Vertical transmission of Trypanosoma cruzi in Wistar rats during the acute phase of infection.

    Abstract. Research on this form of transmission was carried out on female rats intradermally injected, before mating, with 1x10⁴ metacyclic trypomastigotes of T. cruzi strains from dog (Pr) and human (YBM). The infected rats, as well as their offspring, were given parasitological, immunological and histopathological examinations during and after gestation. Healthy gestating rats were used as controls. Rats infected with T. cruzi strains showed clear signs of infection between 18 and 45 days post-inoculation (pi). Of 44 offspring from mothers infected with Pr, 4  males (9.1%) showed high parasitemia (432 and 240 tryps./mm³ of blood) at 30 and 40 days after birth, while direct blood examination, hemoculture and xenodiagnosis showed no infection in the other 40, or in the 52 offspring of rats infected with YBM. Anti-T. cruzi antibodies were found in appreciable quantities in infected mothers and in 44 out of 92 (47.8%) of the offspring, with titers that fluctuated between 1:32 and 1:2048 respectively. Histopathological studies of rats sacrificed at the end of gestation showed acute myocarditis and myositis of varying intensity and extent, characterized by abundant inflammatory infiltrate, in some cases associated with nests of amastigotes. The placentas showed moderate cellular infiltrate without parasites in the vascular strome and amniotic fluid. The offspring of mothers infected with Chagas’ disease were reinoculated and showed an acute phase characterized by low parasitemia (p<0.05); after 60 days, the beginnings of chronic myocarditis and myositis could be observed, of a similar intensity to that observed in offspring born to infected mothers that were subsequently infected. These results confirm that T. cruzi can be transmitted vertically in Wistar rats; that a small number of offspring contract chagasic infection congenitally; that anti-T. cruzi antibodies can pass from the mother and that these can modify the immune response in the offspring; that the pathogenicity of the strains of T. cruzi plays an important role in congenital transmission independently of origin or geographical location. 

Key words: Trypanosoma cruzi, congenital transmission, Wistar rats, acute infection. 

Recibido: 26-11-2002. Aceptado: 10-06-2003. 

INTRODUCCIÓN 

    Después del descubrimiento de Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas, se sugirió que la transmisión del parásito de la madre al feto podía estar ocurriendo congénitamente (1) o a través de la leche materna (2). En 1949, Dao (3) observó, por primera vez en Venezuela, T. cruzi en sangre periférica de un niño recién nacido de madre chagásica y, desde entonces, se han publicado numerosos casos en diferentes países de América Latina (4-9), donde la prevalencia de la infección en mujeres embarazadas oscila entre 2 y 51% en centros urbanos y de 23 a 81% en áreas endémicas para la enfermedad de Chagas (10); sin embargo, la significación epidemiológica de estos mecanismos de transmisión no han sido lo suficientemente establecidos. 

    Recientemente, Bittencourt (11) señaló que la transmisión vertical de la infección chagásica se produce en cualquier fase de la infección materna y sostiene que el riesgo de transmisión de T. cruzi es mayor en la fase aguda por la presencia de parásitos circulantes en la madre gestante. Señala la autora que las formas sanguícolas alcanzan al embrión por vía hematógena, luego del pasaje por un mecanismo activo a través de la placenta. En las células de Hofbauer los tripomastigotes se transforman en amastigotes, los cuales se multiplican activamente y en seguida se transforman hasta ser liberados nuevamente como tripomastigotes, después de la ruptura celular y luego atraviesan el trofoblasto produciendo la infección del feto. Este pasaje, probablemente se debe a una placentitis provocada durante la multiplicación de los parásitos o por la penetración activa hacia la circulación fetal. En algunos casos, los fetos pueden contaminarse al aspirar porciones de líquido amniótico infectado con parásitos (12) o por la vía bucal en humanos a través de la leche materna durante la lactancia (2, 13). 

    Mayer y Rocha-Lima (14) formularon la hipótesis de la transmisión placentaria al encontrar nidos de leishmaniodes de T. cruzi en las placentas de cobayos experimentalmente infectados, sin observar alteraciones en las crías. A partir de ese momento, otras investigaciones han demostrado en animales de laboratorio la transmisión de T. cruzi tanto por vía transplacental como durante el amamantamiento a un reducido número de crías, cuando las madres son inoculadas con grandes cantidades de formas sanguícolas. Aunque el espectro patológico observado en las crías con infección congénita es muy parecido al que predomina en el hombre, no se corresponde con lo que realmente ocurre en la naturaleza (15-20). 

    En este trabajo, se consideró de importancia epidemiológica investigar si la transmisión vertical del parásito se da en el modelo experimental rata albina (Rattus norvegicus) cepa Wistar, cuando se inocula por vía intradérmica un número relativamente bajo de tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi de diferente origen y antes del apareamiento de las ratas. En estos animales el curso de la infección aguda fue seguido durante y después de la gestación mediante un estudio parasitológico, inmunológico e histopatológico en las ratas madres infectadas y en su progenie. Además, se investigó el efecto de una reinoculación homóloga de formas metacíclicas de T. cruzi sobre las crías nacidas de madres con infección chagásica aguda. 

MATERIALES Y MÉTODOS 

Cepas de T. cruzi 

    Se utilizaron dos cepas de T. cruzi, una obtenida por xenodiagnóstico y hemocultivo a partir de una paciente de 2 años en fase aguda de la enfermedad de Chagas (M/HOM/VE/92/YBM) y la otra de un perro naturalmente infectado (M/CAN/VE/94/ Pr). Ambas cepas, aisladas por el Dr. Nestor Añez, proceden de áreas endémicas para la enfermedad de Chagas, localizadas en el piedemonte oriental de la Cordillera de los Andes en el Estado Barinas, Venezuela, y caracterizadas desde un punto de vista biológico y bioquímico por Moreno y col. (21). 

Grupos experimentales e inoculación 

    En el presente estudio se usaron un total de 30 ratas Wistar hembras de 3 meses de nacidas y 250 g de peso, las cuales fueron separadas en tres grupos. Dos grupos de 9 animales cada uno fueron inoculados por vía intradérmica (ID), un grupo con aproximadamente 1×10⁴ tripomastigotes metacíclicos (tpm) de la cepa YBM y el otro con un inóculo similar de formas metacíclicas de la cepa Pr. Los parásitos fueron obtenidos de las excretas postprandiales de ninfas del V estadío de Rhodnius prolixus, las cuales habían sido experimentalmente infectadas por ingesta sanguínea sobre ratones NMRI donadores con altas parasitemias infectados con esas cepas. Las excretas fueron homogenizadas en solución fisiológica salina y cuantificadas, siguiendo el método modificado por Brener (22). El tercer grupo de 12 ratas sanas fue utilizado como grupo control. Estos animales fueron inyectados por vía intradérmica con 0,1 mL de solución fisiológica salina. 

    Entre los 10 y 12 días post-inoculación (pi), a todos los grupos de ratas les fue determinado el ciclo estral, luego fueron apareadas con los machos en una relación de 2 hembras/1 macho por jaula. Las ratas infectadas y las controles sanas ya preñadas, fueron mantenidas en jaulas individuales en el bioterio experimental alimentadas con ratarina comercial y agua ad libitum. 

Evaluación parasitológica 

    En los dos grupos de ratas infectadas con las cepas de T. cruzi YBM y Pr, la parasitemia fue cuantificada (22) durante el período de gestación y después del parto normal, utilizándose cada vez 5 mm³ de sangre, extraída con capilares heparinizados por punción del plexo retro-orbital a los 12, 18, 24, 30, 45 y 60 días pi. 

    Inmediatamente después del parto, 2 ratas madres infectadas con la cepa YBM y dos ratas de las infectadas con la cepa Pr, fueron sacadas de las jaulas sin tocar las crías y sustituidas por ratas sanas recién paridas. A los 30 y 40 días después del nacimiento, a todas las crías se les practicó un examen parasitológico directo en las muestras de sangre obtenida de la cola de cada animal. 

Hemocultivo y xenodiagnóstico 

    A las crías que resultaron negativas al examen de sangre se les practicaron exámenes parasitológicos indirectos a fin de detectar parasitemias ocultas o subpatentes. Para tal fin, 0,3 mL de sangre obtenida por cardiopuntura de cada animal, fue mezclada con citrato de sodio al 3,8%, esta suspensión sanguínea fue inoculada en tubos con medio de cultivo NNN más solución fisiológica salina como fase líquida. Los hemocultivos, mantenidos en estufa a 26°C, fueron revisados a los 15 y 30 días después de la inoculación. 

    Para el xenodiagnóstico se utilizó, por cada animal, 10 ninfas del IV estadio de R. prolixus; las crías juveniles fueron inmovilizadas por una cubierta de malla de plástico y colocadas sobre un recipiente que contenía en su interior las ninfas. Una vez que las ninfas se alimentaron hasta la repleción, los recipientes con los insectos fueron debidamente identificados y mantenidos a 26°C y 75% humedad relativa en el insectario experimental. A los 30 días después de la ingesta sanguínea los triatominos fueron examinados individulamente, obteniéndose el material fecal por compresión abdominal de cada insecto; las heces fueron homogenizadas con solución salina y examinadas al microscopio con el objeto de detectar formas flageladas de T. cruzi. 

Estimación de la respuesta inmune humoral 

    Este estudio serológico se efectuó con la finalidad de detectar anticuerpos (Ac) específicos anti-T. cruzi en los sueros de las madres infectadas y en su progenie. El suero sanguíneo de cada animal fue obtenido a partir de la sangre, que fue extraída por punción del plexo retro-orbital con capilares heparinizados; la sangre fue mantenida en nevera a 4°C por una hora para permitir su coagulación. Una vez retraído el coágulo, los sueros fueron separados por centrifugación, colocados en viales de plástico y almacenados a -21°C hasta su uso. Los Ac anti-T. cruzi fueron detectados en los sueros de las madres infectadas y de las crías juveniles con más de 40 días de nacidas mediante la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) (23). El antígeno utilizado correspondió a las formas de cultivo de T. cruzi YBM y Pr colectados en fase exponencial de crecimiento en el medio de cultivo NNN. 

Examen del líquido amniótico y estudio histopatológico 

    Se llevó a cabo en 3 ratas inoculadas con la cepa YBM y en 3 ratas con la cepa Pr, con 30 días de infección chagásica y a término de la gestación, y en 2 ratas gestantes sanas. Los animales fueron sacrificados por sobreanestesia con éter dietílico. De cada rata se extrajo cuidadosamente el útero grávido separándolo por debajo del antro, al nivel del fondo de la vagina y extrayendo con él los cuernos uterinos con los fetos y los respectivos oviductos y ovarios. El útero con sus anexos se extendió sobre una cápsula de Petri para ser lavado con solución fisiológica salina, a fin de eliminar los restos de sangre proveniente de las venas uterinas. Con una pipeta Pasteur se hizo una pequeña insición sobre la membrana uterina a nivel de los fetos y se extrajo una muestra de líquido amniótico la cual fue examinada bajo el microscopio para la búsqueda de tripomastigotes. Las insiciones fueron ampliadas para extraer los fetos con sus placentas. 

    El corazón cortado frontalmente, fragmentos de músculo esquelético y las placentas de las ratas madres infectadas y controles sanas, fueron fijados en formalina neutra al 10% durante 48 horas e incluidos en Paraplast (Monoject Scientific, St. Louis, MO. USA). Los cortes histológicos de 6 mm de espesor de cada uno de los órganos antes mencionados se realizaron en un microtomo American Optical Spencer y se colorearon por el método de Giemsa-Pappenheim-colofonio (24) y hematoxilina-eosina (HE), para evidenciar la infección tisular y las alteraciones histopatológicas. Igualmente, fueron sacrificadas por sobreanestesia con éter dietílico las crías juveniles de 45 días de nacidas provenientes de madres chagásicas, las crías sanas amamantadas sobre ratas infectadas y las crías controles de madres sanas. El corazón completo y fragmentos de la musculatura esquelética fueron procesados para el estudio histopatológico, como se describió antes. 

Efecto de la reinoculación homóloga
con T. cruzi 

    Con el objeto de investigar el posible efecto de la inoculación de parásitos homólogos sobre las crías de madres chagásicas, se utilizó en este experimento 10 ratas machos juveniles de 45 días de nacidas, provenientes de madres infectadas con la cepa Pr de T. cruzi y 5 machos juveniles nacidos de madres sanas. Estos animales fueron inoculados por la vía ID con aproximadamente 1x10⁴ tpm, derivados de ninfas de R. prolixus. El curso de la infección aguda en cada uno de los animales inoculados fue seguido mediante la detección de parasitemias patentes (22) en muestras de 5 mm³ de sangre obtenida de la cola de cada animal a los 12, 18, 24, 30, 45 y 60 días pi. Las diferencias entre la parasitemia obtenida de las crías nacidas de madres chagásicas y las crías nacidas de madres sanas fueron determinadas por el Test de t de Student. A los 60 días pi, todos los animales fueron sacrificados por sobreanestesia con éter dietílico y el corazón completo y fragmentos de músculo esquelético fueron removidos y procesados para el estudio histopatológico en cortes coloreados con Giemsa-Colofonio y HE. 

RESULTADOS 

Evaluación parasitológica de las ratas madres 

    Los exámenes parasitológicos directos realizados a las muestras de sangre de las 12 ratas infectadas con las cepas YBM y Pr de T. cruzi durante el curso de la infección aguda y en el período de gestación, revelaron parasitemias patentes entre los 18 y 45 días pi, detectándose a los 24 y 30 días pi (12 y 18 días de la gestación) niveles de parasitemias de hasta 28 ± 5 trips./mm³ de sangre en las ratas infectadas con la cepa Pr y 17 ± 3 trips./mm³ de sangre en las inoculadas con la cepa YBM. En la observación correspondiente a los 45 días pi, se constató una disminución en los niveles de la parasitemia y solamente dos ratas infectadas con la cepa Pr presentaron una muy baja parasitemia de 2 ± 1 trips./mm³ de sangre. En las muestras de sangre revisadas a los 60 días pi no se observaron parásitos (Fig. 1). 

Fig. 1. Curvas de parasitemia en ratas infectadas con Trypanosoma cruzi.

Evaluación parasitológica de las crías 

    Los exámenes de sangre realizados a las crías a los 30 días y a los 40 días de nacidas, mostraron un número relativamente escaso de animales infectados. Cuatro crías machos (9,1%) de un total de 44 (19 machos y 25 hembras) provenientes de ratas inoculadas con la cepa Pr y amamantadas hasta el destete por sus madres biológicas, presentaron parasitemias patentes en niveles que oscilaron entre 432 y 240 trips./mm³ de sangre, mientras que en las 40 crías restantes y las 13 crías de madres sanas (6 machos y 7 hembras) que fueron amamantadas sobre madres infectadas, no se evidenció presencia de parásitos en la sangre. Los exámenes de sangre efectuados a las 52 crías juveniles (24 machos y 28 hembras) provenientes de las ratas infectadas con la cepa YBM y amamantadas hasta el destete por sus madres biológicas y por nodrizas, y las 12 crías de madres sanas (5 machos y 7 hembras) amamantadas por las madres infectadas, resultaron negativas. 

Evaluación parasitológica del líquido amniótico 

    El examen directo de las muestras de líquido amniótico, obtenidas del saco uterino de las ratas madres infectadas con las cepas YBM y Pr de T. cruzi y sacrificadas a término de la gestación, no mostraron parásitos. 

Alteraciones histopatológicas 

    El estudio histopatológico de los cortes de corazón y de los fragmentos del músculo esquelético de las ratas chagásicas sacrificadas a término de la gestación, así como de los tejidos obtenidos de las crías con infección chagásica congénita, reveló moderada miocarditis y miositis aguda de variable intensidad, con áreas de inflamación focalizadas de naturaleza linfoplasmohistiocitario y discreta parasitosis en la masa muscular (Fig. 2A B). El examen microscópico de los cortes de las placentas no mostró parasitismo en las células trofoblásticas ni alteraciones histopatológicas apreciables, sólo se observaron focos inflamatorios agudos a nivel de las vellosidades, constituyendo cuadros de vellositis de variable intensidad. Algunos cortes del corazón y músculo esquelético de las 82 crías juveniles, nacidas de madres chagásicas y de las 25 crías de madres sanas amamantadas por madres infectadas, mostraron discretos focos inflamatorios y ausencia de parasitismo tisular. Los cortes del corazón, músculo esquelético y las placentas de madres sanas no presentaron alteraciones histopatológicas. 

Evaluación de la reinoculación homóloga en las crías 

    El seguimiento del curso de la infección en las crías nacidas de madres con infección chagásica aguda y reinoculadas con formas metacíclicas de T. cruzi Pr, mostró infecciones patentes evidenciadas por la presencia de parásitos en la sangre de estos animales entre los 18 y 45 días pi. A partir de los 24 días pi, los niveles de parasitemia de las crías infectadas provenientes de madres chagásicas fueron significativamente menores que los detectados en las crías infectadas nacidas de madres sanas (p<0.05) (Fig. 3). A los 60 días pi, el estudio histopatológico del corazón y fragmentos de músculo esquelético de las crías reinoculadas con T. cruzi, reveló ausencia de parasitismo, presencia de epicarditis focal, destrucción de algunos vasos sanguíneos, fibras musculares con hialinización y formación de fibrosis, originado así una miocarditis y miositis con características de cronicidad similar en intensidad y extensión a la observada en las crías nacidas de madres sanas que fueron infectadas. 

DISCUSIÓN 

    La rata albina (R. norvegicus) como modelo experimental ha sido ampliamente utilizada en el estudio de la infección chagásica y siendo un animal susceptible a la infección por T. cruzi, desarrolla una miocarditis aguda con intensa parasitosis cardíaca, alta parasitemia y mortalidad nula, pasando luego a una fase de latencia con sobrevida comparable a la de los controles normales (25, 26). 

    Las investigaciones experimentales sobre la transmisión congénita de T. cruzi en estos animales fueron iniciadas por Apt y col. (27), quienes informaron que a pesar de obtener infección en las ratas madres, no observaron infección congénita en sus crías, lo que podría deberse a la resistencia natural de la rata a la infección por T. cruzi. Shaw y Quadagno (28) señalan que en ratas hembras gestantes, la infección por T. cruzi causa poco o ningún efecto sobre la capacidad reproductiva y las ratas chagásicas pueden parir crías aparentemente normales. En este mismo orden de ideas, investigaciones más recientes llevadas a cabo por Dávila y col. (18) en ratas endogámicas infectadas con 1x10⁶ tripomastigotes sanguícolas de T. cruzi durante la gestación, demostraron que 5/67 (7,5%) de las crías procedentes de madres infectadas presentaban parasitemias patentes y 5/15 hemocultivos obtenidos de crías estaban positivos, concluyendo que la transmisión materna ocurre en este modelo animal. Por otro lado, en ratones C3H (29) y monos (30) también se ha observado transmisión congénita a un número reducido de crías. 

    En el presente trabajo se demuestra que la inoculación de un número relativamente bajo de formas metacíclicas de T. cruzi de diferente origen, por la vía ID, produce infecciones de variable intensidad en el modelo experimental rata Wistar, caracterizada por bajas parasitemias, apreciables títulos de Ac anti-T. cruzi y moderadas alteraciones histopatológicas en el corazón, músculo esquelético y placentas de las ratas sacrificadas a término de la gestación. En las crías nacidas y amamantadas por las madres biológicas infectadas con la cepa Pr de T. cruzi, se evidenció la transmisión transplacentaria del parásito a un número significativo de crías machos (9,1%), mientras que las crías provenientes de madres infectadas con la cepa YBM de T. cruzi de origen humano, resultaron negativas, a pesar de ser considerada por Moreno y col. (21) como una cepa de alta virulencia y patogenicidad. Estos resultados confirman las observaciones publicadas por Andrade y col. (31) y Delgado y Santos-Buch (17), quienes señalaron que cepas de T. cruzi de diferente origen, presentan distinto tropismo por la placenta, por lo que la transmisión congénita depende de la cepa del parásito y de la capacidad fagocítica de los macrófagos de las vellosidades placentarias. La virulencia y patogenicidad de las cepas de T. cruzi juega un papel importante en la transmisión congénita, independientemente del origen y de la región geográfica (17, 31). 

    En cuanto al efecto de la reinoculación homóloga de T. cruzi Pr sobre las crías nacidas de madres infectadas, los resultados mostraron cierta resistencia en el desarrollo de la infección aguda, la cual fue evidenciada en parte por los bajos niveles de parasitemia registrados. El estudio histopatológico de los corazones y fragmentos de la musculatura esquelética, reveló la implantación de una miocarditis y miositis con característica de cronicidad similar en intensidad y extensión a la observada en las crías controles infectadas. Estos hallazgos concuerdan con la opinión de varios autores en el sentido de que los anticuerpos maternales anti-T.cruzi transferidos por vía transplacental y por la leche materna, le confieren a la progenie un cierto grado de protección contra las infecciones por T. cruzi (28, 29, 36, 37). 

    Finalmente se concluye que la asociación rata Wistar-T. cruzi, es un modelo experimental adecuado para reproducir el cuadro evolutivo de la transmisión congénita de la enfermedad de Chagas. 

AGRADECIMIENTOS 

    Al Consejo de Desarrollo Científico, Humanístico y Tecnológico de la Universidad de los Andes por el apoyo financiero a través de los Proyectos C-909-98-03A; C-910-98-03C; C-1011-00 - 03A, C-1012-00-03B y C-1049-00-03C. Al Insectario de Cría “Dr. Herman Lent” del Departamento de Biología de la Facultad de Ciencias, por el suministro de las ninfas de R. prolixus. Al Prof. Iane Woodward del Departamento de Idiomas, Facultad de Humanidades y Educación de la Universidad de los Andes. 

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