Identificación de hongos asociados a enfermedades del fruto de la fresa en el municipio Jáuregui del estado Táchira

Characterization of associate fungi to strawberry fruit diseases at the Jauregui municipality, Tachira State

R.E. Farrera P.¹, A.E. Zambrano V.² y F.A. Ortiz M.³

1INIA Táchira. Centro experimental Bramón.

²INIA Táchira. Estación Local Pueblo Hondo.

³Universidad de Pamplona, Colombia. Microbiología.

Autor de correspondencia e-mail: rfarrera@inia.gob.ve; azambrano@inia.gob.ve; faom81@hotmail.com

Resumen

Para identificar los patógenos causantes de algunas enfermedades en el fruto de la fresa (fragaria x ananassa), se realizaron una serie de muestreos de frutos dañados en las localidades de Pueblo Hondo y Páramo El Rosal del municipio Jáuregui. Se describieron los síntomas, se hicieron aislamientos de los posibles fitopatógenos, se purificaron, se caracterizaron las estructuras y se desarrollaron las pruebas de patogénicidad. De un total de 50 muestras se obtuvieron 13 aislamientos de Colletotrichum sp.; 4 de Botrytis sp. y 1 de Rhizopus sp. Las características morfológicas tales como color y aspecto de colonias y forma de conidios dieron como resultado la identificación de las especies Colletotrichum acutatum, Botrytis cinerea y Rhizopus stolonifer. Los aislamientos se realizaron en PDA y posteriormente replicados para las pruebas de patogénicidad. Se realizaron microcultivos e inoculaciones sobre frutos con una concentración de 1 x 10⁶ conidios/mL para las tres especies identificadas. Las sintomatologías obtenidas fueron similares a las observadas inicialmente y se caracterizaron por manchas acuosas amarillentas y luego necróticas para el caso de Colletotrichum, en donde se destacó la presencia abundante de conidios fusiformes de color salmón. Botrytis se caracterizó por manchas marrones, firmes y la presencia posterior de micelio algodonoso de color gris donde se destacó la presencia de conidios globosos, mientras que en Rhizopus se observó una decoloración inicial y luego la presencia de un micelio de color blanco con puntuaciones negras que correspondieron a la presencia de esporangios y esporangiosporas características de esta especie. Se hicieron los reaislamientos correspondientes y se constataron las especies descritas.

Palabras clave: Fragaria x ananassa, fruto, aislamientos, enfermedades.

Abstract

With the purpose of identifying the pathogens causing diseases in strawberry fruit (fragaria x ananassa), a sampling series of damaged fruits were carried out at Pueblo Hondo and El Rosal of the Jauregui municipality. Symptoms were described, isolations of possible phytopathogen agents were made and purified, the structures were characterized and the pathogenic test was developed. From a total of 50 samples, 13 isolations of Colletotrichum sp., 4 of Botrytis sp. and 1 of Rhizopus sp. were obtained. The morphological characteristics such as colour and colonies aspect and conidia shape, gave as a result the species identification: Colletotrichum acutatum, Botritys cinerea and Rhizopus stolonifer. Isolations were made in PDA and replicates for Pathogenic test. Micro cultures and inoculations on fruits with a concentration of 1x 10⁶ conidia/ml were made for the three identified species. Symptomatologies obtained were similar to those observed initially and they were characterized by yellowish watery spots that become necrotics for the case of Colletotrichum in where stood out the abundant presence of fusiform salmon colour conidia. Botritys was characterized by brown firm spots and the later presence of grey cottony mycelium where stood out the presence of spherical conidia while in Rhizopus an initial fading was observed and then a white mycelium with black points, which correspond to the sporangium and sporangiophores of this specie. The corresponding re isolations was made and species described were verified.

Keys words: Fragaria x ananassa, fruit, Isolations, diseases

Recibido el 1-4-2005  Aceptado el 12-6-2006

La fresa (Fragaria x ananassa Dúchense), es quizás uno los frutos más apetecibles por su exquisito sabor, cultivado en la mayoría de los países templados y muchas áreas tropicales, atemperadas por la altitud (6). En Venezuela, aunque es un cultivo menor, ha representado importantes fuentes de ingresos para los productores ubicados en las zonas altas de las montañas Andinas y la Cordillera de La Costa. Su explotación ha dependido casi totalmente de semillas importadas y la producción subsiguiente de estolones obtenidos de plantas madres.

En el Táchira el Plan de Siembra y Producción Agrícola del Ministerio de Agricultura y Tierras (MAT-Táchira) correspondiente al año 2005, refleja una superficie sembrada de 250 ha con una producción de 6.000 t.ha^-1 (datos no publicados). Sin embargo, la tendencia observada en los últimos años en las plantaciones (observación personal), es una reducción significativa de la producción, debido a ataque de enfermedades de los frutos, lo cual está ocasionando una disminución de la superficie dedicada al cultivo de la fresa.

Varias enfermedades principalmente fungosas han sido detectadas atacando al fruto de la fresa en plantaciones de varios países. Entre las mas importantes se pueden citar el moho gris causado por Botrytis cinerea Pes.ex Fr, la antracnosis, causada por diferentes especies de Colletotrichum spp., la pudrición seca por Rhizoctonia solani Kühn y pudriciones por Rhizopus spp., Mucor spp, Sphaerotheca spp. y Aspergillus spp. (10). La incidencia y severidad de los síntomas van a estar en función de los patógenos prevalentes en una determinada región y de su interacción con los cultivares en uso.

El moho gris y la antracnosis son considerados como las enfermedades más importantes de la fresa. En el caso del moho gris se han reportado pérdidas del 50% o mas de la producción (1) mientras que, para la antracnosis las perdidas han estado entre el 60-75%, pudiendo ser limitante para su cultivo, en virtud de su naturaleza devastadora, la susceptibilidad de los cultivares y la baja eficiencia de medidas de control del problema (1,7). En Venezuela se ha identificado a Colletotrichum acutatum como causante de la antracnosis del fruto de la fresa en el estado Mérida (3). El objetivo del presente trabajo fue identificar y caracterizar los agentes causantes de enfermedades del fruto de la fresa en el municipio de Jáuregui del estado Táchira, Venezuela.

Materiales y métodos

Toma de muestras. Se hizo un recorrido previo por las zonas productoras de fresa del municipio Jáuregui para observar los problemas fitosanitarios. Se realizaron inspecciones de campo en Pueblo Hondo y el Páramo de El Rosal en donde se recolectaron 50 muestras de frutos enfermos entre los meses de abril y septiembre del 2004. Se describieron los síntomas observados y las muestras fueron llevadas al laboratorio para sus respectivos análisis.

Identificación de patógenos. Signos de los posibles patógenos fueron extraídos de la lesiones de los frutos dañados para su observación al microscopio, seguidamente fueron lavados con agua corriente durante 15 min y agua destilada. Se sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio al 0,5% por espacio de 5 min y luego en una de alcohol etílico al 70% para su flameado en el mechero. Cortes de tejidos internos de las lesiones se sembraron en placas de Petri de 9 cm de diámetro conteniendo medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA) e incubadas a 23 ± 2ºC durante 5 días, bajo condiciones de laboratorio y se describió la apariencia y color de las colonias desarrolladas. Cultivos puros de los aislamientos se obtuvieron en tubos de ensayos de 2 x 15 cm con PDA de donde se tomó inóculo para realizar microcultivos. Tanto en las muestras de campo, como en los aislamientos puros y los microcultivos, se caracterizaron las estructuras reproductivas que permitieron la identificación de los agentes patógenos.

Pruebas de patogenicidad. Frutos de fresa en diferentes estadíos de crecimiento de la variedad Camarosa fueron desinfectados superficialmente con alcohol al 70%, durante 1 min, hipoclorito de sodio al 1% durante 3 min y seguidamente lavados con agua destilada estéril. Se colocaron en cajas plásticas de 28 x 16 x 10 cm, sobre toallas de papel humedecidas con agua destilada. En cada caja se colocaron 6 frutos y la inoculación fue efectuada depositándose una gota de 20 µl de la suspensión de esporas sobre heridas realizadas con una aguja desinfectada en cada uno de los frutos. Tres cajas con frutos inoculados y otra sin inoculación, para cada aislamiento, fueron mantenidas en condiciones de laboratorio. Evaluaciones diarias fueron realizadas durante 8 días para describir el desarrollo de los síntomas y las estructuras del patógeno. Reaislamientos de los patógenos fueron realizados para su comparación con los aislados inicialmente.

Resultados y discusión

Las muestras de frutos estudiadas presentaron síntomas característicos de las enfermedades conocidas como antracnosis, moho gris y pudrición blanda. La antracnosis se caracterizó, en frutos semimaduros y maduros, por la presencia de lesiones hundidas, de forma circular o irregular, inicialmente acuosas y posteriormente secas, de color marrón oscuro a negro, en donde se destacan áreas de color salmón, las cuales corresponden a masas de conidios (figura 1). Sobre frutos verdes, se observaron manchas pardas o negras, en la región apical para luego extenderse hasta cubrir todo el fruto, llegando a momificarlo y alcanzar el cáliz y el pecíolo. Síntomas similares han sido reportados por varios autores (1, 3, 5, 7).

Figura 1. Síntomas de fruto de fresa con antracnosis

Los síntomas del moho gris fueron manchas irregulares, difusas, firmes e inicialmente de color amarillento o marrón claro, las cuales ocurren en cualquier parte del fruto, pero especialmente en aquellas que esta en contacto con el suelo u otros frutos enfermos. En estados avanzados los frutos son cubiertos por un micelio de color gris de apariencia filamentosa, (figura 2), características que concuerdan plenamente con las apuntadas por Ellis, 2004 (4) y Howard et al., 1992 (6).

Figura 2. Síntomas de frutos de fresa con moho gris.

Los frutos con pudrición blanda, presentaron una decoloración marrón claro, seguida de un ablandamiento del tejido y una segregación acuosa. Luego, fueron cubiertos por un micelio blanco algodonoso, en donde se destacan puntuaciones negras correspon dientes a los esporangios del patógeno (figura 3). Esta sintomatología, como señala Averre et al. (1) y Mass (7), diferencian esta enfermedad de otras pudriciones.

Figura 3. Fruto de fresa con pudrición blanda.

Los aislamientos del patógeno asociado a los frutos con antracnosis, se caracterizó por la formación de colonias de color blanco, con el centro gris oscuro, donde se destaca la presencia de coloraciones anaranjadas concéntricas tanto en centro como en las márgenes. (figura 4). Conidios lisos, unicelulares, aseptados, fusiformes y de aproximadamente 10-14 x 4- µm (figura 5). Se observó la presencia de apresorios clavados, de color marrón oscuro de 7-12 x 4-6 µm. Estos datos coinciden con los señalados por Cedeño et al. (3), sobre los cultivares de fresa Chandler, Pájaro, Sea Scape y Selva, los cuales corresponden a la especie Colletotrichum acutatum. Esta especie ha sido reportada causando antracnosis de los frutos de fresa en Mississippi, California, Florida y Brasil (6, 10). La forma del conidio, ha permitido distinguir especies de Colletotrichum (3, 4, 9). Sin embargo, debido a la influencia del ambiente sobre la estabilidad morfológica y la existencia de formas intermedias, este criterio no es siempre adecuado para una diferenciación confiable de especies de Colletotrichum (5), más aun si consideramos que en la antracnosis de la fresa pueden estar relacionada con otras especies como C fragarie y C. gloeosporioides (5, 7, 10) Técnicas moleculares como PCR y polimorfismo nuclear de ADN, podrían ser útiles para clasificar o diferenciar estas especies (5, 8).

Figura 4. Colonia de Colletotrichum acutatum en PDA.

Figura 5. Conidios de Colletotrichum acutatum.

Las colonias de moho gris presentaron un micelio blanco, denso, piloso que posteriormente se tornó gris (figura 6). Hifas septadas, hialinas y ramificadas de manera irregular o dicotómica. Conidióforos septados, macronematosos que nacen del micelio sin formar una estructura especializada. El ápice de cada conidióforo finaliza en una ampolla donde se desarrollan conidios, solitarios, unicelulares, lisos, globosos de 10-12 x 6-7 µm, sobre cortas lenticelas (figura 7). Estas características coinciden con las señaladas por Castañeda (2), Mass (7) y Ellis (4), para el hongo Botrytis cinerea Pers. Ex Fr, estado anamórfico de Sclerotinia fuckeliana (de Bary) Fuckel.

Figura 6. Colonia de Botrytis cinerea en PDA

Figura 7. Conidióforos y conidios de Botrytis cinerea.

Las colonias obtenidas de los aislamientos de la pudrición blanda procedentes de frutos en avanzado estado de madurez, mostraron un micelio blanco en los primeros estadìos para luego cambiar a marrón, en donde se destacan puntuaciones negras (figura 8). Hifas típicamente cenocíticas y esporangioforos de color marrón producidos sobre estolones que se adhieren al sustrato por medio de rizoides.

Figura 8. Colonia de Rhizopus stolonifer en PDA.

Estos esporangioforos, de longitud variable (10- 600 mm), se producen en grupos de 3 a 6 y terminan en un esporangio hemisférico (figura 9). Esporangioesporas oscuras, redondeadas de superficie rugosa y de 15 - 20 x 6-9 µm. Las características señaladas son semejantes a las reportadas por Mass (7) para la especie Rhizopus stolonifer (Ehremb.) Vuillemin (formalmente R. Nigricans).

Figura 9. Micelio, esporangióforos y esporangios de Rhizopus stolonifer.

Conclusiones

Las pruebas de patogenicidad desarrolladas en este trabajo corroboraron las sintomatologías y las características morfológicas de las especies de hongos aisladas inicialmente de frutos enfermos. Sin embargo, trabajos complementarios usando técnicas moleculares como PCR y polimorfismo nuclear de ADN, para estudiar las especializaciones patogénicas, serían de gran utilidad.

Literatura citada

1. Averre, Ch., Jones, R., y Milholland, R. 2003. Strawberry Diseases and their Control. Fruit disease information. Note 5. Plant pathology extension. North Carolina State Univ. U.S. 9 p.         [ Links ]

2. Castañeda, R. 2004. Actualización en los sistemas de clasificación e identificación de hongos hifomicetes. INIFAT-Cuba. MCT, INIA, Maracaibo, Venezuela. 61 p.         [ Links ]

3. Cedeño, l., y Carrero, C. 1996. Primer reporte en Venezuela de Colletotrichum acutatum causando antracnosis en frutos de fresa. Fitopatol. Venez. 9 (1):5.         [ Links ]

4. Ellis, M. 2004. Botrytis Fruit rot "Gray Mold" of strawberry, rasberry and blackberry. Extension factsheet. HYG 3017-94. Ohio state Univ. 2 pp.         [ Links ]

5. Freeman, S., Katan, T. y Shabi, E. 1998. Caracterization of Colletotrichum species responsable for anthracnose diseases of various fruits. Plant disease. 82.(2):596-605.         [ Links ]

6. Howard, C., Mass, J., Chandler, C., y Albregts, E. 1992. Anthracnose of strawberry caused by Colletotrichum complex in Florida. Plant Disease 76:976-981.         [ Links ]

7. Mass, J. Ed. 1998. Compendium of strawberry diseases. 2^nd ed. St. Paul. The American Phytopathological Society. 138 pp.         [ Links ]

8. OEPP. 2004. EurDiagnostic protocols for regulated pest. P.M. 7/25. Bulletin 34, p. 155-157.         [ Links ]

9. Smith, B., y Black, L. 1990. Morphological, cultural and pathogenic variation among Colletotrichum species isolated from strawberry. Plant Dis. 74:69-76.         [ Links ]

10. Tanaka, M., y Passos, F. 2002 Pathogenic characterization of Colletotrichum acutatum and C. fragariae associated with strawberry anthracnose. Fitopatol. bras. 27(5):484-488.         [ Links ]