Recibido: 09-12-2011. Aceptado: 07-06-2012

INTRODUCCIÓN

Helicobacter pylori es una bacteria genéticamente diversa, implicada en numerosas enfermedades gastroduodenales tales como gastritis crónica, úlcera péptica, adenocarcinoma gástrico y linfoma de tipo MALT (tejido linfoide asociado a la mucosa, por sus siglas en inglés) (1). Su capacidad para sobrevivir y adaptarse a las condiciones fisiológicas excepcionales de la mucosa gástrica, le permite colonizar y persistir en el estómago durante años (2). A nivel mundial se ha reportado una alta prevalencia de infección por H. pylori, con un alto porcentaje de casos asintomáticos, por lo que es considerada una de las más comunes en humanos con alta morbilidad y baja mortalidad (3). En países desarrollados, se encuentra infectada menos del 30% de la población; mientras que en países en vías de desarrollo, la prevalencia oscila entre el 50 y 90% (4, 5). En Venezuela, estudios recientes han revelado una alta prevalencia de la infección tanto en niños y adolescentes (65%) como en adultos sintomáticos y asintomáticos (46-95%) (6-8). Sin embargo, son pocos los estudios reportados en pacientes asintomáticos a nivel epidemiológico.

En vista de la clara asociación entre esta bacteria y un número importante de enfermedades gastroduodenales, se han desarrollado diversos métodos diagnóstico, de los cuales las técnicas moleculares son las más aplicadas en laboratorios de investigación y clínica, principalmente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), debido a su alta sensibilidad y especificidad (9). A diferencia de otras técnicas como la histología y/o la serología, la PCR permite la rápida detección de genes específicos que contribuyen al diagnóstico y tratamiento adecuado de la infección (10).

A pesar de que H. pylori se desarrolla principalmente en la mucosa gástrica, recientemente se ha encontrado en otros sitios del tracto digestivo superior tales como jugo gástrico y mucosa esofágica; la colonización en esta última es inducida principalmente por el reflujo del jugo gástrico como consecuencia de una hipersecreción ácida del estómago (11). De manera que su presencia ha sido también implicada en patologías severas del esófago, aunque esto no ha sido claramente demostrado (12). No obstante, en Venezuela no hay antecedentes de estudios dirigidos a la validación del uso de biopsias esofágicas para el diagnóstico de la infección por H. pylori.

La detección de H. pylori en el jugo gástrico se ha determinado mediante el uso de la prueba del hilo (o cápsula Entero-test pediátrica), empleada inicialmente para el diagnóstico de parásitos gastroduodenales tales como Giardia lamblia y bacterias como Salmonella enterica serovar Typhi y Mycobacterium tuberculosis (13). Es un método fácil, seguro y poco invasivo para la población general, tanto a nivel clínico como epidemiológico, es altamente sensible y específico con particular valor en niños menores de 3 anos para determinar el comienzo de la infección (10,13).

El diagnóstico por PCR para detectar directamente H. pylori en muestras clínicas provee una sensibilidad tan alta como el cultivo para la detección de la infección (13). Este método puede ser realizado mediante la amplificación de genes esenciales y de virulencia. Los genes esenciales están presentes en todas las cepas y definen el estatus de la infección como glmM que codifica para la enzima fosfoglucosamina mutasa (14) y ureA de la ureasa A (15). Los genes de virulencia definen el grado de patogenicidad de la bacteria de acuerdo al tipo de cepa presente, el gen A asociado a la citotoxina (cagA) es el más estudiado como factor de virulencia de H. pylori (16, 17). De acuerdo al grado de patogenicidad se han definido 2 tipos de cepas, tipo I cagA (+) y tipo II cagA (–) (17). Así mismo, el gen ARN ribosomal 16S ha sido ampliamente usado en estudios taxonómicos y filogenéticos para la detección e identificación de especies del género Helicobacter (18).

En el presente estudio se determinó la prevalencia de la infección por H. pylori en muestras de jugo gástrico y biopsias gastroesofágicas de pacientes dispépticos, mediante la amplificación por PCR de genes esenciales y de virulencia (glmM, ureA y cagA) propios de la bacteria a fin de diagnosticar la infección en muestras de distintas procedencias en el tracto gastroduodenal. 

MATERIALES Y MÉTODOS

Pacientes

Participaron en el estudio 104 pacientes voluntarios dispépticos (con síntomas en el tracto digestivo superior como ardor o acidez, presión abdominal, gases estomacales o flatulencia, náuseas o vómitos y reflujo) (19), con edades comprendidas entre 17 y 70 años, que acudieron por primera vez a consulta médica en el Servicio Oncológico Hospitalario-IVSS de Caracas (antiguo Hospital Padre Machado) entre Octubre del año 2008 hasta Marzo del 2010. En cumplimiento con los requerimientos éticos, todos los pacientes incluidos fueron informados sobre el estudio y firmaron un consentimiento escrito. El criterio de inclusión utilizado fue no haber recibido antibióticos, sales de bismuto o inhibidores de la bomba de protones por al menos un mes previo a la toma de las muestras. El protocolo del estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Bioética del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC) y del Servicio Oncológico Hospitalario-IVSS. 

Tipos de muestras

Antes de realizar la endoscopia, el paciente en ayunas ingirió una cápsula Entero-test pediátrica o prueba del hilo (HDL Corp., USA), que consistió en un hilo de nylon absorbente (90 cm) enrollado dentro de una cápsula de gelatina para facilitar su deglución, de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Una vez ingerida la cápsula, el extremo superior del hilo se fijó a un lado de la boca del paciente y 1 hora después se retiró. Posteriormente, el médico tratante, tomó biopsias gastroesofágicas, durante la endoscopia. De cada paciente se tomaron dos biopsias, una en la región antral del estómago y otra en la mucosa esofágica (tercio inferior y/o 2 cm de la línea Z). Las muestras de hilo con el jugo gástrico absorbido y las biopsias gastroesofágicas fueron transportadas al Laboratorio de Fisiología Gastrointestinal y conservadas a –80°C hasta su procesamiento.

Extracción del ADN 

El hilo con el jugo gástrico absorbido se colocó en un tubo de centrífuga de 15 mL que contenía 10 mL de solución salina (0,9%), se agitó vigorosamente con vórtex y se retiró el hilo. La suspensión se centrifugó a 12000g durante 20 minutos, de acuerdo con el protocolo estandarizado en el Laboratorio de Fisiología Gastrointestinal (10). El ADN genómico del precipitado del jugo gástrico y de las biopsias gastroesofágicas fue extraído utilizando el estuche Mini DNA Qiamp QIAGEN de acuerdo al protocolo del fabricante (QIAGEN, Valencia, CA, USA).

Análisis de PCR específico para el género Helicobacter y especie H. pylori 

Se realizaron cuatro reacciones de PCR por cada muestra de jugo gástrico y biopsias (gástrica y esofágica) de cada paciente. La primera reacción de PCR se realizó para determinar el género Helicobacter, utilizando cebadores que amplifican una región específica del gen ARNr 16S de 399 pb (20) y tres reacciones posteriores para detectar la especie, H. pylori, con cebadores que amplifican dos genes específicos, glmM de 294 pb (21) y ureA de 491 pb (22), y un gen de virulencia, cagA de 128 pb (23). Las reacciones de PCR (PCRs) fueron realizadas mediante el estuche “PCR Master Mix” (Promega Corporation, Madison, USA), en un termociclador modelo GeneAMP PCR System 9700 (Applied Biosystems, Hayward, CA) y con las mismas condiciones de ciclos de amplificación para cada par de cebadores, descritas previamente por los autores. Cada reacción contenía todos los componentes de PCR, más 1 a 6 µL de ADN, 3 µL de la mezcla de cada par de cebadores (concentración final 5 µM) y agua estéril para completar un volumen final de 25 µL. El control negativo de la reacción se realizó sin ADN, mientras que el control positivo correspondió a 1 µL de ADN de una cepa de referencia de H. pylori (Hp26695). Posteriormente, 15 µL de cada reacción de PCR (o amplicon) se visualizó por corrida electroforética con el tampón de carga y bromuro de etidio en un gel de agarosa TBE al 2% permitiendo la detección del producto amplificado.

Análisis estadístico 

Las comparaciones de detección entre tipos de muestras para cada gen y prevalencias en la población estudiada fueron realizadas usando pruebas Chi-cuadrado, con el programa estadístico R2.9.2. Para evaluar el grado de concordancia entre los resultados de detección de los genes de H. pylori, se utilizó el Índice de Kappa. La sensibilidad y especificidad de las muestras usadas fue determinada mediante pruebas diagnósticas simples con un 95% de confianza. Ambas pruebas se realizaron con el programa estadístico Epidat3.1 y tomando como regla dorada la detección en biopsias gástricas.

RESULTADOS

El gen ARNr 16S, perteneciente al género Helicobacter spp., se detectó en 56 (53,8%) de las muestras de jugo gástrico de los 104 pacientes estudiados, 71 (68,3%) de biopsia gástrica y 59 (56,7%) de biopsia esofágica (Tabla I). Los genes glmM y ureA, específicos de H. pylori, se encontraron en proporciones similares a la detección del ARNr 16S, como se indica en la Tabla I. Mientras que el gen cagA se detectó en 32 (30,8%), 38 (36,5%) y 22 (21,2%) de las muestras de jugo gástrico, biopsia gástrica y biopsia esofágica, respectivamente. Este último fue el más variable por ser un gen que puede o no estar presente en el ADN genómico de H. pylori. Al comparar la detección de cada uno de los genes entre tipos de muestras, no se observaron diferencias significativas.

TABLA I. DETECCIÓN DE GENES ESENCIALES Y DE VIRULENCIA DE H. pylori EN MUESTRAS DE JUGO GÁSTRICO, BIOPSIA GÁSTRICA Y BIOPSIA ESOFÁGICA DE PACIENTES SINTOMÁTICOS 

Método estadístico usado: Pruebas diagnósticas simples.    IC: 95%.    ¹N.S.= Diferencia no significativa. 

Dos de los genes de H. pylori utilizados ampliamente para definir el estatus de la infección son el glmM y el ureA. En los 104 pacientes estudiados se encontró que estos dos genes estaban presentes en la mayor parte de las muestras Helicobacter spp. positivas (Tabla I), con una concordancia muy buena en la detección de ambos genes tanto en jugo como en biopsia gástrica (Kappa=0,92 y 0,87; respectivamente) y buena en biopsia esofágica (Kappa= 0,77).

En los tres tipos de muestras estudiadas hubo una alta detección de H. pylori con una prevalencia promedio del 59,6%. Al estudiar la detección de cepas en la población, se encontró una predominancia de cepas tipo I en las muestras de jugo y biopsia gástrica (57,1 y 53,5%, respectivamente) y de cepas tipo II en biopsia esofágica (62,7%). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en la detección de los tipos de cepas entre muestras (Tabla II).

TABLA II. DETECCIÓN DE CEPAS DE H. pylori SEGÚN EL TIPO DE MUESTRA 

Método estadístico usado: Pruebas diagnósticas simples.    IC: 95%.    ¹N.S.= Diferencia no significativa. 

Los resultados obtenidos de las PCRs en biopsias gástricas se tomaron como criterio absoluto o “regla dorada” para la evaluación de la infección por H. pylori en las muestras de jugo y biopsia esofágica. La sensibilidad de las PCRs en estos tipos de muestras fue de 79 y 83%, respectivamente, mientras que la especificidad fue del 100% en ambas (Tabla III). 

TABLA III. SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DEL DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN POR H. pylori EN JUGO GÁSTRICO Y BIOPSIAS ESOFÁGICAS EN RELACIÓN A BIOPSIAS GÁSTRICAS 

Método estadístico usado: Pruebas diagnósticas simples. IC: 95%. 

DISCUSIÓN 

En los tres tipos de muestras estudiadas hubo una alta detección de H. pylori, lo que demuestra un diagnóstico seguro de la infección en el tracto digestivo superior. El hilo gástrico permite la recolección de bacterias presentes en el jugo gástrico para la obtención de ADN o de cepas bacterianas, con una mínima incomodidad para el paciente, durante en el proceso y una alternativa viable para el diagnóstico de la infección por H. pylori (10, 13). La toma de muestras de jugo gástrico para detectar H. pylori es poco empleada en Venezuela, a pesar de que es una técnica fácil de realizar. Se basa en la adhesión de las bacterias circulantes en el jugo gástrico a un hilo de nylon, que llega hasta la primera porción del duodeno (10). Los inconvenientes asociados a este método se presentan por contaminación u obtención insuficiente de muestra debido a una baja concentración bacteriana y poco jugo gástrico presente, así mismo, al realizar este tipo de muestreo no se puede establecer el nicho exacto de la bacteria, por lo que es probable que la detección provenga del estómago, esófago, u otro lugar a lo largo del tracto gastroduodenal (8).

Las biopsias gástricas, por su parte, son ampliamente usadas para la detección de H. pylori o cepas bacterianas (13), aun cuando son obtenidas por un método invasivo y representan una molestia para el paciente. Este es el primer estudio, del conocimiento de los autores, en el que se utilizan biopsias esofágicas para la detección de H. pylori en pacientes sintomáticos venezolanos. Su uso a nivel mundial con fines diagnóstico está dirigido principalmente al papel que juega la bacteria en patologías del esófago, como esofagitis por reflujo o enfermedad por reflujo gastroesofágico, esófago de Barrett y carcinoma esofágico (25, 26), hecho que aun sigue siendo controversial y que no ha sido claramente establecido. Sin embargo, hasta el presente no se conocen estudios previos sobre la validación de esta técnica como prueba diagnóstica de la infección en las muestras clínicas. Estudios recientes en el laboratorio han mostrado una alta prevalencia de H. pylori en la mucosa gastroesofágica (86%) de pacientes dispépticos, lo cual sugiere que la existencia de esta bacteria en el esófago es probablemente una consecuencia de la infección gástrica, mas no es la especie residente dominante (24). 

La semejanza encontrada al comparar la detección de H. pylori en las muestras de jugo y biopsias gastroesofágicas, sugiere que la distribución de la bacteria en el tracto gastroduodenal superior no está restringida únicamente a la mucosa gástrica sino que, en la mayoría de los casos puede ser encontrada de forma generalizada. Ello explicaría por qué H. pylori puede ser detectada independientemente del tipo de muestra. Así mismo, la alta detección encontrada en la mucosa esofágica apunta a la realización de otros estudios que ayuden a comprender cómo esta bacteria reside en el esófago, donde el pH es relativamente neutro (pH 6) y no requiere, aparentemente, de una adaptación drástica para su colonización, dado que las condiciones imperantes son diferentes a las del estómago en cuanto a pH, estructura celular y funcionamiento. 

En el presente estudio, se utilizó una región interna conservada del gen ARNr 16S como marcador para la detección del género Helicobacter spp. La alta detección encontrada en la mucosa gástrica, indica una mayor prevalencia de H. pylori en el estómago aunque esta diferencia no fue significativa. Los genes glmM y ureA fueron encontrados en el 100% de las muestras Helicobacter spp. positivas, lo cual sugiere la ausencia de especies de Helicobacter no-pylori en las muestras estudiadas. 

En Venezuela, la prevalencia reportada de la infección gástrica por H. pylori es alta, en un rango de 45 a 95% en la población sintomática (9-10, 27-29), lo cual coincide con lo encontrado en este estudio. Asimismo, la prevalencia de la infección en jugo gástrico por PCR fue similar a la reportada en un estudio previo en Venezuela (48,9%) (10) y menor a la encontrada en Perú (64,8%), otro país latinoamericano en vías de desarrollo (13). 

El gen cagA, que codifica para una proteína altamente inmunodominante, denominada CagA, es un gen variable cuya presencia está asociada con un mayor grado de patogenicidad de la bacteria (30-33). En este estudio se encontró que la prevalencia de cepas tipo I (cagA+) en jugo y biopsia gástrica es similar y en biopsia esofágica es menor, mientras que la prevalencia de las cepas tipo II (cagA-) es mayor en biopsia esofágica en relación con el jugo y biopsia gástrica. Esta predominancia de cepas por tipo de muestra sugiere que existe una multi-infección de H. pylori en el tracto digestivo superior. La prevalencia de cagA en los 3 tipos de muestras se encuentra dentro del rango reportado en estudios previos en Venezuela y en otros países (32 a 77%), utilizando diferentes técnicas diagnósticas como serología y ensayo de sonda lineal (Line probe assay) (28-29, 34-37). 

Finalmente, el estudio de PCR mostró una detección de H. pylori similar en jugo y en biopsias esofágicas con una alta sensibilidad y especificidad al ser comparados con biopsias gástricas, lo cual indica que ambos tipos de muestras pueden ser utilizados eficazmente para un diagnóstico seguro de la infección, empleando genes esenciales y de virulencia propios de la bacteria. 

AGRADECIMIENTOS 

Este trabajo fue financiado por Misión Ciencia, Proyecto de Investigación y Desarrollo en Red Nº 2007001442. Sub-proyecto Bacterias, sub-objetivo 1.3.2. H. pylori. 

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