Determinación de temperatura y humedad óptima para la germinación y esporulación de cinco aislamientos de Beauveria bassiana

Optimum temperature and humidity determination in germination and sporulation of five Beauveria bassiana isolates

J.C. Godoy¹, R.E. Valera¹, C. Guédez¹, L.M. Cañizalez¹ y C. Castillo¹

¹Laboratorio de Fitopatologia y Control Biologico "Dr Carlos Diaz Polanco", Núcleo Universitario "Rafael Rangel" Universidad de los Andes. Venezuela.

Autor de correspondencia e-mail: cguedez@ula.ve

Resumen

Beauveria bassiana es un hongo entomopatógeno caracterizado por controlar plagas a nivel mundial por sus excelentes características patogénicas. La eficacia de este hongo en el control depende de variables como aislamientos específicos, humedad y temperaturas adecuadas necesarias para la germinación y esporulación en el insecto. La finalidad de este trabajo fue determinar la esporulación de cinco aislamientos de Beauveria bassiana en dos sustratos, tres temperaturas y tres humedades relativas diferentes y su capacidad germinativa a 25ºC y 30ºC. La esporulación se determinó a los trece días de crecimiento contando las esporas en la cámara de Neubauer, según el método de French. El porcentaje de germinación de esporas, se realizó en una cámara de crecimiento, realizando contaje entre 6 horas y 12 horas. El análisis de varianza factorial determinó que existen diferencias significativas (P>0,05) en la producción de esporas en los aislamientos en los dos medios de cultivo y tres temperaturas. El aislamiento Bb-05 el que presentó mayor cantidad de esporas a 100% de humedad relativa no existiendo diferencias significativas entre 80% y 90%. La mayor esporulación fue en el aislamiento Bb-05 en los medios de cultivos utilizados a 25°C y 30°C y a humedad relativa de 100%. La germinación de esporas presentó diferencias significativas (P<0,05) entre las temperaturas, con el mayor porcentaje de germinación a 25ºC y con diferencias significativas entre aislamientos, presentándose la mayor germinación en el Bb-05. Los cinco aislamientos de B. bassiana presentaron una esporulación superior a 10⁷ esporas/ml. Beauveria bassiana es un hongo entomopatógeno que tolera un rango amplio de temperatura y humedad relativa, es así como se explica la capacidad de esta especie para adaptarse a diferentes áreas edafoclimáticas.

Palabras clave: Condiciones ambientales, Control biológico, Beauveria bassiana, entomopatógeno.

Abstract

The effectiveness of Beauveria bassiana to control insect plagues around the world, is by its excellent pathogenic characteristic. Biological control depends on variables as specific isolations, humidity and obligatory appropriate temperatures for germination and sporulation in insects. The objective of this research was to determine sporulation of five Beauveria bassiana isolations in two different substrates, three different temperatures and three different relative moistures and its germinating capacity at 25ºC and 30ºC. Sporulation was determined to thirteen days of fungal growth by counting the spores in Neubauer's camera, according to the French's method. Spores germination percentage was carried out in a growth camera, carrying out the counting between 6 and 12 hours. The factorial analysis variance determined that significant differences exist (P>0,05) in the production of spores in the isolations in the two culture medium and three temperatures, but there is no significant differences among the interaction between the variable culture medium and temperature (P>0,05). Significant differences were noted in the production of spores in the relative moistures. When carrying out the analysis mean comparisons of the spores' production differences were not noted between the temperatures 25°C and 30°C. The highest sporulation was in the isolation Bb-05 in the culture medium used at 25°C and 30°C and relative humidity of 100%. The spores germination showed significant differences (P<0,05) among the temperatures, with the highest germination percentage at 25ºC and with significant differences among isolations. All B. bassiana isolations had a superior sporulation to 10⁷ spores/ml. Beauveria bassiana is an entomopathogen fungi that tolerates a wide range of temperature and relative moisture, and as well as the capacity of this species is explained to adapt to different environmental conditions.

Key words: Environmental conditions, Biological control, Beauveria bassiana, entomopathogen.

Recibido el 2-11-2005 Aceptado el 30-7-2006

Introducción

El hongo Beauveria bassiana ha sido utilizado exitosamente para controlar plagas de muchas regiones del mundo como parte de las estrategias de manejo integrado de plagas. Por sus características patogénicas para controlar insecto, su factibilidad de reproducción en forma artificial y la rentabilidad de su uso, este hongo representa una alternativa viable al ser utilizado sin perjuicios al medio ambiente y sin efectos tóxicos (2). Sin embargo, este hongo es afectado por una compleja interacción entre factores ambientales bióticos y abióticos entre los que se puede mencionar temperatura, humedad, pH, luz, hospedantes y sustratos (3, 13); por lo que es importante considerar que las limitaciones impuestas a la infección por un factor ambiental puede restringir la efectividad del hongo entomopatógeno sobre el control de insectos (6).

Los factores ambientales tienen gran importancia en la formación, germinación, sobrevivencia y penetración de las esporas en la cutícula del insecto (4, 14) y tanto las esporas como las hifas del hongo sobreviven asociados al hospedante o al sustrato influenciado por diferentes factores bióticos y abióticos (9).

Los hongos requieren de cierta temperatura mínima y alta humedad relativa para poder desarrollarse y efectuar sus actividades. Beauveria bassiana puede encontrarse en un amplio rango de temperatura que va desde los 15°C a los 30°C y una humedad relativa de 90% (1,2). Sin embargo, hay ciertas preferencias de estas condiciones ambientales dependiendo del aislamiento o cepa del hongo.

Las características principales para que un hongo entomopatógeno sea eficaz en el control de insectos plaga, son su formulación y aplicación apropiada, así como la elevada virulencia del aislamiento (2).

Los factores ambientales actúan directa e indirectamente afectando la persistencia y sobrevivencia de los hongos en la naturaleza (12, 15, 16). La temperatura y la humedad tienen influencia en todos los hábitats, los terrestre tiene mayor influencia la luz en la forma de radiación solar (16).

Estudios sobre el comportamiento de aislamientos de hongos entomopatógenos son indispensables para emplear estrategias de control de insectos de importancia económica, pertenecientes a diferentes órdenes y cuyo comportamiento varía en la naturaleza dependiendo de los factores ambientales imperantes. Es por ello que, se evaluó la esporulación y la capacidad de germinación de cinco aislamientos de Beauveria bassiana, provenientes de diferentes localidades y que son utilizados para el control biológico de insectos plaga en el estado Trujillo, Venezuela.

Materiales y métodos

Se utilizaron cinco aislamientos de Beauveria bassiana, provenientes de 3 localidades del estado Trujillo, codificados de la siguiente manera: los aislamientos Bb-01 y Bb-02 fueron aislados de Rodnius prolixus y Heliotaurus sp, respectivamente, en la localidad de Monay; los aislamientos Bb-03 y Bb-04 de Hypothenemus hampei, encontrados en Cuicas, y el aislamiento Bb-05 fue aislado de Premnotrypes vorax en la localidad de Cabimbú. Todos los aislamientos son reproducidos y mantenidos en el Laboratorio de Fitopatología y Control Biológico "Dr. Carlos Díaz Polanco" del Núcleo Universitario "Rafael Rangel" de la Universidad de los Andes en Trujillo.

Todos los aislamientos fueron sembrados en el centro de cajas de Petri que contenían medio de cultivo agar-papa-dextrosa (PDA) y Medio Especial (ME). Los aislamientos ya en las cajas de Petri, se incubaron en las diferentes temperaturas (10°C, 25°C y 30ºC), colocando 5 cajas de Petri por medio de cultivo y temperatura.

Los niveles de humedad relativa (80%, 90% y 100%) fueron controlados utilizando el método de soluciones saturadas con Cloruro de Sodio (NaCl) en cámaras con PDA; descrito por Creahan (7).

Después de 13 días de crecimiento de los aislamientos de Beauveria bassiana en los dos medios de cultivos y en las 3 temperaturas se determinó la concentración de esporas, en todas las cajas de Petri y se calculó el promedio. Para determinar la esporulación (concentración de esporas) se tomó 1 cm² del medio conteniendo el hongo y se colocó en 9 ml de agua destilada estéril, se mezcló en el agitador magnético y de esta suspensión se realizó el contaje en la cámara de Neubauer, según el método de French y Hebert (8).

El porcentaje de germinación de esporas, se realizó en una cámara de crecimiento, que consiste en una caja de Petri que contiene papel absorbente, un triángulo de vidrio, un porta objeto y cubre objeto; se colocó un cuadrado de medio de cultivo PDA (2 cm x 2 cm) en el porta objeto, y sobre él, se aplicó una suspensión de esporas de baja concentración, con el asa de platino de diámetro de 4 mm. Cada 6 horas se realizaban observaciones al microscopio para determinar el número de esporas germinadas hasta las 12 horas.

Los datos fueron procesados mediante un análisis de varianza factorial y las comparaciones de medias "Post Hoc" se realizaron a través de la prueba de Tukey, en el programa estadístico SPSS.11.0 para Windows.

Resultados y discusión

Esporulación de cinco aislamientos de B. bassiana en medio de cultivo PDA y ME a temperaturas de 10°C, 25°C y 30°C: Los cinco aislamientos presentaron una alta producción de esporas en PDA y ME, a 25ºC y 30ºC, a los 13 días de sembrados con valores mayores de 10⁷ esporas/ml. El análisis de varianza determinó que existen diferencias significativas (P>0,05) en la producción de esporas de los aislamientos en los dos medios de cultivo y las tres temperaturas (cuadro 1). Al realizar el análisis de comparaciones de medias "Post Hoc" (Tukey) de la producción de esporas no existen diferencias entre las temperaturas 25°C y 30°C y si existen diferencias significativas entre 10ºC y 25ºC y entre 10ºC y 30ºC.

Cuadro 1. Esporulación (esporas/ml) de cinco aislamientos de Beauveria bassiana en medios de cultivo de PDA y ME a 10, 25 y 30°C a los 13 días.

Medias con letras mayúsculas iguales en las filas no difieren entre si, con la prueba de medias de Tukey al 5% de probabilidad y medias con letras minúsculas iguales en la columna no difieren entre si

Al analizar los aislamientos se determinó que existen diferencias significativas entre ellos (P<0,05), y en la prueba de comparación de medias "Post Hoc", se comprobó que los aislamientos Bb-02 y Bb-05 produjeron mayor cantidad de esporas que los demás aislamientos en los dos medios de cultivos a 25°C y 30°C.

Beauveria bassiana, es afectada por una compleja interacción de factores ambientales bióticos y abióticos, como la temperatura, la humedad, la aireación, el pH, la exposición a la luz ultravioleta, hospederos y sustratos (9, 10, 11). Mediante estos resultados determinamos que la producción de esporas de Beauveria bassiana depende del aislamiento, del sustrato y de condiciones ambientales como temperatura y humedad relativa. Sin embargo, estos aislamientos pueden adoptar un comportamiento diferente en condiciones de campo.

Esporulación de cinco aislamientos de B. bassiana a 80%, 90% y 100% de humedad relativa: El análisis de varianza determinó que existen diferencias significativas (P>0,05) en la esporulación de los aislamientos a diferentes humedades relativas, siendo el aislamiento Bb-05 el que presentó mayor cantidad de esporas a 100% de humedad relativa no existiendo diferencias significativas entre 80% y 90% (cuadro 2).

Cuadro 2. Esporulación (esporas/ml) de cinco aislamientos de Beauveria bassiana a 80%, 90% y 100% de humedad relativa a los 13 días.

Germinación de esporas de cinco aislamientos de B. bassiana en PDA a 25° y 30°C. El porcentaje de germinación en los cinco aislamientos fue superior al 60% a 25°C, mientras que, a 30°C el porcentaje de germinación osciló entre el 28% y el 37% (cuadro 3). El análisis de varianza indicó que existen diferencias significativas (P<0,05) en la germinación y depende de la temperatura, presentando el mayor porcentaje de germinación el aislamiento Bb-05 de 100% a 25ºC.

Cuadro 3. Porcentaje de germinación de cinco aislamientos de B. bassiana en PDA a 25°C.

Carreño (5) y Tanada y Kaya (19) señalan que la germinación de las esporas depende en gran parte de la humedad ambiental y temperatura y en menor grado a las condiciones de luz y nutricionales, y según Guillespie (11) el nivel de agua es determinante en el crecimiento de los hongos, y pequeñas diferencias en los niveles de humedad relativa después de la aplicación de conidias, pueden determinar de un modo u otro el éxito del hongo en el control de insectos plaga.

Conclusiones

El aislamiento Bb-02 y Bb-05 tuvieron la mayor esporulación en los medios PDA y ME, a 25°C y 30°C y Bb-05 el mayor porcentaje de germinación de los cinco aislamientos evaluados.

El porcentaje de germinación de esporas fue mayor a 25°C, entre el 60% para Bb-01 y Bb-02 y 100% para Bb-05.

Beauveria bassiana es un hongo entomopatógeno que tolera un rango amplio de temperatura y humedad relativa, es así como se explica la capacidad de esta especie para adaptarse a diferentes áreas edafoclimáticas.

Agradecimiento

Los autores agradecen al Consejo de Desarrollo Científico, Humanístico y Tecnológico (CDCHT) de la Universidad de Los Andes por el financiamiento de este trabajo a través del proyecto Código: NURR-C-305-01-01-B.

Literatura citada

1. Agrios, G. N. 1999. Fitopatología. Editorial Limusa. México.         [ Links ]

2. Baeteman, R. 1997. The development of a mycoinsecticide for the control of locust and grasshopers. Outlook on Agiculture. 26:13-18.         [ Links ]

3. Berlanga-Padilla, A. y V. Hernández-Velázquez. 2003. Efecto de la temperatura sobre el crecimiento y la virulencia de Metarhizium anisopliae, M. a. var. acridum y Beauveria bassiana en Shistocerca piceifrons. Centro Nacional de Control Biológico. SAGARPA-SENACICA- DGSV. Tecomán- Mexico.         [ Links ]

4. Beyer, M., Verreet, J.A. y Ragab, W. 2005. Effect of relative humidity on germination of ascospores and macroconidia of Gibberella zeae and deoxynivalenol production. Int. J. Food Microbiol. 15; 98(3):233-40.         [ Links ]

5. Carreño, I. 2003. Evaluación de la patogenicidad de diferentes hongos entomopatogenos para el control de la mosca blanca de la yuca bajo condiciones de invernadero. Bogota, Colombia. p. 37.         [ Links ]

6. Carruthers, R.I. y K. Hural, 1990. Fungi as naturally ocurring entomopathogens. p. 115-138. In: R. Baker and P. Duna (eds). New Directions in Biological Control. Alan R. Liss. New Cork.         [ Links ]

7. Creahan, J. 1991. Controlling relative humidity with saturated sodium clorure solutions. Waac Newsletter. 13:17-18.         [ Links ]

8. French, E. y T. Hebert. 1988. Métodos de Investigación fitopatología. Instituto Interamericano de Ciencias Agrícolas. Costa Rica. p. 289.         [ Links ]

9. Glare R., T. 1992. Fungal pathogens of scarabs. p. 63-79. En: Jackson, T.A... and GLARE, R.T. Use of pathogens in scarabs pest management. London: Athenaeum Press.         [ Links ]

10. Gottwald, T. R. y Tedders, W. L. 1984. Colonization, Transmission and longevity of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae (Deuteromycotina: Hyphomycetes) on Pecan weevil larvae (Coleoptera: Curculionidae) in the soil. Environ. Entomol. 13:557-560.         [ Links ]

11. Guillespie, A. 1988. Use of fungi to control pest of agricultural importance. p. 269 In: Burge, M. (Ed) Fungi in biological control systems. Manchester University Press, Manchester, England.         [ Links ]

12. Hagstrum, P. 1987. Seasonal variation of stored wheat environment and insect populations. Environ. Entomol. 16:77-81.         [ Links ]

13. Hastuti, B., T. Glare y R. Chapman. 1999. Effects of temperature and humidity on the susceptibility of Paropsis charybdis to Beauveria bassiana. Proc. 52nd N.Z. Plant Protection Conf. 1999: 103-107.         [ Links ]

14. James, R., Buckner, J.  y Freeman, T. 2004. Cuticular lipids and silverleaf whitefly stage affect conidial germination of Beauveria bassiana and Paecelomyces fumosoroseus. J. Invertebr. Pathol. 84:67-74.         [ Links ]

15. Lord, J.C y Roberts, D.W. 1985. Effects of salinity, pH, organic solutes, anaerobic conditions and the presence of other microbes on production and survival of Lagenidium giganteum (Oomycetes: Lagenidiales) Zoospores. J. Invertebr. Pathol. 45:331-338.         [ Links ]

16. McCoy, C., Quintela, E.  y De Faria, M. 1988. Environmental Persistence of Entomopathogenic fungi. University of Florida. U.S.A. p. 1-11.         [ Links ]

17. Roberts, D. y Campbell, A.S. 1977. Stability of entomopathogenic fungi. Miscell. Pub. Of the Entomol. Soc. Am. 10:19-76.         [ Links ]

18. Roberts D. W. and Humber, R.A. 1981. Entomogenous fungi. p. 201-216. In: Biology of conidial fungi. Cole G. y B. Kendrick. Academic Press. New York.         [ Links ]

19. Tanada, Y. y H. Kaya. 1993. Insect Pathology. Academic Press. Inc., San Diego.         [ Links ]