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Investigación Clínica
versión impresa ISSN 0535-5133versión On-line ISSN 2477-9393
Invest. clín v.49 n.4 Maracaibo dic. 2008
Efecto de una inyección de morfina sistémica sobre algunos aminoácidos en la corteza cingulada anterior en el dolor agudo.
Elizabeth Silva 1, Belkis Quiñones 1, Ximena Páez 1 y Luis Hernández 1.
Laboratorio de Fisiología de la Conducta y Departamento de Fisiología, Escuela de Medicina, Universidad de los Andes (ULA). Mérida. Venezuela.
Autor de correspondencia: Elizabeth Silva. Apartado 109. Mérida 5101, Venezuela. Teléfono: 58-274-2403110; 58-274-4170150. Correo electrónico: rosas@ula.ve
Resumen
El objetivo del presente trabajo fue investigar los efectos de una inyección única de morfina intraperitoneal, sobre el nivel extracelular de arginina, glutamato, aspartato y GABA en la corteza cingulada anterior en ratas durante la fase I del test de la formalina. Se usó una combinación de microdiálisis y de Electrophoresis Capilar de Zona con Detección de Fluorescencia Inducida por Láser (CZE-LIFD), para medir los niveles extracelulares de aminoácidos en los microdializados. Las cánulas de microdiálisis fueron implantadas unilateralmente en la corteza cingulada anterior izquierda en ratas que se mueven libremente. Las muestras tomadas cada 30 seg, se derivatizaron con el colorante isotiocianato de fluoresceína y se midió con CZE-LIFD: arginina, glutamato, aspartato y GABA. Durante los primeros minutos del test de la formalina (fase I), se produjo un aumento significativo de arginina (p < 0,001) y glutamato (p < 0,012). En las ratas pretratadas con morfina el aumento de glutamato después de la formalina fue suprimido, y se observó un aumento transitorio del GABA (p < 0,001). Estos experimentos sugieren que hay cambios rápidos de neurotransmisores en los primeros minutos en el dolor agudo, como son el aumento de glutamato encontrado en la corteza cingulada anterior, quizás relacionados con la aversión y el temor. La inyección previa de morfina produce aumento del GABA y elimina el aumento de glutamato inducido por la formalina en los primeros minutos, lo que pudiera estar relacionado con los efectos analgésicos, recompensantes y/o euforizantes de la morfina.
Palabras clave: Corteza cingulada anterior, test de la formalina, aminoácidos, microdiálisis, electroforesis capilar.
Effect of a simple morphine system injection in some aminoacids in the anterior cingulate cortex during acute pain.
Abstract
The aim of this research was to find out the effects of ip morphine pretreatment in the extracellular content of the arginine, glutamate, aspartate and GABA levels in the anterior cingulate cortex in rats, during the formalin test (phase I). A combination of micro dialysis and Capillary Electrophoresis Zone and laser-induced fluorescence detection (CZE-LIFD) technique was used to measure the extracellular levels of amino acids in microdialized zones. The microdialysis probes were unilaterally implanted in the left anterior cingulate cortex of freely moving rats. The samples were collected every 30 seconds and derivatized with fluorescein isothiocianate. The arginine, glutamate, aspartate and GABA levels were measured in the CZE-LIFD device. Arginine (p < 0.001) and glutamate levels (p<0.012) were significantly increased in the first few minutes following the formalin test (phase 1). Pretreatment with morphine suppressed the glutamate increase. A transient GABA level increase (p<0.001) was also detected. These experiments suggest that rapid changes in neurotransmitters levels were detected in the first few minutes of acute pain as revealed by the glutamate and arginine level increases in the anterior cingulate cortex. These changes could be related to the emotion of pain processing (fear and aversion). Morphine pretreatment produced an increase in GABA levels and a decrease in glutamate levels in the first few minutes. These findings may be related to euphoria and/or analgesia.
Key words: Anterior cingulate cortex, formalin test, amino acids, microdialysis, capillar electrophoresis.
Recibido: 25-10-2007. Aceptado: 08-05-2008.
INTRODUCCIÓN
El dolor es una experiencia que tiene componentes discriminativos, afectivo-motivacionales y cognoscitivos, cada uno de los cuales está mediado y modulado a través de mecanismos cerebrales que actúan a niveles medulares, del tallo cerebral y del cerebro. La corteza cingulada anterior (ACC) recibe aferencias talámicas principalmente de la línea media y de los núcleos intralaminares, más bien que del tálamo anterior. Esto provee una base estructural para las funciones que relacionan el dolor y la ACC (1). Recientemente, un aumento en la cantidad de evidencias electrofisiológicas, imágenes funcionales, y estudios conductuales indican que la ACC está envuelta en el procesamiento del dolor, especialmente en la dimensión afectiva del dolor (2-5). En monos, las lesiones de la ACC disminuyen la sensibilidad al dolor (6, 7). La lesión de la ACC alivia el dolor intratable en humanos (8, 9). Los estudios experimentales en ratas muestran que la interrupción de la conducción a través del haz cingulado interrumpe el componente afectivo del dolor tónico (10). Los estudios de imágenes funcionales (MRI) y de resonancia magnética de emisión de positrones (PET) durante la estimulación dolorosa sugieren que la ACC juega un rol en el dolor (11-20). Desde las últimas décadas hay evidencias claras que señalan que el aminoácido excitador glutamato juega un papel en el procesamiento del dolor. Estudios in vitro en la ACC señalaron que el neurotransmisor que media la excitación entre las neuronas aferentes del cuerpo calloso y las capas de neuronas piramidales V y VI es el glutamato (21). La acción del glutamato en relación con el dolor, en el cerebro es compleja y localizada; en algunas zonas transmite el dolor como el tálamo (22, 23) y en otras promueve la analgesia como en la sustancia gris periacueductal y la zona bulbar ventro lateral (24, 25).
La arginina es importante por su relación con el óxido nítrico (NO). El NO es sintetizado por la enzima óxido nítrico sintetasa (NOS) a partir de la arginina. El NO ha sido implicado en el dolor, pues los inhibidores del NOS atenúan la hiperalgesia térmica (26-28). Parece que la excesiva activación del receptor NMDA aumentando el Ca++ contribuye a la neuro toxicidad del glutamato por compromiso de la producción de NO (29). La aplicación por 5 min de NMDA en ausencia de L-arginina, induce la muerte neuronal y la presencia de L-arginina durante la aplicación de NMDA, previene la muerte neuronal por bloqueo de O2. La arginina tiene un importante papel como modulador de exocitotoxicidad del glutamato. La arginina, de origen glial, inhibe la formación de radicales tóxicos, la disfunción mitocondrial y la muerte celular; de esta manera las células gliales pueden proteger a la neurona de la toxicidad aportando la l-arginina (30, 31).
Con la técnica de FMRI (imágenes de resonancia magnética funcional), la inyección previa de morfina (5 mg/kg) ev suprime la activación de la ACC, SI, SII, tálamo e hipotálamo que ocurre al aplicar un estímulo doloroso (32).
Con estudios de PET, el fentanil, una droga analgésica que se une a los receptores opioides mu, se ha usado para ubicar los sitios centrales en que actúa (33). Estudios recientes usando [(11) C]-carfentanil, muestran que hay cambios en los opiodes en la unión ligando-receptor debido al dolor agudo experimental (34). Otros estudios con fentanil demuestran la activación de la ACC media, sugiriendo que esta zona de la ACC participa activamente en la analgesia mediada por opioides (35, 36). Se ha encontrado una importante interacción en los sistemas gabaérgicos y opioides (37).
El objetivo de estos experimentos fue investigar en la ACC de ratas con dolor agudo inducido por formalina, el efecto de una dosis única de morfina sobre los niveles extracelulares de los aminoácidos glutamato, aspartato, arginina y ácido gama aminobutírico (GABA).
MATERIALES Y MÉTODOS
A 24 ratas Wistar machos de peso corporal comprendido entre 250 g y 280 g, bajo anestesia con Pentobarbital (10 mg/Kg) y Ketalar (25mg/Kg), se les implantó estereotáxicamente, en el lado izquierdo del cerebro una cánula guía de 10 mm hecha de tubo de acero inoxidable de 21 gauge, de acuerdo a las siguientes coordenadas para la ACC: 0,5 mm lateral a la sutura sagital; 2,7 mm anterior al bregma y 4,5 mm ventral a la superficie craneal (38). La cánula guía se cementó a la superficie del cráneo con tornillos y acrílico dental. A los 7 días del post operatorio se realizó la microdiálisis (39,40). Los animales se dividieron en cuatro grupos: a) formalina sola (n=6); b) salina como control (n=6); c) pretratamiento con morfina, 30 min antes de la formalina (n=6) y d) morfina sola (n=6), al que solo se le inyectó morfina, para conocer si la morfina sola tenía algún efecto sobre la línea base de los cuatro aminoácidos y se midió a los 30 minutos.
Microdiálisis
Las cánulas de diálisis se fabricaron a partir de una de una pieza de fibra hueca de celulosa (200 µm de diámetro externo, con perforaciones que no permiten el paso de moléculas cuyo peso molecular sea superior a 13.000 Daltons), fijada con epoxi al extremo de un tubo de acero inoxidable. En el interior de ambos se colocó un capilar de sílica fundida, cubierta de poliimida, de 76 µm de diámetro interno, y 150 µm de diámetro externo. La cánula de diálisis sobresalía 5 mm del final de la cánula guía, pero la longitud efectiva de la zona de ultrafiltración era de 2 mm. La entrada de la cánula estaba unida a un tubo de polietileno que se conectó a una jeringa llena de líquido céfaloraquídeo artificial (NaCl 134,9 mM; KCl 3,7 mM; CaCl2 1,2 mM; MgCl2 1 mM y NaHCO3 10 mM, a un pH de 7,4) colocada en una bomba que perfundió a un flujo de 1µL/min. El día anterior al experimento se insertó la cánula de microdiálisis en la guía y se perfundió a un flujo a 0,4 µL/min. Al día siguiente se aumentó el flujo a 1 µL/min y se esperó 1 hora. Después se tomaron 9 muestras basales en microtúbulos. En el grupo pretratado con morfina (n=6) se les inyectó morfina (10 mg/kg ip) 30min antes de la inyección de formalina. El test de la formalina consistió en inyectar 50 µL de formalina diluída (5%) en la superficie dorsal de la pata derecha de la rata. La duración de la inyección fue de 15 segundos. Después de la inyección de formalina, se siguió recolectando las muestras durante 10 min más. Las muestras se recolectaron cada 30 seg. Después de la inyección de formalina sola, la pata se puso roja, caliente y edematosa; la rata presentó en esta pata el reflejo de retiramiento, evitando pisar con lo que la pata inyectada permaneció la mayor parte del tiempo levantada. En el grupo control, la inyección en la pata fue de 50µL de solución salina. Luego se derivatizó cada muestra siguiendo el protocolo descrito abajo.
Al final de cada experimento, cada rata se sacrificó con exceso de anestésico y se perfundió transcardíacamente con una solución al 0,9% de NaCl, seguida de formalina al 5%. Se disecó cada cerebro dejándolo en solución de formalina al 10%, durante 2 días para su fijación. Luego se hicieron cortes de 40 µm de grosor con un micrótomo de congelación; los cortes no teñidos se observaron en un microscopio del luz con el método birrefringente, para localizar la posición de las cánulas guías. Se incluyeron en el trabajo sólo las ratas con las cánulas en la posición correcta (Fig. 1).
Fig. 1. Localización de la cánula de microdiálisis en la ACC. La posición de las cánulas se dibujó en una sección representativa del cerebro de rata tomado del atlas de Paxino &Watson (38).
Derivatización de las muestras
Los dializados fueron mezclados con 0,5 µL de la solución derivatizante hecha de buffer carbonato 20 mM a un pH de 9,5 y una solución 2,5×10–5 M del isómero I de isotiocianato de fluoresceína (FITC) en acetona en una proporción de 1:1 (vol:vol). Seguidamente la mezcla se centrifugó y se dejó en un sitio oscuro por lo menos durante 18 horas para permitir la reacción de los aminoácidos con el FITC. Posteriormente cada muestra fue diluida con 5µL de agua desionizada y centrifugada. Los estándares de arginina, glutamato, y aspartato fueron derivatizados con el mismo protocolo.
Análisis por electroforesis capilar con detección por láser
La detección de arginina, glutamato, aspartato y GABA fue realizada utilizando el Instrumento R2D2-1 CZE-LIFD (Meridialysis®, Mérida, Venezuela) el cual está equipado con un capilar de sílica fundida de 40 cm de longitud, 350 µm de diámetro externo y 25 µm de diámetro interno. Las muestras y los estándares de arginina, glutamato, aspartato y fueron inyectados hidrodinámicamente en el extremo anódico del capilar por efecto de una presión negativa de 19 psi aplicada durante 200 ms en el extremo catódico del capilar. Luego fueron aplicados 21 kV entre los dos extremos del capilar. El voltaje generó una corriente de 7 µA. Después de correr la muestra, el capilar fue lavado con NaOH 1M por 2 min, luego con agua de 18 MW durante 1 min y por último con el buffer carbonato por 2 min. Cada corrida completa demoró 15 min, más los tiempos de lavado.
En cada muestra, los picos del glutamato, el aspartato y la arginina fueron identificados por el tiempo de migración y por la altura de la espiga. La presencia de estos aminoácidos fue comprobada realizando el “spiking” de los aminoácidos respectivos. Una vez corridas todas las muestras, se determinó la altura de los picos y se calculó la concentración.
Medición de GABA
Se usó el mismo equipo anterior, pero con una solución de buffer borato (23 mM) con sodio dodecyl sulfate (SDS, 120 mM) y metanol (1%) (41), para separar el GABA por la técnica de micrografía miscelar electrocinética (MEKC). Se aplicó 26 kV entre los dos extremos del capilar y se generó una corriente de 20 µA.
Análisis estadístico
Se calculó para cada rata el promedio de la concentración basal sobre nueve muestras basales (previas al test de la formalina). Los datos normalizados fueron analizados usando el ANOVA de una vía y ANOVA de medidas repetidas y el post test Newman-Keuls. El nivel de significación estadística fue de p < 0,05 (programa estadístico SPSS 8.0).
Aspectos éticos
Los experimentos se realizaron de acuerdo en todo con normas éticas de la IASP (Asociación Internacional para el Estudio del Dolor) y las Normas para el Uso de Animales de Laboratorio del Consejo de Desarrollo Científico y Tecnológico de la Universidad de los Andes.
RESULTADOS
Las variaciones porcentuales de los diferentes aminoácidos respecto a su línea base previa se pueden ver en la Tabla I.
TABLA I
CAMBIOS PORCENTUALES DE AMINOÁCIDOS EN LO LOS DIALIZADOS DE LA CORTEZA CINGULADA ANTERIOR (ACC) DE RATAS DURANTE EL TEST DE LA FORMALINA
| Formalina | Control (salina) | Pretratamiento con morfina +Formalina | Morfina sola | |
| Arginina | (p < 0,0001) | ns | ns | ns |
| Glutamato | (p < 0,029) | ns | Ns | nss |
| Aspartato | ns | ns | Ns | ns |
| GABA | ns | ns | (p < 0,02) | ns |
Arginina
La concentración basal de arginina fue de 0,55 ± 0,04 µM. La arginina aumentó después de la inyección de formalina y permaneció así durante 3 min, comparada con la línea base previa. F (1/10)= 68,4; p < 0,0001 (Fig. 2).
Fig. 2. Arginina en la corteza cingulada anterior. Después de la inyección de formalina (cuadrados negros), el pre tratamiento con morfina (diamantes negros) y solución salina (triángulos negros), la arginina aumentó en forma breve, pero significativas, en relación a su la línea básica previa.
Glutamato
La concentración basal de glutamato fue de 0,50 ± 0,06 µM. El glutamato aumentó significativamente 1 min después de la inyección de formalina, pero no con salina o pre tratamiento con morfina. F (1/10)= 6,518; p < 0,029 (Fig. 3).
Fig. 3. Glutamato en la corteza cingulada anterior. Después de la inyección de formalina (cuadrados negros), el glutamato aumentó. Sin embargo, en el grupo que recibió salina (triángulos negros) no se observó ningún cambio; el pre tratamiento con morfina (diamantes negros) bloqueó el aumento de glutamato. En el ANOVA de medidas repetidas el glutamato aumentó significativamente después de formalina, en relación a la línea base previa (p < 0,029).
Aspartato
La concentración basal de aspartato fue de 0,68 ± 0,01 µM. Este aminoácido no fue afectado significativamente por ningún tratamiento. F (1/10)= 0,66; p < 0,615 ns Fig. 4).
Fig. 4. Aspartato en la corteza cingulada. Después de la inyección de formalina (cuadrados negros), el pre tratamiento con morfina (diamantes negros) y salina (triángulos negros), el aspartato aumentó en forma no significativa (p. ns).
GABA
La concentración basal de GABA fue de 0,15 ± 0,02 µM. La inyección de formalina y la inyección de solución salina (50 µL) en la pata de la rata, no produjeron cambios significativos en el nivel de GABA. El tratamiento previo con morfina produjo un aumento del GABA durante 2-3 min, después de la inyección de formalina. F (1/10): 37,30 (p < 0,02) (Fig. 5).
Fig. 5. GABA en la corteza cingulada. Después del pre tratamiento con morfina (diamantes negros), la inyección de formalina (cuadrados negros), produjo un aumento significativo y transitorio de GABA (p<0,02), y con los otros tratamientos no hubo cambios significativos. La inyección de salina (triángulos negros), no produjo ningún cambio en el GABA. La formalina sola (cuadrados negros), produjo una disminución leve, no significativa del GABA 1-2 minutos después de la inyección.
Se estudió también el efecto de la morfina sola en la línea base de los diferentes aminoácidos. La morfina no modificó las líneas bases previas de los aminoácidos p n.s. (Fig. 6).
Fig. 6. Efecto de la morfina sola en la línea base de los diferentes aminoácidos: arginina, glutamato, aspartato y GABA. Después de la inyección de una sola dosis de morfina no hubo cambios en las concentraciones de los aminoácidos.
Se realizó un experimento control con la conducta de flexión de la pata estimulada como respuesta al estímulo nocivo (inyección de formalina) y hubo concordancia entre la liberación del neurotransmisor glutamato y el aumento de la conducta observada (Fig. 7).
Fig. 7. Efecto conductual de la inyección de formalina (test de la formalina) en la pata de la rata. Se observó que la frecuencia de flexión de la pata aumentó en los primeros minutos mostrando concordancia con la liberación de glutamato y luego disminuyó gradualmente hasta llegar a la línea base alrededor de los 9 a 10 min.
DISCUSIÓN
En estos experimentos, en la ACC, la inyección de formalina aumentó significativamente la arginina y el glutamato, pero no modificó los niveles extracelulares del aspartato ni el GABA. La inyección de morfina 30 min antes de la inyección de formalina no cambió los niveles de arginina, pero suprimió el aumento de glutamato obtenido después de la formalina sola. La morfina previa a la formalina produjo un aumento significativo de GABA, a los 2 o 3 min después de formalina.
La ACC no solo está involucrada en la transmisión de la sensación de dolor, sino también desempeña un papel en el proceso de las emociones relacionadas con el dolor (42). La ACC está preferencialmente involucrada en el procesamiento de la dimensión afectiva del dolor (43). La ACC media la emoción negativa que acompaña al dolor y también el aprendizaje que provoca el estímulo de dolor (3). La ACC está conectada ampliamente con zonas relevantes del sistema de modulación descendente. La activación de la ACC puede facilitar la nocicepción espinal a través de los receptores glutamatérgicos NMDA (44). La estimulación directa de la ACC en ratones, provoca respuestas de temor (como el tiritamiento) e induce memoria a largo plazo del temor. La actividad excitadora de la ACC contribuye a la memoria del temor producida por el dolor y también a la modulación facilitada descendente en la médula espinal (45).
En la ACC se encuentran receptores glutamatérgicos y de GABA (A) en concentraciones significativamente más altas que la de los receptores muscarínicos y alfa adrenérgicos (46). La proyección talámica a la ACC es glutamatérgica, actuando especialmente a través de los receptores AMPA y la respuesta de las neuronas de la ACC a la estimulación talámica está regulada por el GABA, actuando a través de los receptores GABA A y GABA B (47). El glutamato es un importante mediador en la neurotransmisión, potenciación y la sensación desagradable asociada al dolor. Los receptores glutamatérgicos NMDA contribuyen a la respuesta sináptica en la ACC y su contribución es más importante cuando se estimulan a alta frecuencia (48).
El tratamiento agudo o crónico con morfina disminuye los niveles extracelulares de glutamato en la ACC, lo que sugiere que el glutamato en la ACC está envuelto en la acción central de la morfina (49).
Nuestros resultados muestran incremento del glutamato en la ACC con el dolor agudo (test de la formalina, fase I) en el primer minuto. La morfina previa anuló este aumento, de manera similar al hallazgo de otros investigadores (22, 49). El nivel de GABA extracelular no se modificó con el dolor agudo en la ACC, pero con el tratamiento previo de morfina se produjo un aumento transitorio del GABA. Este incremento pudiera estar relacionado con los efectos analgésicos de la morfina.
En conclusión, en la ACC, con el test de la formalina, fase I, hubo un aumento de glutamato y arginina, cambios que pudieran estar relacionados con la aversión y el temor en el procesamiento de la parte afectiva del dolor. Por otro lado, el pre-tratamiento con morfina aumentó el GABA y disminuyó el glutamato, estos cambios pueden estar relacionados con los efectos recompensantes, euforizantes y analgésicos la morfina. Se necesitan más experimentación en esta área para aclarar en profundidad el significado de estos cambios funcionales iniciales y transitorios del dolor agudo.
AGRADECIMIENTOS
Estos experimentos se hicieron gracias al financiamiento otorgado por el CDCHT en los proyectos M-821-05-03-A y M-823-05-03-B.
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