Importancia de la respuesta humoral de IgG anti-CagA de Helicobacter pylori en pacientes venezolanos con enfermedades de las vías digestivas superiores. 

Marianella Perrone¹, Leopoldo Muñoz², Margarita Camorlinga², María Correnti^1,3, María Eugenia Cavazza⁴, Vicente Lecuna⁵ y Javier Torres². 

¹Coordinación de Investigación, Instituto de Investigaciones Odontológicas, Facultad de Odontología, Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela. ²Unidad de Investigación en Enfermedades Infecciosas, Coordinación de Investigación, IMSS. Ciudad de México, México. ³Instituto de Oncología y Hematología. ⁴Instituto de Biomedicina. Ministerio de Salud y Desarrollo Social. Caracas, Venezuela y ⁵Hospital Clínico Universitario, Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela. Correo electrónico: mperrone@cantv.net. 

Resumen. La infección por Helicobacter pylori está asociada actualmente con diferentes formas de enfermedades digestivas, incluyendo gastritis, úlceras duodenales, gástricas y linfomas del tipo Maltoma.El microorganismo es considerado como un importante factor de riesgo para el desarrollo de cáncer gástrico. El objetivo de este estudio fue caracterizar la respuesta inmune sérica de Inmunoglobulina G (IgG), contra los antígenos CagA, ureasa y extracto total de Helicobacter pylori, en un grupo de pacientes con diferentes formas de enfermedad de las vías digestivas superiores. Fueron evaluados 66 pacientes sintomáticos referidos para examen endoscópico, provenientes del Servicio de Gastroenterología del Hospital Universitario de Caracas, Venezuela. La respuesta inmune fue evaluada mediante ensayo inmunoabsorbente (ELISA) usando antígenos recombinantes para Ureasa y CagA. La infección por Helicobacter pylori fue determinada por el cultivo de las biopsias gástricas y prueba de ureasa. Los resultados mostraron la presencia de H. pylori en 48/66 (72,7%) pacientes mediante cultivo microbiológico y prueba de ureasa. De los 66 pacientes evaluados en este estudio, 45 (68%) fueron positivos para el extracto total de H. pylori, 34/66 (51%) presentaron anticuerpos contra CagA y 18/66 (27%), tuvieron anticuerpos anti-ureasa. La tasa de positividad de anticuerpos anti-CagA en pacientes con úlcera gástrica, cáncer gástrico, y gastritis crónica fue de 87,8%, 77,7% y 40,8% respectivamente. Del presente estudio se puede concluir que los niveles de anticuerpos anti-Cag A y anti extracto total fueron similares para pacientes con enfermedad gastroduodenal severa, incluyendo, úlcera gástrica y adenocarcinoma. 

Palabras clave: Helicobacter pylori, seroprevalencia, CagA. 

Importance of IgG anti-CagA antibodies of Helicobacter pylori in Venezuelan patients with gastric diseases.

Abstract. Helicobacter pylori is one of the most common bacterial infections worldwide. It is associated with chronic gastritis, peptic ulcer disease and constitutes a major risk factor for gastric adenocarcinoma and lymphoma. The aim of this study was to evaluate the specific serologic immunoglobulin G (IgG) response to whole cells proteins, CagA and urease antigens of Helicobacter pylori in a Venezuelan population. We evaluated 66 patients from the Hospital Universitario de Caracas, attending in the gastroscopy service. H. pylori infection was detected by culture and rapid urease test. IgG antibodies against CagA and ureases were tested by enzyme-linked immunosorbent assay method using highly purified recombinant antigens. We demonstrated the presence of H. pylori in 48/66 (72,7%), by culture and rapid urease test. We found a seroprevalence of 45 (68%) to whole cells, 34/66 (51%) to CagA and 18/66 (27%) to urease. The positive rates of CagA antibodies in patients with gastric ulcer, gastric cancer and chronic gastritis were 87,8%, 77,7% y 40,8% respectively. The serum antibodies anti-CagA were similar between peptic ulcer disease and gastric cancer patients. 

Key words: Helicobacter pylori, seroprevalence, CagA. 

Recibido: 29-10-2004. Aceptado: 06-05-2005. 

INTRODUCCIÓN 

Helicobacter pylori es un importante patógeno humano que causa gastritis crónica y está asociado con el desarrollo de úlcera péptica, y gastritis atrófica. Este microorganismo es considerado como el principal factor de riesgo para el desarrollo de cáncer gástrico y linfomas tipo MALT (1-5). Sin embargo, la enfermedad sólo ocurre en el 15% de las personas infectadas, siendo influenciada su aparición, por la virulencia del la cepa bacteriana infectante, la susceptibilidad genética del hospedero y la presencia de cofactores ambientales (6-7) 

La bacteria tiene una gran variabilidad genética, evidenciada por estudios de genotipos y secuenciación de ADN (8, 9) Recientemente se han descrito genes bacterianos específicos que están asociados con la virulencia de las especies bacterianas (10-12). 

La interacción entre la bacteria y el hospedero, es un factor clave que determina las consecuencias clínicas de la infección por H. pylori. A este respecto, el sistema inmune juega un papel importante en prevenir o promover la enfermedad (13). 

Entre los factores de virulencia bacterianos responsables de las manifestaciones clínicas, están las adhesinas (BabA, SabA), la citotoxina vacuolizante VacA, y los productos de la isla de patogenicidad Cag. Los patrones de producción de citoquinas en la respuesta a la infección por H. pylori constituyen uno de los principales factores derivados del hospedero, que pueden limitar el desarrollo de la infección a una gastritis, o favorecer el desarrollo de úlcera péptica y cáncer gástrico. 

El polimorfismo de algunos genes de citoquinas (IL-1b, IL,6, IL8, IL10, IL-1RN, FNTa, Interferon-ganma) han sido correlacionados con el desarrollo de úlcera péptica y adenocarcinoma asociado a H. pylori y, posiblemente estos puedan estar influenciados por la cantidad de citoquinas producidas como respuesta a la infección persistente (14-16). Estas investigaciones concluyen que los factores de virulencia bacteriana, conjuntamente con una producción incrementada de citoquinas inflamatorias, puede ser relevante en la fisiopatología gástrica de las enfermedades producidas por H. pylori. 

Aproximadamente entre un 60% a 70% de los aislados de H. pylori contiene un gen denominado cagA (gen asociado a la citotoxina), que codifica para una proteína de 128 kDa denominada CagA (17). La presencia de CagA está relacionada con la ulceración duodenal, atrofia de la mucosa gástrica y cáncer gástrico (18, 19). Este gen representa una parte de una gran entidad genómica denominada isla de patogenicidad, (17) la cual contiene múltiples genes relacionados con la virulencia y patogenicidad de los aislados de H. pylori. 

La presencia de CagA pude ser considerada como un marcador de la isla de patogenicidad, que está relacionada con una mayor virulencia de las cepas que la presenten (20). Algunos autores han propuesto que la presencia de este marcador está relacionada con formas más severas de enfermedad gástrica en el adulto (21). Sin embargo, otros reportes indican que una alta prevalencia del gen cagA, es encontrada independientemente del tipo de enfermedad desarrollada (22-24). 

Los pacientes infectados con cepas CagA positivas de H. pylori han demostrado una expresión aumentada de varias citocinas (25) y consecuentemente tienen un grado más elevado de inflamación gástrica y un daño acelerado del epitelio (18). Por ello ha surgido un creciente interés en detectar el inmunofenotipo de H. pylori, y en particular el estado de CagA y VacA. 

Al respecto, algunos estudios han demostrado la importancia clínica de la detección de anticuerpos específicos anti-CagA usando ensayos no comerciales (26-30), mientras que otros autores han fallado al confirmar estos hallazgos (31-34). 

H. pylori puede ser diagnosticado mediante análisis de biopsias gástricas por pruebas de ureasa, cultivo de la bacteria, histopatolología, o detección del ADN bacteriano por la reacciona en cadena de la polimerasa (RCP). Los métodos diagnósticos no invasivos incluyen los ensayos serológicos, mediante los cuales es posible medir los niveles de anticuerpos contra H. pylori (35, 36) 

Con respecto a los genotipos cagA de H. pylori, estos pueden ser identificados mediante métodos moleculares, usando cultivo de los aislados o directamente de las biopsias gástricas, pero en ambos casos se requiere de un método invasivo como lo es la endoscopia. De esta forma la detección serológica de infección con cepas de H. pylori productoras de CagA mediante inmunoensayos (ELISA), es el único método no invasivo disponible hasta el presente que permite determinar el potencial de virulencia de la cepa infectante y el posible riesgo de enfermedad. 

El objetivo de este estudio fue determinar la respuesta inmune sérica de inmunoglobulina G (IgG), contra dos de los más importantes antígenos de H. pylori, CagA y la proteína ureasa, en pacientes con enfermedad de las vías digestivas superiores. Estos antígenos fueron seleccionados debido a que en el caso de Cag, este constituye un importante marcador de la presencia de la isla de patogenicidad. Con respecto a la ureasa, esta enzima es responsable de neutralizar la acidez gástrica producida posterior a la colonización de H. pylori a nivel de la mucosa gástrica. 

MATERIALES Y MÉTODOS 

Se realizó un estudio prospectivo evaluando 66 pacientes, 35 pertenecientes al sexo femenino y 31 al masculino, con edades comprendidas entre 19 y 72 años y una edad promedio de 43 años, provenientes del Servicio de Gastroenterología del Hospital Clínico Universitario de Caracas, Venezuela, en el período comprendido entre Julio de 1998 y Octubre del 2001. Estos fueron referidos para examen endoscópico por presentar enfermedad de las vías digestivas superiores. Se les presentó el consentimiento informado a cada uno de ellos y el protocolo de experimentación fue previamente aprobado por el comité de ética del FONACIT, Venezuela. A cada sujeto se le realizó una detallada historia clínica y se le pidió firmar la carta de consentimiento para participar en el protocolo. Los criterios de exclusión del presente trabajo fueron: tratamiento con antibióticos y compuestos que contuviesen bismuto u omeprazol, durante dos semanas previas al examen. 

A cada uno de los pacientes se le tomó una muestra de sangre venosa previo a la realización de la endoscopia. El suero fue separado por centrifugación y mantenido a –20°C hasta el momento de su procesamiento. Igualmente se tomaron dos biopsias del antrum por cada paciente, para la realización del cultivo microbiológico y otros ensayos. 

Las biopsias fueron homogenizadas e inoculadas en un medio selectivo (placas de agar Columbia, suplementadas con 7% de sangre). Las placas fueron incubadas a 37°C en una atmósfera de CO₂ por 10 días. Las colonias con una morfología sugestiva de H. pylori fueron confirmadas con coloración de Gram, y las pruebas de ureasa, catalasa y oxidasa 

La infección por H. pylori fue detectada por los niveles de anticuerpos IgG específicos contra antígenos de H. pylori, mediante Ensayo inmunoabsorbente (ELISA), siguiendo el protocolo de Camorlinga-Ponce y col. (37) el cual fue validado previamente. 

Para ello se obtuvo un sedimento celular de cinco aislados de H. pylori para preparaciones de antígenos, los cuales fueron obtenidos por sonicación, posterior centrifugación a 13.000 g y recuperación del sobrenadante. Las placas se sensibilizaron con una concentración de 0.5 µg de proteínas por pozo. Las muestras de suero se analizaron por duplicado (diluidas 1:1000) y colocando alícuotas de 100 µL en cada pozo. 

Posteriormente se adicionó a cada pozo de la placa, 100 µL a una dilución 1:1000 del conjugado anti-IgG acoplado a fosfatasa alcalina (Southern Biotech, Birmingham, Ala). Luego de la incubación se agregó 1 mg/mL de solución de p-nitrofenilfosfato. La absorbancia fue medida a 405 nm en el lector de ELISA. 

La IgG anti-ureasa fue determinada por ensayo inmunoabsorbente, siguiendo el protocolo antes referido (37). La preparación de antígeno de ureasa (gentilmente cedida por Acambis, Inc., Cambridge, Mass.), fue un recombinante de la apoenzima ureasa, antigénicamente similar a la ureasa nativa, con idéntico peso molecular y estructura (34). 

Las placas fueron sensibilizadas con 0,5 µg por pozo de ureasa, y las muestras de suero fueron añadidas por duplicado a una dilución de 1:400. Luego se adicionaron 100 µL del conjugado anti-IgG humano, acoplado a la fosfatasa alcalina, a una dilución de 1:1000. Después de la incubación se agregó el sustrato de la fosfatasa (p-nitrofenilfosfato). Las muestras fueron leídas en el lector de ELISA a una absorbancia de 405 nm. 

Se usó el protocolo de ELISA previamente validado de Camorlinga-Ponce y cols (37), para determinar la IgG anti-CagA. De esta forma, 0,1 µg de antígeno del péptido CagA recombinante (PM 60 kDa) (Acambis, Inc) fue empleado para sensibilizar las placas. Posteriormente se adicionaron 100 µL del suero por duplicado, a una dilución de 1:200. 

Se procedió a la incubación con el anticuerpo secundario. 100 µL del conjugado anti-IgG humano acoplado a fosfatasa alcalina a una dilución de 1:1000. Ulteriormente se procedió a incubar la placa, luego de lo cual fue añadido el sustrato de la enzima fostatasa alcalina (1mg/mL de solución de p-nitrofenilfosfato). La absorbancia fue leída a 405nm en el lector de ELISA. 

Los resultados de cada muestra de suero fueron expresados como la razón del valor de la densidad óptica de la muestra problema entre el umbral del valor y fue expresada en unidades de densidad óptica. Las muestras de suero con unidades de DO >1.0 fueron consideradas seropositivas. 

Las diferencias en la frecuencia de la respuesta inmune fueron analizadas mediante la prueba de Fisher con corrección de Yate’s. Las diferencias en la magnitud de la respuesta inmune entre los diferentes grupos fueron estudiadas usando la prueba del la t de Student. 

RESULTADOS 

En el presente estudio fueron evaluados 66 pacientes, de los cuales 48 (72,7%), fueron positivos para la infección por Helicobacter pylori, tanto por el cultivo como por la prueba de ureasa. En lo referente a hábitos, de los 48 pacientes positivos para la infección por H. pylori por la prueba de ureasa y el cultivo, 38/48 (79%) eran no fumadores, mientras que 10/48 (21%), eran fumadores. Con respecto al consumo de alcohol, de estos pacientes positivos, 40/48 (83,3%), no consumían alcohol, y 8/48 (16,6%) ingerían alcohol. 

De los 66 pacientes evaluados en este estudio, 45 (68%) fueron positivos para el extracto total de H. pylori, 34/66 (51%) demostraron la presencia de anticuerpos contra CagA y 18/66 (27%), tuvieron anticuerpos anti-ureasa. 

Es importante referir que 3 de las muestras positivas por cultivo y ureasa no fueron detectadas por serología para el extracto total de la bacteria pero si para Cag A. Así mismo, 4 casos negativos tanto por cultivo como por ureasa, 3 de ellos con el diagnóstico clínico de cáncer gástrico fueron positivos para IgG sérica anti-extracto total y anti-CagA. 

La respuesta de IgG sérica contra los antígenos CagA ureasa y extracto total de H. pylori en relación al diagnóstico clínico de los pacientes está representada en la Tabla I, donde es posible evidenciar que un porcentaje mayor de pacientes con úlcera gástrica y adenocarcinoma presentan una respuesta de IgG sérica para todos los antígenos evaluados en comparación al grupo de pacientes con gastritis crónica, aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas.

TABLA I

RESPUESTA DE IGG SÉRICA CONTRA LOS ANTÍGENOS CAG A, UREASA Y EXTRACTO TOTAL DE Helicobacter pylori, EN RELACIÓN CON EL DIAGNÓSTICO CLÍNICO DE LOS PACIENTES 

La magnitud de la respuesta de IgG sérica anti CagA y anti-ureasa está representada en la Tabla II. Se observó que la magnitud de la respuesta fue significativamente más elevada para IgG sérica anti-CagA y la IgG anti-Hp extracto total, en comparación con la respuesta IgG anti-ureasa (p < 0,001).

TABLA II

MAGNITUD DE LA RESPUESTA DE IGG SÉRICA, ANTI-EXTRACTO TOTAL, ANTI-CAGA Y ANTI-UREASA EN UNA MUESTRA DE LA POBLACIÓN VENEZOLANA 

DISCUSIÓN 

Estudios epidemiológicos han demostrado que la infección por H. pylori tiene una distribución mundial y aunque aproximadamente un 80% de los pacientes no desarrolla una enfermedad severa, un grupo de individuos puede sufrir una infección persistente convirtiéndose en crónica (7). 

La prevalencia de la infección por este microorganismo, varía notablemente en todo el mundo, con una tasa del 40 al 50% en los países desarrollados y cerca del 90% en aquellos países en vías de desarrollo. El modo de transmisión de H. pylori es ampliamente discutido (31). Aunque algunas evidencias sugieren que esta ocurre predominantemente por contacto de persona a persona, otros autores proponen la vía fecal-oral. Más recientemente ha sido sugerido que la bacteria puede existir de forma natural en el ambiente (32). 

Numerosos estudios han reportado la asociación de H. pylori con una variedad de enfermedades gastrointestinales incluyendo gastritis crónica, úlcera péptica, y gastritis atrófica. Igualmente es considerado como el principal factor de riesgo para el desarrollo de cáncer gástrico y linfomas tipo Maltoma (1-5). 

En el presente estudio los resultados mostraron la presencia de H. pylori en el 72,7% de los pacientes mediante cultivo microbiológico y la prueba de ureasa. En estudios previos realizados en Venezuela se demostró igualmente una alta prevalencia de infección por Helicobacter pylori (38). 

Otros reportes han demostrado que la sensibilidad del cultivo varía entre un 55% a un 90% (39). La guía Europea recomienda el uso de la prueba del aliento con la urea o determinación de antígenos en heces para el diagnóstico de la infección, y la endoscopia con la histología o la prueba rápida de ureasa sólo cuando esté clínicamente indicado (40). 

El cultivo es un método invasivo, que consume gran cantidad de tiempo, con poca sensibilidad, y que requiere un costo elevado para el paciente, su aplicación podría mantenerse limitada a campos de investigación epidemiológicos y farmacológicos, que conduzcan a la identificación de nuevas drogas efectivas para H pylori en diferentes regiones geográficas y que permitan la obtención de una vacuna en el futuro. Desde el punto de vista clínico, el uso del cultivo es un tópico que probablemente requiera un replanteamiento y un debate profundo para asumir de forma precisa cual es su papel en la práctica clínica (39). 

Romero Gallo y col. (41) realizaron un estudio para determinar la respuesta inmune anti-extracto total y anti-CagA en pacientes de la India, y lo correlacionaron con el cultivo de biopsias de estos pacientes, como uno de los objetivos de esta investigación. 

En el estudio demostraron que el 95% de la población era seropositiva incluyendo individuos que sólo respondieron al antígeno CagA. La correlación con el cultivo evidenció casos falsos positivos y falsos negativos, siendo estos resultados similares a los obtenidos en la presente investigación. Además señalaron que los estudios serológicos con el antígeno anti-extracto total H. pylori y CagA, deben ser considerados complementarios, y el uso de ambos ensayos conjuntamente podría incrementar la sensibilidad para la detección de la colonización. 

Otros estudios que emplearon el cultivo como ensayo para la detección de H. pylori han sido realizados en otras regiones geográficas (42). 

Las implicaciones del genotipo CagA en la patogénesis de la enfermedad gastroduodenal, son controversiales. Algunos autores señalan que la presencia del gen cagA, debe ser reconocido como un importante marcador de las cepas patógenas que les confiere una capacidad de permanencia con un riesgo incrementado para el desarrollo de úlcera péptica y cáncer gástrico, aunado a otros factores intrínsecos del hospedador (18, 43-45). 

Con respecto a lo anterior, el gen cagA de H. pylori y la expresión de sus productos CagA han sido sugeridos como marcadores de virulencia de este microorganismo. De esta forma ha sido reportado que personas infectadas con H. pylori, CagA positivas, tienen una expresión aumentada de IL-1a, IL-1b e IL- 8 en biopsias gástricas, comparadas con personas no infectadas o pacientes con cepas CagA negativas, lo que determinaría en estos pacientes un grado mayor de inflamación gástrica y daño incrementado del epitelio (18, 45-47). 

Aún cuando muchos estudios sugieren que existe una estrecha asociación entre niveles séricos de anticuerpos anti-CagA y enfermedad gastroduodenal (11, 22), otros estudios han reportado una falta de correlación entre la respuesta de anticuerpos anti- CagA y la severidad de la enfermedad gastrointestinal (24, 48, 49). 

En el presente estudio los resultados demostraron la presencia de anticuerpos anti-CagA y anti-extracto total en un porcentaje similar de pacientes con enfermedad gastroduodenal severa como úlcera gástrica y adenocarcinoma en comparación con el grupo de pacientes con gastritis crónica. Kuipers y col (19) y Blaser (11), indicaron una asociación entre la presencia de anticuerpos anti-CagA y el riesgo incrementado de desarrollar lesiones gástricas malignas. 

Zhang y col. (50) refirieron que posiblemente los resultados contradictorios reflejados en la literatura entre la asociación de enfermedad gastroduodenal y anticuerpos séricos anti-CagA, pueden deberse a la prevalencia de diferentes aislados de H. pylori en distintas regiones geográficas. Es posible que factores derivados del hospedero y del medio ambiente, puedan jugar un papel importante en la clínica de los sujetos infectados con H. pylori, o que puedan existir otros factores de virulencia relacionados con la bacteria que aún no han sido reconocidos, entre los diferentes aislados de este microorganismo. 

Aunque el reconocimiento serológico del antígeno CagA codificado por el gen cagA es generalmente un indicador de la presencia de organismos CagA positivos, algunos individuos que responden a este antígeno, no responden a las preparaciones de extracto total (11, 18, 44). A este respecto en el presente estudio, 3 de los 66 pacientes evaluados presentaron anticuerpos anti-CagA y no respondieron a las preparaciones con extracto total de H. pylori. 

Romero-Gallo y col. (41), señalaron que el reconocimiento serológico del antígeno CagA es generalmente indicador de la presencia de organismos CagA positivos, aún en pacientes que no responden a las preparaciones con el extracto total (41). Los autores indican que no es posible precisar si los individuos son portadores actuales de H. pylori, sugiriendo que es necesario correlacionar los anticuerpos anti-CagA con otras pruebas serológicas que contengan antígenos complementarios. Por ello, en el presente estudio se empleó un sistema inmunoenzimático con extracto total y ureasa, además de determinar la presencia de organismos viables mediante el cultivo. 

La ureasa es responsable de neutralizar la acidez gástrica producida posterior a la colonización de H. pylori a nivel de la mucosa gástrica, y es considerada como una candidata ideal para el desarrollo de vacunas, por lo que se evaluó su propiedad inmunogénica. Los resultados obtenidos en cuanto a la magnitud de la respuesta para distintos antígenos, mostraron bajos niveles de IgG anti-ureasa, datos que coinciden con otros hallazgos reportados (51, 52). 

El incremento en la disponibilidad de pruebas diagnósticas como el ensayo inmunoenzimático para extracto total y CagA, provee el potencial de mejorar el manejo de la infección por H. pylori en el cuidado primario de los pacientes, y podrán ser utilizadas como marcadores de seguimiento en la antibióticoterapia. Una vez más se evidencia que la infección por Helicobacter pylori en Venezuela presenta una alta prevalencia en la población y que las cepas circulantes tienen un potencial patogénico. 

AGRADECIMIENTO 

Este trabajo fue financiado por el Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad Central de Venezuela, FONACIT proyecto SI-96001408 y la Unidad de Investigación en Enfermedades Infecciosas, Coordinación de Investigación, IMSS, Ciudad de México, México. 

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Autor de correspondencia: Marianella Perrone. Coordinación de Investigación, Instituto de Investigaciones Odontológicas, Facultad de Odontología, Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela. Telf. 212-2379632. Correo electrónico: mperrone@cantv.net / mcavazza@yahoo.com