Detección por PCR de begomovirus en el cultivo del tomate en las áreas productoras de los Andes venezolanos

Begomovirus detection on tomato crop grown in Venezuelan Andes by PCR

A.E. Faría R. y A. Nava

Departamento de Agronomía, Facultad de Agronomía, Universidad del Zulia; A.P. 15205, Maracaibo, Venezuela.

Autor de correspondencia e-mail: fariaalfredo@gmail.com

Resumen

Los begomovirus han limitado el cultivo del tomate (Lycopersicon esculentum L.) durante muchos años en Venezuela, agravándose la situación con el incremento de la población del insecto vector (Bemisia tabaci Gennadius). El desarrollo de técnicas de diagnóstico molecular en años recientes ha suministrado un valioso enfoque para la detección temprana y precisa de begomovirus en plantas. Para determinar la presencia de begomovirus en muestras de tomate de las áreas de producción en los Andes venezolanos, mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se colectaron 94 muestras con síntomas similares a los causados por virus, a las cuales se les efectuó la extracción de ADN genómico con CTAB (Bromuro de cetiltrimetilamonio). La detección de begomovirus se realizó utilizando cebadores degenerados para cada componente del genoma viral. En el 38% de las muestras se detectó la presencia de begomovirus, basado en el tamaño del producto esperado de PCR. Los síntomas asociados con la presencia de begomovirus más frecuentemente observados fueron mosaicos, nervaduras amarillas, encrespamiento y enanismo. En los estados Mérida, Táchira y Trujillo los begomovirus siguen siendo un problema importante en el cultivo de tomate; por lo cual se requiere estudiar la variabilidad y distribución de los begomovirus para desarrollar estrategias de manejo en ese cultivo.

Palabras clave: Geminivirus, Reacción en cadena de la polimerasa, Lycopersicon esculentum.

Abstract

Begomoviruses in tomato production have been a serious problem for several years in Venezuela, and the situation has been aggravated with the insect vector (Bemisia tabaci Gennadius) introduction. Development of molecular diagnostic techniques has been a valuable tool for early and accurate detection of begomoviruses in plants. To determine the begomoviruses presence in tomatoes grown in the Andean production areas in Venezuela, 94 samples with virus-like symptoms were collected, and genomic DNA was extracted by CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) method. Begomovirus detection was performed using degenerated primers for each viral component. Based on expected PCR products, begomovirus was detected in 38% of samples. The most frequent symptoms associated with the begomoviruses presence were mosaic, yellow vein, leaf curlin, and stunting plant. The begomoviruses are still a limitation for tomato crops. Therefore, it is required to study the variability and distribution of these viruses in order to develop strategies for adequate tomato crop management.

Key words: Geminivirus, polymerase chain reaction, Lycopersicon esculentum.

Recibido el 6-12-2007 Aceptado el 6-2-2009

Introducción

El tomate (Lycopersicon esculentum L.) es un cultivo hortícola importante en Venezuela, con una producción estimada para el año 2005 de 195.000 t, en una superficie de 9.000 ha y un rendimiento de 21,67 t.ha^-1 (FAOSTAT, 2006). Este cultivo es afectado por varios patógenos (hongos, bacterias y virus) que disminuyen su producción (Jones et al., 1991). En Venezuela se han señalado varios virus afectando al cultivo, entre ellos distintos begomovirus: Tomato yellow mosaic virus (Debrot et al., 1963) (ToYMV AF150742) (Morales et al. 2001), Potato yellow mosaic virus-Venezuela (PYMV VE D00940, D00941) (Coutts et al. 1991), PYMV-VE cepa tomate (PYMV-VE strain tomato AF026553), Tomato Venezuela virus (ToVEV AF026464) (Guzmán et al., 1997), Tomato mosaic leaf curl virus (TMLCuV AY508991 AY508992), Tomato yellow margin leaf curl virus (ToYMLCuV AY508993, AY508994) (Nava, 2004) y Tomato yellow leaf curl virus cepa Portugal (DQ302033) (Zambrano et al., 2007).

Los begomovirus han surgido como una amenaza importante en la producción de una serie de cultivos a nivel mundial. Algunas de las enfermedades causadas por estos patógenos son devastadoras, constituyendo un serio riesgo para la agricultura sostenible, particularmente en zonas tropicales y subtropicales (Morales y Anderson, 2001; Varma y Malathi, 2003). Los begomovirus son uno de los cuatro géneros que conforman la familia Geminiviridae, estos virus de plantas (ca. 18-30 nm) tienen un genoma circular de ADN de cadena simple (ssDNA), están protegidos por la cápsida en partículas gemelas, cuasi-icosahédricas, este genoma puede ser de una o de dos partículas y son transmitidos principalmente por el insecto vector, mosca blanca (Bemisia tabaci Gennadius) (Lazarowitz, 1992; Varma y Malathi, 2003).

Los begomovirus son principalmente de dos partículas, pero los begomovirus del Viejo Mundo son de una sola partícula. Los begomovirus de dos partículas tienen dos componentes, designados como A y B. Cada componente tiene ~2.600 nt. Los genes del componente A están involucrados en la encapsidación y en la replicación, mientras que los genes del componente B están involucrados en el movimiento de los virus a través de la planta, en la determinación del rango de hospederos y en la expresión de síntomas (Gafni y Epel, 2002; Lazarowitz, 1992). Uno de los cinco genes en el componente A es el gen de la proteína de la cápsida viral [Coat Protein (CP)]. La transcripción de este gen es en el sentido viral, es decir siguiendo la dirección de las agujas del reloj. Los otros cuatro genes, los cuales codifican la proteína asociada a la replicación [Replication-associated protein (Rep)], la proteína activadora de la transcripción [Transcriptional Activator Protein (TrAP)], la proteína reforzadora de la replicación [Replication Enhancer (REn)] y la proteína AC4 de función aun desconocida, se transcriben en sentido complementario al virus, es decir en contra de las agujas del reloj (Lazarowitz, 1992).

Estos dos grupos de genes del componente A (CP y Rep; TrAP; REn; AC4) están solapados y separados por una región intergénica [Intergenic Region (IR)], la cual no codifica ninguna proteína. La IR comienza en el codón de inicio del gen de la Rep y termina en el inicio del gen de la CP. La secuencia de nucleótidos de esta región varía ampliamente entre los diferentes begomovirus, con la excepción de una región conservada rica en GC, la cual tiene la capacidad de formar una estructura secundaria denominada horquilla (stem-loop) de una longitud de ~30 nt. En esta IR se encuentra también una secuencia invariable de nueve nucleótidos o nanomérica TAATATT(i)AC, que constituye el asa o lazo (loop) de esa estructura secundaria. Esta secuencia nanomérica es conservada para todos los virus miembros de la familia Geminiviridae (Lazarowitz, 1992).

El componente B tiene dos genes. El gen NSP, el cual se transcribe en el sentido de la banda viral y el gen de la proteína de movimiento (MP), el cual se transcribe en el sentido de la banda complementaria. El NSP está involucrado en el traslado del genoma viral del núcleo al citoplasma y viceversa, el MP está involucrado en el movimiento del virus de célula a célula vía plasmodesmo (Gafni y Epel, 2002). El gen MP pareciera ser un elemento de inducción de síntomas o un determinante de la patogenicidad de los begomovirus de dos partículas. Estudios con mutaciones sugieren que la región 3' del gen MP está asociada con el desarrollo de síntomas (Gafni y Epel, 2002).

El desarrollo de técnicas de diagnóstico molecular en años recientes ha suministrado un valioso enfoque para la detección temprana y precisa, así como para la cuantificación de patógenos de plantas (Miller y Martin, 1988). Dos técnicas de diagnóstico molecular, técnicas inmunológicas y ensayos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se han aplicado exitosamente para la detección cualitativa o cuantitativa de varios patógenos incluyendo virus, bacterias y hongos (Clark, 1981; Hauser et al., 2000; Henson y French, 1993). En comparación a las técnicas tradicionales de diagnóstico visual y microscópico, estos métodos tienen una alta especificidad y sensibilidad por lo que pueden ser útiles para detectar infecciones presintomáticas e identificación de enfermedades sin el consumo de tiempo y cultivo de los patógenos y plantas indicadoras (Martin et al., 2000). La detección temprana, rápida y precisa de begomovirus que afectan al cultivo de tomate en Venezuela contribuirá en el diseño de estrategias de manejo de este problema fitosanitario, permitirá dar respuesta oportuna a los productores evitando el consumo de tiempo que representan las pruebas biológicas, reducirá la dispersión de la enfermedad controlando las plantas en semilleros y facilitará la aplicación de medidas cuarentenarias por parte de las instituciones que resguardan la sanidad vegetal venezolana.

La PCR se ha utilizado exitosamente en tomate, para la detección de Crinivirus (Dovas et al., 2002) y de algunos begomovirus, tanto en plantas como en su vector; la mosca blanca (Herrera et al., 1999; Khan, 2000; Martínez-Culebras et al., 2001; Morris et al., 2002; Mehta-Prem et al., 1994; Rosell et al., 1999), demostrando ser rápida, sensible y específica.

El objetivo principal de este trabajo fue determinar la presencia de begomovirus en muestras de tomate en las áreas de producción de los Andes venezolanos, mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), así como determinar los síntomas más frecuentes en muestras positivas para begomovirus.

Materiales y métodos

Muestreo: Se colectaron hojas jóvenes de plantas de tomate con edad de 2 semanas hasta la cosecha, presentando síntomas de enfermedades virales, creciendo en siembras comerciales de los estados andinos de Venezuela (figura 1). Se realizó un registro de todas las unidades de producción visitadas que incluyó: ubicación (geográfica y astronómica), área sembrada, cultivar, edad, origen de las plantas sembradas y sintomatología. Se colectaron 94 muestras, 48 en el estado Táchira (municipios San Cristobal, Libertad, Independencia, Cardenas y Andres Bello), 28 en Trujillo (municipios Trujillo, Pampam y Carache) 18 en Mérida (municipios Sucre y Pinto Salinas), las cuales se colocaron en bolsas plásticas herméticas y se almacenaron en cava portátil refrigerada para garantizar su conservación durante su traslado desde el campo hasta el laboratorio.

Las muestras colectadas se trasladaron al laboratorio de biotecnología Profesora Silvia León de Sierralta de la Facultad de Agronomía de la Universidad del Zulia, donde se procesaron (secado a temperatura ambiente, conservado a -20ºC en viales con silica gel) para su posterior análisis.

Extracción de ADN: Se realizó siguiendo el método de Doyle y Doyle (1987).

PCR: Se usó un par de cebadores degenerados por cada componente del genoma viral. Los cebadores PAR1c496 (5' A A T A C T G CACGGCTTYCTRTACATRGG 3') y PAL1v1978 (5' G C A T C T G C A G G CCCACATYGTCTTYCCNGT 3') (Rojas et al., 1993) amplifican un fragmento de ~1100 pb del componente A. Este fragmento incluye ~690 pb del gen Rep, ~300 pb de la IR y ~120 pb del gen de la CP. Los cebadores PVL1v2040 (5' G C C T C T G C A G C ARTGRTCRATCTTCATACA 3') y PCRc154 (5' G G T A A T A T T A T A H CGGATGG 3') (Rojas et al., 1993) amplifican ~600 pb del componente B, este fragmento contiene parte del gen MP (~160 pb), la región denominada hipervariable y parte de la región común (Common Region). Las condiciones de la PCR para el par de cebadores PAR1c496 y PAL1v1978 y el par PVL1v2040 y PCRc154 se realizaron siguiendo los protocolos previamente descritos (Rojas et al., 1993).

Las PCRs se realizaron en un termociclador (Mastercycler ep gradient S, Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Todas las amplificaciones se realizaron en volúmenes de 25 µL conteniendo: 5 µl de green GoTaq^® flexi buffer 5X; 2,5 µl de MgCl₂ 25 mM; 0,4 µl de dinucleotidos libres 25 mM; 0,5 µl de cada cebador 50 pM/µl; 0,125 µl GoTaq^® ADN Polimerasa 5 u/µl y 1,5 µl de ADN genómico. Se usaron como controles la extracción de ADN de la muestra denominada 2.7-V donde previamente se detectó la presencia de Tomato mosaic leaf curl virus (TMLCuV) (Nava et al., 2006), tomate sano sembrado bajo condiciones de laboratorio y agua pura como control negativo absoluto.

Los productos de las PCRs se observaron después de una electroforesis (25 min a 50 voltios) en geles de agarosa al 1% preparados con buffer Tris-acetato-EDTA (ácido etilendiaminotetracetico), pH 8. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio y se observaron a través de un transiluminador de luz ultravioleta.

Resultados y discusión

Síntomas

Síntomas similares a los ocasionados por virus en plantas se encontraron en todas las unidades de producción muestreadas en los tres estados andinos, observándose alteración del color, forma y tamaño de las hojas. Los síntomas más frecuentemente observados en hojas (más del 26%) fueron encrespamiento, acopamiento, mosaicos, (figura 2) y otros menos frecuentes fueron color violáceo, alargamiento, aclaramiento o amarilla-miento de venas (cuadro 1). Además, se observaron algunas plantas con enanismo o achaparramiento.

Cuadro 1. Porcentaje de ocurrencia de síntomas encontrados en campos de tomate de los tres estados andinos de Venezuela, y de muestras que resultaron positivas para la detección de begomovirus por PCR, en base a 90 muestras con síntomas.

*¹ Encr: Encrespamiento; *² Acop: Acopamiento; *³ Mos L: Mosaico leve; *⁴ MA: Mosaico amarillo; *⁵ Viol: Color violeta; *⁶ Enan: Enanismo; *⁷ Al: Alargamiento; *⁸ Marg A: Márgenes Amarillos; *⁹ Nerv A: Nervaduras amarillas; ^*10 Fl.A: Flores abortivas.

Casi la mitad de las muestras presentaron encrespamiento de hojas (cuadro 1); un 44,4% mostraron acopamiento de las hojas, también se observaron dos tipos de mosaico, uno donde sólo se aprecian en las hojas, diferencias de tonalidades de verde o mosaico leve (35,56%) y otro denominado mosaico amarillo, donde se exhiben zonas amarillas contrastando con zonas verdes (similar al mosaico amarillo del tomate) (figura 2), el cual se presentó con menor frecuencia que el anterior. Estas sintomatologías han sido observadas en begomovirus que afectan al cultivo del tomate (Chowda Reddy et al., 2005; Fernandes et al., 2008; Giordano et al., 2005; Inoue-Nagata et al., 2004; Urbino et al., 2004).

Extracción de ADN

El método de CTAB empleado (Doyle y Doyle, 1987) permitió la extracción de ADN de las muestras y resultó fácil de implementar, sin embargo se observaron precipitados de color marrón y en ocasiones casi negro, que pudiera indicar la presencia de metabolitos secundarios como compuestos fenólicos, que interfieren en la utilización posterior del ADN (Molinari y Crochemore, 2001; Pandey et al., 1996; Rath et al., 1998), sugiriendo la necesidad de mejorar el proceso de extracción. 

Detección de begomovirus mediante PCR

Los productos amplificados por la PCR con los cebadores PAR1c496 y PAL1v1978 para el componente A; PVL1v2040 y PCRc154 para el B (Rojas et al., 1993), mostraron el tamaño esperado de ~1100 pb para el componente A y de ~600 pb para el componente B, la presencia de al menos uno de estos tamaños de los productos de PCR denotan la existencia de begomovirus en la muestra.

En los tres estados muestreados se detectó la presencia de begomovirus (cuadro 2), encontrándose en el estado Táchira el mayor número de muestras positivas (28 de las 48 colectadas), que representa un 58,33%, seguido por el estado Trujillo donde se detectaron 6 muestras positivas de las 28 colectadas, que constituye un 21,43%. En el estado Mérida sólo se detectó begomovirus en una muestra de las 18 colectadas (11,11%). Estos resultados difieren de los señalados anteriormente (Nava et al., 2006) para los estados andinos, donde la presencia de begomovirus en el estado Táchira fue muy baja y más alta en el estado Trujillo, pudiendo sugerir esto un cambio en la distribución de begomovirus en el cultivo de tomate en los Andes venezolanos, en un lapso de 13 años. Además, en el estado Táchira se observó la prevalencia de un único cultivar denominado por los productores "Tetera" de procedencia colombiana, pudiendo esta uniformidad incrementar la vulnerabilidad del cultivo a begomovirus.

Cuadro 2. Número de muestras donde se amplificaron los componentes A y B de begomovirus utilizando PCR [cebadores PAR1c496 y PAL1v1978 para el componente A; PVL1v2040 y PCRc154 para el B (Rojas et al., 1993)], en muestras de tomate de zonas de producción representativas de los estados andinos de Venezuela.

En el estado Táchira se observó la mayor cantidad de muestras positivas en las cuales se logró amplificar ambos componentes del virus, no así en las muestras del estado Trujillo, donde se amplificó con mayor frecuencia el componente B (cuadro 2), presumiéndose que existe una alta variabilidad de begomovirus en las muestras, que no permiten la hibridación de los cebadores degenerados PAR1c496 y PAL1v1978 con el componente A (Rojas et al., 1993).

En el estado Trujillo sólo se detectó la presencia de begomovirus en el municipio Carache de los tres municipios muestreados. En Carache es frecuente la utilización de material de transplante proveniente del estado Lara, el cual ha sido señalado como endémico para begomovirus en tomate (Lastra y Uzcátegui, 1975). En los estados Mérida (municipios Antonio Pinto Salinas y Sucre) y Táchira (municipios San Cristóbal, Andrés Bello, Cárdenas, Independencia y Libertad) se detectó begomovirus en todos los municipios muestreados (cuadro 3). En estos dos últimos estados los municipios se encuentran muy próximos por lo que es posible la dispersión del virus por su insecto vector.

Cuadro 3. Municipios donde se detectó la presencia de begomovirus en muestras de tomate de zonas representativas de producción de los estados andinos de Venezuela.

Conclusiones

Los síntomas de mosaicos, nervaduras amarillas, acopamiento, encrespamiento y enanismo se presentaron frecuentemente asociados con la detección de begomovirus en los campos de tomate de los tres estados andinos de Venezuela. Esta asociación resulta poco práctica en condiciones de campo donde la sintomatología es altamente dependiente del genotipo del hospedante, de las condiciones ambientales o de la ocurrencia de infecciones múltiples.

El método de extracción de ADN de Doyle y Doyle, 1987, utilizado en muestras de tomate deshidratadas, preservadas con silicagel en congelador, puede producir precipitados de ADN con presencia de metabolitos secundarios.

Los begomovirus siguen siendo un problema importante en el cultivo de tomate, detectándose por PCR en el 38,3% de las muestras colectadas en los estados andinos de Venezuela (Mérida, Táchira y Trujillo).

Recomendaciones

Se recomienda evaluar otros métodos de extracción de ADN que permitan obtener ADN de mayor calidad en muestras de tomate deshidratadas, preservadas con silicagel en congelador.

Realizar muestreos más exhaustivos en los estados andinos y en el resto del país, para conocer la distribución y prevalencia de los begomovirus en el cultivo de tomate en Venezuela.

Determinar con precisión la variabilidad de los begomovirus presentes en Venezuela utilizando cebadores específicos y secuenciación para desarrollar estrategias de manejo de esta problemática en campo.

Agradecimiento

Los autores expresan el agradecimiento al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad del Zulia (CONDES) por el financiamiento a este proyecto No. VAC-CC-0002-06.

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