Posible papel de Bacteroides fragilis enterotoxigénico en la etiología de la vaginitis infecciosa. 

Nina Polanco¹, Lorna Manzi¹ y Oswaldo Carmona².

¹Laboratorio de Patogenicidad Bacteriana, Cátedra de Microbiología, Escuela de Bioanálisis, ² Cátedra de Microbiología, Escuela de Medicina José María Vargas,  Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela.

Autor de correspondencia: Nina Polanco. Laboratorio de Patogenicidad Bacteriana, Cátedra de Microbiología, Escuela de Bioanálisis, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela. Correo electrónico: n5polanc@hotmail.com. Tlf. 58-416-6087298, 58-212-6053349, Fax 58-212-6053327

Resumen. La vaginitis es un trastorno ginecológico frecuente producido por distintas causas, algunas de las cuales permanecen desconocidas. Bacteroides fragilis es el anaerobio más importante en bacteriología clínica. Algunas cepas son enterotoxigénicas y se asocian con síndromes intestinales y extraintestinales. Recientemente han sido aisladas de pacientes con vaginitis. En este trabajo se planteó investigar la posible asociación de B. fragilis enterotoxigénico con la vaginitis infecciosa. Fueron procesadas 265 muestras de exudado vaginal. 202 de mujeres sintomáticas y 63 mujeres sanas. La identificación de los microorganismos se realizó por métodos convencionales. En 31,2% de las pacientes sintomáticas se identificaron: Gardnerella vaginalis, Candida albicans, Mobiluncus, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum y Streptococcus agalactiae. En 27 pacientes sintomáticas y en 5 mujeres sanas se identificó B. fragilis. Estas cepas fueron cultivadas en medio líquido e incubadas durante 48 h a 36° C en anaerobiosis. La toxicidad en los sobrenadantes se ensayó en células HT-29. 18 cepas de B. fragilis aisladas de pacientes sintomáticas fueron enterotoxigénicas, ya que indujeron alteraciones en la monocapa celular y en las células. No se identificó en mujeres sanas (P<0,05). 77,7% de las cepas de B. fragilis enterotoxigénicas no se encontraron asociadas con otros patógenos específicos. Este hecho sugiere que pudiera ser un agente causante de vaginitis, ya que el efecto de la enterotoxina sobre la E-cadherina del epitelio vaginal podría facilitar la invasión y su posible papel patógeno en la vagina. Esta es la primera investigación que asocia a Bacteroides fragilis enterotoxigénico como posible causa de vaginitis infecciosa.

Possible role of enterotoxigenic Bacteroides fragilis in the etiology of infectious vaginitis.

Abstract. Vaginitis is a common gynecologic disorder. It is due to several causes, some even unknown. Bacteroides fragilis is the most important anaerobe in clinical bacteriology, some strains of this group are notable for being enterotoxigenic and they have been associated with intestinal and extraintestinal syndromes. They have recently been isolated from patients with vaginitis. The purpose of this study was to investigate a possible association of enterotoxigenic B. fragilis with infectious vaginitis. 265 samples of vaginal exudate were processed, 202 from symptomatic patients and 63 healthy women. The identification of the microorganisms was carried out by conventional methods. In 31.2% of symptomatic patients were identified: Gardnerella vaginalis, Mobiluncus, Candida albicans, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum and Streptococcus agalactiae. B. fragilis was identified in 27 symptomatic patients and 5 healthy women. These strains were cultivated in liquid medium and incubated during 48 h at 36°C in anaerobe chambers. Supernatant activity was assayed in HT-29 cells. Eighteen B. fragilis strains isolated from symptomatic patients were enterotoxigenic, because induced alterations in target cell morphology. It was not identified in healthy women (P<0.05). 77.7% of enterotoxigenic B. fragilis strains were not associated with other specific pathogens. This fact suggests that enterotoxigenic B. fragilis could be a cause for vaginitis. The effect of enterotoxin on E-cadherin of vaginal epithelium could facilitate invasion and its possible pathogenic role in the vagina. This is the first report that associates enterotoxigenic Bacteroides fragilis as a possible cause of infectious vaginitis.

Recibido: 21-01-2011 Aceptado: 15-09-2011

INTRODUCCIÓN

La vaginitis es un desorden ginecológico, caracterizado por la inflamación de la mucosa vaginal, asociada con flujo, eritema, mal olor, prurito y/o ardor (1). Aunque este cuadro es común, su frecuencia no está bien determinada debido a que en algunos casos, suele ser asintomático y en otros, por la práctica de la automedicación, las pacientes no son evaluadas en los centros de atención ginecológica. 

La etiología de la vaginitis puede ser no infecciosa e infecciosa. La vaginitis de origen no infeccioso es favorecida por el descenso de los estrógenos, el tratamiento prolongado con antibióticos y corticoides, el uso de anticonceptivos hormonales, la exposición a radiaciones y el uso de sustancias y objetos irritantes. La inflamación de la vagina por la acción de agentes infecciosos es frecuente (2, 3). En un alto porcentaje es causada por Trichomonas vaginalis, Candida albicans y secundariamente, por bacterias causantes de la vaginosis bacteriana tales como: Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, por anaerobios como Prevotella, Mobiluncus, Bacteroides y Peptoestreptococcus (4, 5). 

Bacteroides fragilis es un bacilo Gram-negativo anaerobio que forma parte de la flora normal de diversas cavidades del cuerpo incluyendo la vagina en donde se encuentra en escasa proporción (6). Es el anaerobio más importante desde el punto de vista clínico, no solo por su alta frecuencia (7,8) sino también por la resistencia que posee a los agentes antimicrobianos usados tradicionalmente para combatirlo (9). 

Clásicamente, los factores de virulencia de B. fragilis son: cápsula, fimbrias, proteína de membrana externa, lipopolisacáridos, enzimas y algunos metabolitos (10), pero en las últimas décadas, se ha identificado una enterotoxina como factor de patogenicidad, la cual ha sido asociada con cuadros diarreicos en distintos animales neonatos, en niños y adultos (11-13). La enterotoxina, también conocida como fragilisina, es una exotoxina de 20 kDa que pertenece a la familia de las metaloproteasas dependientes del zinc (14, 15). Esta toxina hidroliza el dominio extracelular de la E-cadherina, proteína primaria de la zónula adherens. De esta manera, altera la adhesión celular e incrementa la permeabilidad del epitelio, causando la redistribución intracelular de la actina, con cambios morfológicos de las células, liberación de la b-catenina, la cual transloca el núcleo y finalmente incrementa la proliferación celular (16). 

Los genes que codifican la fragilisina se encuentran en una región cromosomal de 6 kb denominada isla de patogenicidad de B. fragilis (IPBF) que comprende los loci para tres isotipos de la enterotoxina denominados bft-1, bft-2 y bft-3 (17,18). Esta toxina estimula la secreción de la interleuquina-8 (IL-8) en células HT-29, T84 y Caco-2 (19, 20, 21). Particularmente, las células HT-29/C1 son extremadamente sensibles a la toxina, incluso a dosis tan bajas como 12,5 pM (22), la alteración que en ellas produce es tan evidente que frecuentemente son utilizadas para diferenciar cepas de B. fragilis enterotoxigénicas de las no enterotoxigénicas, así como para identificar sus toxinas y su mecanismo de acción (23). 

Aunque las cepas toxigénicas de B. fragilis se aislaron inicialmente de heces de animales neonatos y niños (11-13), en la actualidad también se aíslan de fuentes clínicas extraintestinales, principalmente de muestras de sangre (24, 25). Recientemente, se ha identificado en cáncer de colon (26), exudado vaginal (27), piel, heridas quirúrgicas y de abscesos perirectales e intraabdominales (28, 29). Este hecho lo coloca como un microorganismo de importancia en microbiología clínica. En consideración de lo anteriormente expuesto, se planteó investigar la posible asociación de B. fragilis enterotoxigénico con la vaginitis. 

PACIENTES Y MÉTODOS 

El material de estudio estuvo constituido por 265 muestras de exudado vaginal, provenientes de mujeres sexualmente activas, en un rango de edad entre 15 y 55 años. De ellas, 202 eran sintomáticas y fueron referidas por especialistas del área metropolitana de Caracas para la investigación de agentes específicos de infección genital, por presentar leucorrea asociada a uno o más de las siguientes manifestaciones clínicas: ardor, mal olor, prurito y eritema vulvo-vaginal. El resto, 63 mujeres sanas, pertenecían al mismo rango de edad, cuya asistencia a los centros de salud era exclusivamente para evaluación ginecológica de rutina. Fueron atendidas en la Unidad de Diagnóstico Microbiológico del Centro Aloa de la ciudad de Caracas y en el Servicio de Enfermedades de Transmisión Sexual y Planificación Familiar del Distrito Sanitario Nº 4 en la misma ciudad. EL período de estudio estuvo comprendido entre el año 2008 y 2010. 

Las muestras fueron obtenidas siguiendo las normas del Código de Bioética y Bioseguridad del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología (FONACIT) (30). Se tomaron como criterios de exclusión la administración de tratamiento antimicrobiano durante los siete días previos a la toma de la muestra, edades por fuera del rango mencionado, pacientes con cervicitis, así como la positividad de la serología para HIV. 

El exudado vaginal fue tomado del fondo de saco posterior de la vagina e inmediatamente examinado al microscopio óptico (400X) a fin de investigar la presencia de Trichomonas vaginalis, levaduras y filamentos, células claves y leucocitos polimorfonucleares. Para los efectos de esta investigación, el criterio de inflamación utilizado fue la presencia, en el exudado vaginal, de 20 ó más leucocitos PMN/c. Las muestras fueron transportadas en condiciones de anaerobiosis (31) para su procesamiento inmediato en el Laboratorio de Patogenicidad Bacteriana de la Cátedra de Bacteriología en la Escuela de Bioanálisis de la Universidad Central de Venezuela. 

Estudio bacteriológico 

Se realizó la investigación de Gardnerella vaginalis, Trichomonas vaginalis, Candida albicans, Mycoplasma hominis, Mobiluncus sp, Streptococcus agalactiae y Ureaplasma urealyticum y, para descartar los agentes específicos de cervicitis, se investigó Neisseria gonorrhoeae (31) y Chlamydia trachomatis mediante inmunoensayo enzimático (32). 

Aislamiento e identificación de Bacteroides fragilis 

Las muestras en estudio se sembraron en Agar sangre (Difco) suplementado con vitamina K₁ (20 µg/mL) y hemina (5 µg/mL), se incubaron a 35° C por 48 horas en atmósfera anaeróbica (GasPacK Anaerobe System). A las colonias desarrolladas en estas condiciones se les comprobó el carácter de anaerobio (33), y se les realizó la coloración de Gram. Confirmadas las características típicas de B. fragilis, se realizaron las siguientes pruebas bioquímicas: Crecimiento en bilis al 20% (Difco), indol, producción de lipasa, de hidrógeno sulfurado, síntesis de la enzima catalasa, fermentación de los carbohidratos (manitol, trealosa y rammosa, glucosa, sacarosa, lactosa, arabinosa, maltosa, mannosa, rafinosa, salicina, xilosa y sorbitol) (34) y su comportamiento ante los antibióticos Penicilina (2 U, Oxoid), Kanamicina (1.000 µg, Oxoid) y Rifampicina (15 µg, Oxoid) (35). 

Las cepas controles de B. fragilis, fueron la 086 productora de la toxina BFT-2 y la TM 400, no toxigénica, ambas suministradas por el Dr. Augusto Franco, de la Escuela de Medicina de la Universidad John Hopkins, Maryland, USA. 

Las cepas de Bacteroides fragilis identificadas en todas las muestras de exudado, así como los controles fueron sembradas en placas de agar base triptosa suplementada con 5% de sangre de conejo desfibrinada suplementado con vitamina K₁ (1 µg/mL) más hemina (5 µg/mL) y se incubaron en atmósfera de anaerobiosis a 35°C durante 48 horas. De estas placas se tomaron varias colonias y se inocularon por duplicado en 5 mL de caldo infusión cerebro corazón (Difco), suplementado con extracto de levadura-BBL (0,05%), vitamina K₁ (1 µg/mL) más hemina (5 µg/mL) hasta alcanzar la turbidez del patrón de McFarland Nº 1 y nuevamente se incubaron en anaerobiosis durante 48 h, una serie y durante 72 h la otra serie. Transcurrrido este tiempo cada cultivo se centrifugó a 12.000 g, rotor A-841 (Sorvall Ultra centrifuge, Dupont, OTD 55B) a 4° C durante 15 min. El sobrenadante obtenido se filtró a través de un filtro millipore (0,22 µm) y se ensayó en los cultivos celulares (29). 

Ensayos de citotoxicidad 

Los ensayos de citotoxicidad se realizaron en células HT-29, obtenidas de la Unidad de Cultivos celulares del Centro de Bioquímica y Biofísica del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), Caracas-Venezuela. La monocapa de las células fue tratada con tripsina-.EDTA al 0,5% durante 5 min, posteriormente lavadas con PBS pH 7,2 y resuspendidas en DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) a razón de 3,6 × 10⁵ cels/mL. De esta suspensión celular se añadieron por duplicado 500 µL a cada uno de los 24 pozos de las placas de cultivo, para lograr una concentración de 180.000 cels/pozo. Seguidamente se incubaron en estufa de CO₂ hasta alcanzar el 80% de confluencia, cuando fueron tratadas con las siguientes fracciones: I- Sobrenadante de cultivo de B. fragilis 086 productora de la toxina BFT-2. II- Sobrenadante de cultivo de B. fragilis TM 400 (no toxigénica). III- Medio de cultivo DMEM, más caldo infusión cerebro corazón suplementado con vitamina K₁ (1 µg/mL) y hemina (5 µg/ mL) y IV- DMEM. Posteriormente las placas fueron incubadas a 37°C en estufa de CO₂ y observadas con el microscopio invertido a las 3, 24 y 48 h. Transcurrido este tiempo, las células se lavaron con PBS (pH 7,2), se fijaron con metanol al 90% durante 5 min, se colorearon con Giemsa y se registraron las impresiones fotográficas (29). 

La actividad de la toxina, fue registrada en un modelo cualitativo según las alteraciones morfológicas en la monocapa celular (22), usando una escala de acuerdo a los siguientes patrones: 4+: Desprendimiento total de la monocapa, redondeamiento del 100% de las células, expansión y separación de las mismas; 3+: Desprendimiento de un 75% de la monocapa, disolución de los acúmulos celulares, redondeamiento del 100% de las células, expansión y separación de las mismas; 2+: Desprendimiento del 30%-40% de la monocapa, redondeamiento, expansión y separación de las células y 1+: Expansión y separación leve de las células con escaso desprendimiento de la monocapa. 

Los resultados relacionados con la frecuencia de identificación de B. fragilis enterotoxigénico, en los grupos de estudio y control, fueron analizados mediante la Prueba de Fisher con un nivel de significación de 0,05. 

RESULTADOS 

En el examen microscópico al fresco del flujo vaginal (400X) se evidenció la presencia de neutrófilos polimorfonucleares (³ 20 PMN/c), así como la disminución de lactobacilos (£ 6). Todas las pacientes presentaban flujo vaginal, cuyo pH varió entre 6 y 7. 

En el exudado vaginal de las pacientes sintomáticas se identificaron en un 31,2% microorganismos considerados patógenos vaginales (Tabla I). En un 39,0%, se aislaron especies anaeróbicas de las cuales, el 21,3% fueron cocos Gram-positivos y el 17,8% fueron bacilos Gram-negativos, de éstos, el 13,3% (27 casos) fueron identificados como Bacteroides fragilis por sus características en la coloración de Gram como bacilos Gram-negativos, delgados, con extremos redondeados, ligeramente pleomórficos y capsulados, por la estimulación del crecimiento en presencia de bilis al 20%, la precipitación de la misma alrededor de las colonias, la hidrólisis de la esculina, catalasa positivo, indol negativo, no productor de H₂S, no fermentadores de manitol, trehalosa y ramnosa y por la resistencia a Penicilina (2 U), Kanamicina (1.000 mg) y la sensibilidad a Rifampicina (15 mg).

En ninguna de las 63 muestras de mujeres sanas se detectaron bacterias patógenas, sin embargo, en cinco de ellas se identificó B. fragilis (7,9%). 

Los ensayos de toxicidad revelaron que, las células HT-29 permanecieron inalteradas durante todo el período de incubación de las placas, cuando fueron tratadas con medio de cultivo solamente y con el sobrenadante de cultivo de B. fragilis TM-400 (cepa no toxigénica). Mientras que el sobrenadante del control positivo, cepa de B. fragilis 086 productora de toxina BFT2, indujo alteraciones en la morfología de la monocapa las cuales se hicieron evidentes a las 3 h de incubación, este efecto fue más prominente a las 48 h, cuando se observó el desprendimiento de la monocapa en un 80%, así como el redondeamiento, expansión y separación de las células. Estas alteraciones fueron registradas con un Patrón de 3+. 

De las 27 cepas de B. fragilis identificadas en las pacientes sintomáticas, 18 resultaron enterotoxigénicas, mientras que las cepas de B. fragilis identificadas en los controles sanos no mostraron efecto alguno, diferencia estadísticamente significativa (P<0,05). 

En la Fig. 1, se muestran las alteraciones de las células inducidas por los sobrenadantes de cultivos Bf-v.006 (1C), Bf-v.025 (1D), Bf-v.023 (1E), las cuales fueron registradas con un patrón de 3+, y con un patrón de 4+, la cepa 001 (1F). Algunos sobrenadantes de B. fragilis presentaron actividad citotóxica cuando fueron cultivados durante 48 h, mientras que otros, cuando se cultivaron durante 72 h.

En el 22,2%, B. fragilis enterotoxigénico se identificó conjuntamente con Candida albicans y de éstos, en un caso con Mycoplasma hominis y en otro con Staphyloccocus aureus. En el 77,7% de las cepas de B. fragilis enterotoxigénico no se encontró asociado a ningún patógeno conocido (Tabla II).

DISCUSIÓN

Aunque la vaginitis infecciosa es un trastorno ginecológico común, su etiología en muchos casos queda sin definición, por tal motivo, la búsqueda de agentes que pudieran explicar este síndrome es de primordial importancia en microbiología clínica. Recientemente, en un estudio constituido por 140 pacientes con vaginitis, se determinó que el 80% de las cepas de B. fragilis identificadas fueron enterotoxigénicas (27). Sin embargo, su papel como patógeno vaginal no ha sido estudiado, por lo cual se planteó investigar la posible asociación de B. fragilis enterotoxigénico con la vaginitis infecciosa.

La presencia de un Nº ³ 20 leucocitos PMN/c de 400 X en la preparación al fresco del exudado vaginal, reveló la respuesta inflamatoria en las pacientes sintomáticas. La identificación en estas pacientes del 31,2% de diferentes especies consideradas patógenos vaginales, así como el gran número de anaerobios aislados (39,0%), podría explicar en algunos casos el desarrollo de la vaginitis, ya que varios de estos microorganismos han sido asociados con vaginosis bacteriana que según algunos autores podría preceder a esta entidad clínica (4,5), por esta razón y por la elevada proporción en el crecimiento en las placas de cultivo de Gardnerella vaginalis, así como por la presencia de un porcentaje significativo (20%) de células claves en el Gram del exudado se incluyó como patógeno potencial en este estudio. 

De las 27 cepas de B. fragilis identificadas en las pacientes sintomáticas, 18 resultaron enterotoxigénicas, evidenciadas mediante las alteraciones que indujeron en la monocapa de las células HT/29. Estas alteraciones fueron desprendimiento de la monocapa, disolución de los acúmulos y cambios visibles en la morfología celular. Algunas cepas fueron más tóxicas que otras. Se ha demostrado que este efecto es tiempo y concentración dependiente (16). La cepa Bf-v. 001, cuyo sobrenadante disgregó totalmente los acúmulos en células individuales y generó cambios morfológicos visibles en todas las células, presentó el efecto tóxico cuando su sobrenadante se obtuvo a las 72 h de cultivo y no a las 48 h, sin embargo, esta no parece ser la razón de su mayor actividad, ya que las cepas Bf-v.006 y Bf-v.025, también presentaron actividad tóxica solamente cuando fueron cultivadas durante 72 h y su efecto tóxico fue similar al de la cepa Bf-v.023 la cual presentó toxicidad tanto a las 48 h como a las 72. La variabilidad en el tiempo de la producción de la toxina ha permitido el planteamiento de varias hipótesis, las cuales contemplan diferencias en la expresión o tiempo de secreción de la toxina, así como la presencia de otros factores de virulencia. Información más reciente utilizando cepas con baja producción de enterotoxina, derivadas de cepas altamente toxigénicas, indican que el mecanismo probablemente responsable de este comportamiento está a nivel de la regulación de la transcripción de los genes que codifican la enterotoxina (19). Para evitar la aparición de falsos negativos, debe considerarse la variación en la producción de la enterotoxina, especialmente cuando se hacen ensayos con sistemas biológicos como son los cultivos celulares y en animales de experimentación. En estas condiciones experimentales el tiempo óptimo para detectar la enterotoxina fue de 72 h. Este lapso incluye las cepas que la producen a las 48 h. 

La separación de los acúmulos celulares y los cambios morfológicos inducidos en la monocapa se debe a que la toxina hidroliza el dominio extracelular de la E-cadherina, proteína primaria de la zonula adherens, de esta manera altera la adhesión celular e incrementa la permeabilidad del epitelio, causando la redistribución intracelular de la actina, con cambios morfológicos en las células (16). 

La presencia en las pacientes sintomáticas de B. fragilis enterotoxigénico en altos porcentajes (77,7%), sin asociación con otros patógenos específicos y su ausencia en los controles sanos, sugiere que la enterotoxina pueda tener un papel importante en la inflamación de la mucosa cérvico-vaginal de estas pacientes. La aparición de otros patógenos en un 22,2%, conjuntamente con B. fragilis enterotoxigénico no excluye la posibilidad de que este anaerobio forme parte de la etiología de este cuadro clínico. Esta circunstancia podría interpretarse como una acción sinergística entre ambos microorganismos en la aparición de la vaginitis.

Aun cuando el mecanismo de acción de la enterotoxina de B. fragilis no está totalmente comprendido, la información disponible permite sugerir que así como actúa sobre la E-caderina del epitelio intestinal, pueda actuar en la E-caderina del epitelio vaginal, ya que esta proteína se encuentra en todos los tejidos epiteliales, incluyendo el de la mucosa vaginal (36) y así podría favorecer la invasión de B. fragilis enterotoxigénico, tal como ocurre con Candida albicans en el epitelio de la mucosa bucal (37).

Esta es la primera investigación que asocia a Bacteroides fragilis enterotoxigénico con la vaginitis infecciosa. Sin embargo, se requieren estudios adicionales para definir su papel etiológico en esta patología, así como la búsqueda de nuevos agentes que puedan explicar el alto porcentaje de vaginitis sin etiología conocida.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a Yolyver Higuerey de la Unidad de Cultivo de Células y Tejidos del Centro de Biofísica y Bioquímica del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), por facilitarnos amablemente la línea celular HT-29.

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