Efecto de la N⁶-bencilaminopurina sobre la multiplicación in vitro de ocumo criollo (Xanthosoma sagittifolium L. Schott)¹

Effect of the N⁶-benzylaminopurine on in vitro multiplication of cocoyam (Xanthosoma sagittifolium L. Schott)

J. Vilchez², Y. Rivas³, N. Albany⁴, M. Molina⁴ y L. Martínez³

¹ Proyecto autofinanciado registrado en el Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico, Universidad del Zulia. VAC-CONDES- CC-0398-07.

2 Departamento de Botánica, Facultad de Agronomía, Universidad del Zulia, AP 15205, Maracaibo, Edo. Zulia (4005ZU), República Bolivariana de Venezuela.

³ Laboratorio de Fisiología Vegetal "Merilyn Marin", Facultad de Agronomía, Universidad del Zulia, AP 15205, Maracaibo, Edo. Zulia (4005ZU), República Bolivariana de Venezuela.

⁴ Departamento de Química. Facultad de Agronomía, Universidad del Zulia, AP 15205, Maracaibo, Edo. Zulia (4005ZU), República Bolivariana de Venezuela.

Autor de correspondencia e-mail: jvilchez@cantv.net; jvilchezp@luz.edu.ve

Resumen

En la micropropagación es muy importancia establecer el balance hormonal para cada una de las fases del proceso. Por ello, se realizó un ensayo para determinar la concentración de citoquinina adecuada para la inducción de brotes de ocumo Xanthosoma sagittifolium L. Schott en fase de multiplicación. Se evaluó el efecto de las concentraciones de 0, 2, 3, 4 mg.L^-1 de N⁶ bencilaminopurina (6-BAP) en dos subcultivos, sobre el número, longitud y biomasa de los brotes, biomasa fresca total, biomasa del tejido descartado e índice de incremento de crecimiento. Se evidencio que la incorporación de 2 mg.L^-1 de 6-BAP en los medios de cultivo fue determinante para la inducción de brotes; mientras que el resto de las variables evaluadas mostraron mayores valores con el incremento en el número de subcultivos. Se concluye que el uso de 6-BAP mejoró la multiplicación y calidad de los brotes de ocumo en comparación con el control.

Palabras clave: brote, citoquinina, malanga, Xanthosoma sagittifolium.

Abstract

In the micro propagation is very important to establish the hormonal balance for each one of the phases of process. Therefore, an essay was carried out to determine the appropriate concentration of cytokinin for the induction of cocoyam shoots Xanthosoma sagittifolium L. Schott in multiplication phase. The effect of 0, 2, 3, 4 mg.L^-1 of N⁶ benzylaminopurine (6-BAP) concentrations was evaluated in two sub-crops, on the number, shoots longitude and biomass, total fresh biomass, discarded tissue biomass and index of growth increase. It was evident that the incorporation of 2 mg.L^-1 6-BAP in the culture media was decisive for the shoots induction; while the rest of the evaluated variables showed higher values with the increase in the sub-crops numbers. It is conclude that the use of 6-BAP improved the multiplication and quality of the cocoyam shoots in comparison to control.

Key words: shoots, cytokinin, cocoyam, Xanthosoma sagittifolium.

Recibido el 30-5-2008 Aceptado el 13-11-2008

Introducción

Dentro de las aráceas comestibles el ocumo criollo, blanco o malanga (Xanthosoma sagittifollium L. Schott), es una planta herbácea perenne cultivada en muchos países tropicales y subtropicales, ya que sus tubérculos son una fuente de almidón fácilmente digerible; además, contienen proteínas y vitaminas como niacina, tiamina, riboflavina y vitamina C (Niba, 2003).

La propagación del ocumo es asexual, a partir de fragmentos del rizoma, por lo que el método de multiplicación favorece la diseminación de patógenos (Omokolo et al., 2003). Esta situación amerita la búsqueda de alternativas que permitan la producción de propágulos de excelente calidad genética y fitosanitaria, a fin de poder lograr mayores beneficios en la producción de este cultivo.

Las técnicas de cultivo in vitro de tejidos, basadas en la organogénesis directa como método de propagación, surgen como una posible alternativa a los problemas de calidad fitosanitaria del ocumo, ya que permite la eliminación de patógenos y rejuvenecer el material vegetal, haciéndolo más rendidor en campo (Orellana, 1998a).

Se han realizado esfuerzos para generar información que permita usar exitosamente las técnicas de cultivo in vitro en ocumo (Gómez et al., 1989; Rancillac et al., 1987). Sin embargo, es necesario investigar más detalladamente acerca de los componentes de los medios de cultivo, específicamente el tipo y concentración de la citoquinina, ya que ésta determinará la formación de nuevos brotes a partir de meristemos, ápices o yemas preexistentes.

La cantidad citoquinina endógena en los meristemos y ápices es baja, debido a que el principal sitio de síntesis son las raíces, por lo que en estos casos la adición exógena de citoquinina en los medios de cultivo es una práctica generalizada. Orellana (1998b) señaló que la citoquinina más efectiva y empleada para la inducción de yemas axilares fue la N⁶ bencilaminopurina (6­BAP) con una frecuencia de 75% de los casos, seguida por la kinetina con 20% y el 2ip y zeatina con 3%.

Por lo anteriormente expuesto, se estudió el efecto de diferentes concentraciones de 6-BAP sobre la multiplicación in vitro de ocumo criollo (Xanthosoma sagittifollium L. Schott), para contribuir a establecer un protocolo de micropropagación en esta especie.

Materiales y métodos

La investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología "Silvia León de Sierralta", Facultad de Agronomía, Universidad del Zulia. El estudio se inició con la selección de brotes de ocumo de un segundo subcultivo, crecidos en un medio constituido por las sales de Murashige y Skoog (MS) (1962) suplementado con 30 g.L^-1 de sacarosa, gelificado con 4 g.L^-1 de Agargel (Sigma Chemical Co., EUA) y pH de 5,8.

Se realizó un ensayo factorial 4x2 para evaluar cuatro concentraciones (0, 2, 3 y 4 mg.L^-1) de 6-BAP durante dos subcultivos consecutivos de cuatro semanas cada uno. El diseño experimental utilizado fue completamente aleatorizado. El medio de cultivo usado para este experimento fue similar al descrito con anterioridad, adicionándole la concentración de 6-BAP requerida para cada tratamiento. Previo a la siembra de los explantes en el medio de cultivo, estos fueron decapitados y reducido su tamaño a 1,5 cm de longitud.

Se sembraron tres brotes de ocumo en frascos de vidrio de 200 mL de capacidad, cada uno con 25 mL de medio de cultivo, hasta completar 10 frascos para un total de 30 brotes por tratamiento. Los explantes fueron ubicados en un cuarto de crecimiento, con una temperatura promedio de 26±2°C bajo luz blanca fluorescente continua (40W), con una intensidad de 300 µmol·m^-2·s^-1.

Después de cuatro semanas de cultivo se evaluaron las variables: número de brotes (NB): cantidad de brotes contabilizados por cada explante inoculado; longitud del brote (LB): medida en centímetros desde la base del cormo hasta la zona distal de la hoja más larga del brote; biomasa fresca de los brotes (MB): biomasa de cada uno de los brotes emitidos por explante inoculado; biomasa fresca total (MT): biomasa de todo el explante y de los brotes emitidos; biomasa del tejido descartado (MD): biomasa del tejido que se descartó de cada brote, en el proceso de limpiado del mismo (incluyendo hojas, raíces y secciones de microcormo necrosado o dañado); índice de incremento de crecimiento (IIC): valor obtenido al aplicar la siguiente fórmula: IIC= (MT-MEI) x MEI^-1. Para ello fue medido previamente la biomasa del explante inoculado (MEI) antes de la siembra, en cada uno de los subcultivos evaluados.

Los datos de todas las variables estudiadas fueron evaluados mediante un análisis de la varianza simple y se realizó la prueba de comparación de medias por Tukey cuando las variables mostraron diferencias estadísticas. Todos los análisis se realizaron con el programa computarizado Statistix versión 8.0 para ambiente Windows (Microsoft^®).

Resultados y discusión

El análisis estadístico detectó efecto de la interacción de las concentraciones de 6-BAP y el número de subcultivos para todas las variables estudiadas (cuadro 1). Los resultados indicaron que la inducción de nuevos brotes estuvo directamente relacionada con la incorporación de 6 BAP en los medios de cultivo a cualquiera de las concentraciones estudiadas e independientemente del número de subcultivo analizado. Para ambos subcultivos el NB por explante presentó valores superiores a 3 cuando se utilizó cualquiera de las concentraciones de 6 BAP mientras que los medios exentos de esta citoquinina mostraron valores inferiores a 0,5 brotes por explante (cuadro 1). Esto indica la necesidad de incorporar esta citoquinina a los medios de cultivo para la fase de multiplicación del ocumo.

Cuadro 1. Efecto de las concentraciones de N⁶-bencilaminopurina (6­BAP) y el número de subcultivos en la multiplicación in vitro de ocumo (Xanthosoma sagittifolium L. Schott). NB: número de brotes, LB: longitud de los brotes, MT: biomasa fresca total, MB: biomasa fresca de los brotes, MD: biomasa del tejido descartado e IIC: índice de incremento de crecimiento.

El número de brotes fue similar al obtenido por Monge et al. (1987) en la multiplicación de esta misma especie, pero usando kinetina en combinación con ácido indolacético. Se ha reportado el mismo comportamiento en la multiplicación de otras especies como Dionaea muscipula Ellis, conocida con el nombre de atrapamoscas de Venus (Jang et al., 2003) y durazno (Prunus persica L., Kadota y Niimi, 2003).

Sin embargo, los valores encontrados en este ensayo para el NB fueron inferiores a los señalados por Ko et al. (2008), quienes obtuvieron 5,9 brotes por explante en la multiplicación de Colocasia esculenta, otra arácea comestible. Esta diferencia se debió a concentraciones de 6 BAP superiores (8 mg.L^-1) utilizadas por estos autores, en combinación con ácido indolacético (3 mg.L^-1).

Es importante destacar que en otros ensayos realizados (datos no publicados) se pudo observar que a medida que aumentó el número de subcultivos se incrementó el NB, estabilizándose en 4 brotes por explante al utilizar 3 mg.L^-1 de 6-BAP. Al respecto, Rancillac et al. (1987); señalaron que a medida que se aumentó el número de subcultivos hubo una tendencia a incrementar el NB por explante.

La LB fue considerablemente mayor en el segundo subcultivo, con valores superiores a 4 cm para las concentraciones de 2 y 3 mg.L^-1 de 6-BAP (cuadro 1). Este comportamiento posiblemente estuvo relacionado con la activación del crecimiento celular causado por la adición de citoquinina al medio de cultivo (Monge et al., 1987). Con la concentración más alta de 6-BAP (4 mg.L^-1) se produjeron brotes más pequeños que los obtenidos con 3 mg.L^-1, pero de longitud similar a los brotes cultivados con 2 mg.L^-1.

En términos generales hubo una compensación del crecimiento en el segundo subcultivo, para las variables NB y LB; es decir, al compararse con el primer subcultivo el NB se redujo ligeramente, mientras que la longitud se incrementó considerablemente. Por ello, en el segundo subcultivo el crecimiento de los explantes fue más equilibrado entre la cantidad de brotes emitidos y la longitud de los mismos. Lo anterior pudo estar relacionado con lo señalado por Orellana (1998a), quien indicó que las citoquininas incorporadas a los medios de cultivo promovieron el desarrollo de las yemas laterales al contrarrestar la dominancia apical, por lo que la eliminación de la dormancia que presentaron estas yemas en algunas especies, estimula la expansión foliar por efecto del alargamiento celular. Venkatachalam et al. (2007), señalaron que las citoquininas son fitohormonas que intervieron principalmente en la promoción de la división celular, aunque el efecto pudiera variar según el estado de diferenciación de las células, induciendo la formación de órganos, el desarrollo de brotes, estimulando la movilización de nutrientes y la síntesis de clorofila.

El objetivo de la fase de multiplicación es obtener el mayor número de brotes posible; sin embargo, estos brotes deben tener una longitud superior a un centímetro para poder facilitar su manejo al ser subcultivados y para incrementar la tasa de multiplicación, brotes de longitudes inferiores a un cm deben dejarse unidos al explante hasta que estén aptos para crecer independientemente del tejido que les dio origen. En este ensayo se obtuvo una LB que permitió manipular y separar los brotes para ser contabilizados en ambos subcultivos.

La biomasa fresca total, la biomasa fresca de los brotes y el índice de incremento de crecimiento mostraron valores superiores para el segundo subcultivo (cuadro 1) cuando se incorporó la citoquinina en el medio de cultivo (figura 1). Al comparar el segundo subcultivo con respecto al primero, se evidenció que hubo un incremento considerable de la MT y las MB, a diferencia de la biomasa del tejido descartado, la cual mostró sólo un ligero aumento. Esta relación determinó un mayor IIC para el segundo subcultivo en comparación con el primero, especialmente cuando se adiciono la citoquinina en el medio de cultivo.

Las diferencias encontradas para la MT, MB y IIC entre el primer y segundo subcultivo con la adición de 6-BAP, pueden deberse al efecto de adaptación que van experimentando los explantes en los medios de cultivo con reguladores de crecimiento, en el que estos explantes se habitúan a las fitohormonas a medida que se incrementan los subcultivos. Un efecto similar ha sido reportando por Rancillac et al. (1987) para el NB.

Aun cuando las variables de crecimiento MT, MB, MD y IIC pudieran arrojar datos importantes para seleccionar la concentración de fitohormonas apropiada para ser incorporada en los medios de cultivo, son poco estudiadas en la fase de multiplicación, quizás por ser el objetivo primordial la inducción de nuevos brotes (NB). Sin embargo, se encontró que para la multiplicación in vitro de Dioscorea trífida y D. alata, se obtuvieron valores extremadamente bajos de MT (0,68 y 0,60 g respectivamente), en medios de cultivo libres de fitohormonas (Chacón et al., 2000).

Conclusiones

La adición de N⁶ bencilaminopurina en los medios de cultivo es determinante para la inducción de nuevos brotes durante la multiplicación in vitro de ocumo criollo (Xanthosoma sagittifolium L. Schott).

Se evidencio una consistente tendencia al incremento de los valores de las variables de crecimiento (longitud del brote, biomasa fresca total, biomasa del tejido descartado e índice de incremento de crecimiento), para el segundo subcultivo a excepción del número de brotes, el cual mostró un comportamiento similar en ambos subcultivos.

Agradecimiento

Los autores desean agradecer al Ing. Agr. Carlos Fernández por la gentileza de facilitar el material vegetal de ocumo criollo (Xanthosoma sagittifolium L. Schott) para la ejecución de la investigación.

Literatura citada

1. Chacón, A., F. Saborio, L. Gómez, S. Torres y R. Valverde. 2000. El tipo de gelificante en el desarrollo in vitro y la aclimatización de plantas de yampi (Dioscorea trifida) y ñame (Dioscorea alata). Agronomía Costarricense 24(2): 57-64.         [ Links ]

2. Gómez, L., M. Monge, R. Valverde, O. Arias y T. Thorpe. 1989. Micropropagación de tres Aráceas comestibles libres de virus. Turrialba. 39:155 161.         [ Links ]

3. Jang, G, K. Kim y R. Park. 2003. Micropropagation of Venus fly trap by shoot culture. Plant Cell Tissue and Organ Culture 12:95-98.         [ Links ]

4. Kadota, M. y Y. Niimi. 2003. Effects of cytokinn types and their concentrations on shoot proliferation and hyperhydricity in vitro pear cultivar shoots. Plant Cell Tissue and Organ Culture 72:261-265.         [ Links ]

5. Ko, C., J. Kung y R. McDonald. 2008. In vitro micropropagation of white dasheen (Colocassia esculenta). African Journal of Biotechnology 7(1):41-43.         [ Links ]

6. Monge, M., O. Arias y P. Ramírez. 1987. Obtención de plantas de tiquizque blanco (Xanthosoma sagittifolium), de tiquizque morado (Xanthosoma violaceum) y de Ñampi (Colocasia esculenta) libres de virus por medio del cultivo in vitro de ápices. Agronomía Costarricense 11:71-79.         [ Links ]

7. Murashige, T. y F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and biossays with tabaco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15:473-497.         [ Links ]

8. Niba, L.2003. Processing effects on susceptibility of starch to digestion in some dietary starch sources. Int. J. Food Sci. Nutr 54:97-109.         [ Links ]

9. Rancillac, M, J. Nourrissean, C. Navatel y P. Roudillac. 1987. Influence de la multiplication in vitro sur le comportement du plant fraiser en Francia. Acta Horticulturae 212:55-59.         [ Links ]

10. Omokolo, N., T. Boudjeko y J. Tsafack Takadong. 2003. In vitro tuberization of Xanthosoma sagittifolium L. Schott: effects of phytohormones, sucrose, nitrogen and photoperiod. Scientia Horticulturae 9(4):337-345.         [ Links ]

11. Orellana, P. 1998a. Introducción a la propagación masiva. pp 125-133. En: Propagación y mejora genética de plantas por biotecnología. Pérez J. (Ed.). Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central de las Villas, Santa Clara, Cuba.         [ Links ]

12. Orellana, P. 1998b. Propagación vía organogénesis. pp 151-178. En: Propagación y mejora genética de plantas por biotecnología. Pérez J. (Ed.). Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central de las Villas, Santa Clara, Cuba.         [ Links ]

13. Venkatachalam, L., R. Sreedhar y E. Bhagyalakshmi. 2007. Micropropagation in banana using high levels of cytokinins does not involve any genetic changes as revealed by RAPD and ISSR markers. Plant Growth Regulator 51:193-205.         [ Links ]