorio de microtecnia e histopatología vegetal de la Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado" en Tarabana, estado Lara. Una vez en el laboratorio, se extrajeron los granos de polen rompiendo las anteras con la ayuda de agujas de disección. Los mismos se trataron según las metodologías para estudios palinológicos que se describen a continuación; a fin de compararlas:

a. Acetólisis de Erdtman (2).

Se colocaron las anteras completas fijadas previamente dentro de un tubo de centrifugación con ácido acético glacial puro y se centrífugo tres veces a 2000 rpm durante 3 minutos. Se preparó la mezcla acetolítica utilizando para ello ácido acético anhidro y ácido sulfúrico (9:1). Gradualmente se fueron uniendo ambos solutos por las paredes del recipiente. Se incluyó el material vegetal en la mezcla acetolítica recién preparada y se colocó en baño de María, partiendo de frío hasta ebullición por 5 a 10 minutos. Se dejó reposar hasta enfriar y se centrífugo a 2000 rpm por 3 minutos. Se decantó el sobrenadante y el residuo, en el fondo del tubo, se lavó con ácido acético glacial puro y se centrífugo por tres veces a 2000 rpm durante 3 minutos. Se lavó dos veces con agua destilada y se decantó. El material se sometió a un proceso de deshidratación en una batería de alcohol etílico, partiendo de 70 hasta 100%, cada paso con una duración de 3 minutos y decantando los alcoholes con precaución. Se agregó benceno y se dejó reposar por 5 minutos, se centrífugo a 2000 rpm y nuevamente se dejó reposar. Se preparó una mezcla benceno: aceite de silicón (1:1); se colocó el material vegetal en envases pequeños y se le añadió la mezcla. Se dejó reposar por 24 horas, destapado a fin de facilitar la evaporación del benceno. Para las observaciones al microscopio óptico, se colocó una gota del preparado en un portaobjetos, se cubrió con una cubreobjeto y se esperó el tiempo necesario para que se extendiera la muestra de granos de polen.

b. Tratamiento con hidróxido de potasio (KOH) (2).

Se incluyeron las anteras en KOH al 10% y se colocaron en baño de María. La preparación se dejó enfriar y se lavó con agua destilada. El material vegetal se deshidrató pasándolo por una batería de alcohol etílico (70, 95 y 100%), cada paso de 5 minutos. Se centrífugo a 2000 rpm tres veces y por 3 minutos cada vez y decantando cuidadosamente en cada paso. El material vegetal se colocó en benceno por 5 minutos y se decantó. Se cubrió con una mezcla de benceno:silicón en proporción 1:1. Se dejó reposar por 24 horas o hasta que el benceno se evaporó. Para la observación al microscopio óptico (MO), se colocaron gotas del preparado en un portaobjetos, se cubrieron con un cubreobjeto y se esperó el tiempo necesario par que se extendiera la muestra de granos de polen.

c. Saenz (12) y Kress (6 y 7).

Los granos de polen fueron extraídos de las anteras con la ayuda de una aguja de disección, se colocaron en un portaobjeto y se les añadió una gota de xilol puro. Se cubrieron con un cubreobjeto y se sellaron las preparaciones con esmalte para uñas transparente. En caso de que se requirieran preparaciones permanentes, el xilol fue sustituido por bálsamo de Canadá o Permount.

d. Mello Filho (9).

Esta metodología se puede utilizar tanto para anteras frescas, fijadas o tomadas de material herborizado y se recomienda para preparaciones rápidas. El procedimiento consistió en extraer los granos de polen de las anteras, colocarlos en un portaobjetos y añadirles una gota de una mezcla conformada por hidrato de cloral fundido; lactofenol y glicerina 50% (1/3 de cada uno).

Para todas las metodologías los granos de polen se observaron, fotografiaron y midieron con un microscopio óptico (MO) Olympus BX40 con aumentos de 50X y 100X. Para la caracterización de los mismos se utilizó la tabla de índices establecida por Erdtman (2 y 3) y 11. La determinación del tamaño se basó en 25 medidas del diámetro polar (P) y ecuatorial (E) de estas estructuras seleccionadas al azar, en corte óptico meridiano y la aplicación de la relación P/E.

Resultados y discusión

Después de estudiar la morfología de los granos de polen de H. bihai, H. psittacorum, H. latispatha, H. platystachys y H. rostrata mediante las metodologías recomendadas por Erdtman (2 y 3); Santos (13), Mello Filho (9) y Kress (5 y 6), se coincidió con los resultados obtenidos por Rowley y Skavarla (11); Kress et al.(7) y Moncada y Salas (10) en el sentido de que las técnicas palinológicas tradicionales, tales como la acetólisis de Erdtman y la aplicación de KOH, fueron de limitado valor en cuanto al estudio de la forma y el tamaño, por lo frágiles que fueron los granos de polen de Heliconia L. (7,10 y11). Se podría inferir que la exina delgada no resistió la acción de los químicos de la metodología a y b, ya que se observaron al MO más del 80% de los granos de polen destruidos. Los métodos de fijación (alcohol etílico 75%; F.A.A. y ácido acético glacial 50%) resultaron adecuados para la preservación dado que no alteraron la forma de los granos de polen.

Los montajes realizados de acuerdo a la metodología de Saenz (12), Mello (9) y Kress et al. (7) permitieron la observación de granos de polen inaperturados, con una prolongación semejante a la descrita por Kress et al. (7) como "ulceroide" y que a juicio de este mismo autor funciona como una abertura al momento de producir el tubo polínico. La exina se observó delgada y microespinulada (figura 1).

Los valores obtenidos al medir el diámetro ecuatorial (E) y polar (P) en corte meridiano y los resultados del cociente P/E (cuadro 1), permitieron determinar por comparación con la tabla de valores para los índices de Erdtman (2 y 3) y Saenz (12), que los granos de polen pueden ser incluidos en la clase de forma subesferoidales (elipsoides) en las cinco especies estudiadas (rango 0,75 a 1,33 mm).

Figura 1. Granos de polen (gp) subesferoidales (elipsoides) e inaperturados de Heliconia latispatha Benthan (Heliconiaceae) mostrando la delgada exina (ex) microespinulada (mes).

Figure 1. Pollen grains (pg) sub spheroids (ellipsoids) and unopened of Heliconia latispatha Benthan (Heliconiaceae) by showing the thick and micro espinulate exine (mes).

Cuadro 1. Determinación del diámetro ecuatorial (E), polar (P) y de P/E de los granos de polen de cinco especies de Heliconia L. (Heliconiaceae) silvestres (S) o cultivadas (C), recolectados en los estados Sucre y Lara. Unidades micras (mm).

Table 1. Determination of ecuatorial diameter (ED), polar (P) and of P/E of polen grains in five Heliconia L. (Heliconiaceae) wild species (WS) or cultured (C), collected at Sucre and Lara state. Unit micras (mm).
 

A fin de detectar diferencias entre las especies y entre especimenes cultivados y silvestres se compararon los valores de P/E, correspondiendo los más elevados a los de H. platystachys (1,08 mm) y H. latispatha (1,02 mm), ambas recolectadas en los jardines de la ciudad de Cumaná y a H. rostrata (1,05 mm), cultivada en el estado Lara.

No fue posible establecer comparación entre especies en cuanto a P/E debido a que H .latispatha es un espécimen de bosques calientes occidentales y H. platystachys del sur de oriente (8). Los valores más bajos de P/E se presentaron en ejemplares silvestres y cultivados de H. psittacorum (0,83 mm) y de H. bihai, en este último caso resultaron ser muy cercanos (0,87 y 0,86 mm, respectivamente).

A diferencia de lo observado por Kress et al., (7) para H. collinsiana, H. irrasa y H. peru recolectadas en Guatemala, Panamá y Perú, en H. bihai, H. psittacorum; H. latispatha, H. platystachys y H. rostrata no se observaron diferencias en cuanto a la esporodermis del grano de polen.

Conclusiones

Las técnicas acetólisis de Erdtman y la aplicación de KOH no fueron útiles para estudiar la morfología de los granos de polen de Heliconia L.

Los fijadores simples tales como el alcohol etílico 75% y el ácido acético glacial y la mezcla fijadora F.A.A. (75%), resultaron adecuados para preservar los granos de polen de las especies estudiadas.

Los granos de polen fueron inaperturados, con una prolongación "ulceroide" y la exina fue delgada y microespinulada independientemente si provenían de ejemplares silvestres o cultivados y pueden ser incluidos en la clase subesferoidales (elipsoides).

Las observaciones con microscopio óptico no presentaron diferencias en cuanto a la esporodermis de las cinco especies estudiadas, por lo tanto la misma carece de valor para aclarar la taxonomía de estas especies.

Literatura citada

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