El ligando para el receptor c-Met es el factor de crecimiento del hepatocito (HGF), el cual fue inicialmente identificado como un potente mitógeno para los cultivos primarios de hepatocitos a partir del suero de ratas con hepatectomías parciales (8). HGF fue aislado de varias fuentes, incluyendo las plaquetas de rata (9), suero de pacientes humanos con falla hepática (10) y suero de conejo (11). HGF es considerado el mayor mediador en la regeneración hepática in vivo (12). HGF es conocido por estimular el crecimiento de otros tejidos epiteliales, tales como epitelio tubular renal, queratinocitos (13), células endoteliales y melanocitos (14). 

El receptor c-Met ha sido encontrado con sobreexpresión en los canceres gástrico (15), colorrectal (16), pulmonar (17), tiroideo (18), renales (19), ovárico (20) y de mamas (21). Además se ha reportado acerca del pobre pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico productor de alfa-fetoproteínas (22) y se ha encontrado una alta frecuencia en la expresión del receptor c-Met en este tipo de cáncer gástrico (23). Recientemente se ha publicado un estudio en donde se observó una alta expresión del receptor c-Met a nivel proteico en pacientes venezolanos con estadios avanzados (III y IV) con respecto a pacientes en estadios precoces (I y II) del cáncer gástrico, encontrando además sobreexpresión del receptor c-Met en las variables histológicas con bajo grado de diferenciación, mayor invasión tumoral, metástasis hepática y se reportó una sobrevida menor de los pacientes con mayor expresión del receptor comparados con el grupo de menor expresión (24). 

Motivados por las investigaciones previas y desconociendo la existencia de publicaciones en español, en las que se evalúe a nivel molecular el ARNm del receptor c-Met en el cáncer gástrico, se ha propuesto realizar el presente estudio a objeto de determinar por RT-PCR la amplificación del receptor c-Met en pacientes con cáncer gástrico diagnosticados en la ciudad de Barquisimeto, estado Lara, Venezuela. 

PACIENTES Y MÉTODOS 

Pacientes 

Se realizó un estudio poblacional, longitudinal y transversal, en el que se incluyeron en este estudio 12 pacientes a quienes se les practicó gastrectomía total o subtotal por presentar diagnóstico de cáncer gástrico en la Clínica Razetti de Barquisimeto, Estado Lara, Venezuela, en el período comprendido entre Marzo 2008 hasta Marzo 2012. 

El aspecto bioético del trabajo fue discutido y aprobado por la comisión de Bioética de la Clínica Razetti y a cada paciente se les explicó sobre los procedimientos a realizar en los especímenes tomados de las gastrectomías por cáncer gástrico, y se les solicitó sus firmas para la hoja del consentimiento informado.

Extracción del ARN total 

Se recolectaron muestras tanto de tejido tumoral con cáncer gástrico y tejido gástrico sano de los pacientes que fueron intervenidos en la Clínica Razetti de Barquisimeto, siendo congelados inmediatamente con nitrógeno líquido, posteriormente fueron almacenados en un refrigerador de –80°C hasta la extracción del ARN total. 

Para la extracción del ARN total se utilizó el método del ácido guanidina-tiocianato-fenol-cloroformo (Trizol Reagent, Invitrogen) con modificaciones menores como previamente se describe (25, 26). Brevemente, cada muestra de tejido fue pulverizado dentro del nitrógeno líquido, y se le agregó la solución denaturizante conteniendo 4M de guanidina-tiocianato. Secuencialmente, se le agregó 2M de acetato sódico, fenol saturado en agua y cloroformo/isoamyl alcohol. El ARN total se separó por centrifugación y fue precipitado con isopropanol. El precipitado del RNA se disolvió en la solución denaturizante y fue reprecipitado con isopropanol, se lavó con 70% de etanol y finalmente se disolvió en agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC).

RESULTADOS

Características clinicopatológicas de los pacientes

Del total de 12 pacientes incluidos en éste estudio, 2 pacientes fueron del género femenino (17%) y 10 pacientes del masculino (83%). La edad de los pacientes osciló de 28 a 75 años (X ± DE: 57,42 ± 13,26 años). 

En cuanto al grado de diferenciación del tejido tumoral, en el 50 % de los casos presentaron adenocarcinomas moderadamente diferenciados, en el 25 % los poco diferenciados, y para las células en anillo de sello, papilar y el bien diferenciado correspondió a 1 paciente respectivamente. 

Según la profundidad de la invasión tumoral en la pared gástrica, fue más frecuente hasta la serosa (T4a) con 6 casos (50%), seguidos de la infiltración neoplásica que sobrepasa la serosa (T4b) con 3 pacientes (25%), y un caso cada uno en los niveles T1b (submucosa), T2 (muscularis mucosa) y T3 (subserosa). Con estos resultados, el 91,7% de los pacientes (n=11) presentaron cáncer gástrico avanzado. 

Se observó infiltración tumoral en varios órganos en una paciente (peritoneo parietal, peritoneo visceral de asas delgadas, páncreas y epiplón mayor), en otro paciente en 2 órganos (páncreas y colon) y en 2 casos presentaron infiltración a un órgano (epiplón mayor y páncreas respectivamente). Y en el resto de los pacientes (n=8, 66,7 %), no presentaron evidencias de infiltración a órganos vecinos o metástasis. 

En relación al número de ganglios linfáticos afectados, se observó que predominó el N2 (metástasis de 3 a 6 ganglios linfáticos) con 4 casos (33,3 %), seguidos de N3a (metástasis de 7 a 15 ganglios linfáticos) y N3b (mayor de 16 ganglios linfáticos invadidos) ambos con 3 pacientes (25% cada uno), y un caso cada uno para N0 (sin afectación en los ganglios linfáticos) y N1 (invasión de 1 a 2 ganglios linfáticos). 

De acuerdo a la última edición del TNM (27) para el estadiaje del cáncer gástrico se clasificó en: IA: 1 paciente; IB: 0 pacientes; IIA: 1 paciente; IIB: 0 pacientes; IIIA: 1 paciente; IIIB: 3 pacientes; IIIC: 4 pacientes y IV: 2 pacientes.

Amplificación del ARNm del receptor c-Met en especímenes de cáncer gástrico 

Se analizaron los niveles del ARNm del receptor c-Met en los especímenes congelados del carcinoma gástrico como de tejido normal del estómago de 12 pacientes por el método semicuantitativo de la RT-PCR. 

El ARNm del receptor c-Met se observó en todas las muestras tanto tumorales como de tejidos gástricos normales de los 12 pacientes (Fig. 2).

Al analizar los tejidos tumorales de los pacientes, se encontró altos niveles del ARNm del receptor c-Met en el grupo de pacientes con invasión tumoral en profundidad T4 (27), con respecto a las categorías T3, T2 y T1. Además, se observó que a mayor amplificación en el ARNm del receptor c-Met, fue mayor la invasión tumoral en la profundidad de la pared gástrica (r = 0,762, p<0,01) (Fig. 3). Con respecto a la invasión hacia los ganglios linfáticos según la clasificación de la AJCC (27), el grupo N3 presentó altos niveles del ARNm del receptor c-Met comparados con los grupos N1 y N0, evidenciándose una relación positiva entre la amplificación del ARNm con el grado de infiltración a los ganglios linfáticos (r = 0,766, p<0,01) (Fig. 4). En cuanto al tipo histológico del cáncer gástrico según la JRSGC (28), se observó correlación con significancia estadística en donde los tumores con bajo grado de diferenciación presentaron elevados niveles del ARNm del receptor c-Met (r = 0,912, p<0,001) (Fig. 5). Al evaluar los niveles del ARNm con el estadio del cáncer gástrico, se encontró amplificado el ARNm del receptor c-Met en los estadios III y IV con respecto a los estadios I y II, con una relación directamente proporcional entre el estadio del tumor con respecto al ARNm (r = 0,838, p<0,001) (Fig. 6).

En el cálculo del coeficiente de regresión, se observó que por cada unidad densitométrica de la amplificación del ARNm del receptor c-Met, aumentan las siguientes variables: Invasión tumoral en la profundidad de la pared gástrica en 0,93; infiltración a los ganglios linfáticos en 0,87; histopatología hacia patrones menos diferenciados en 0,757 y el avance en el estadio del cáncer con 0,814 respectivamente.

Se apreció una elevada amplificación del ARNm del receptor c-Met en las especímenes tumorales comparados con los de tejido normal en los pacientes con estadio avanzado del cáncer gástrico (p<0,001) mientras que no hubo diferencias significativas en los niveles del ARNm del receptor c-Met en las muestras tumorales y normales de los pacientes con estadio precoz (p=0,144).

Inmunorreacción del receptor c-Met en especímenes de cáncer gástrico 

En la evaluación del receptor c-Met a nivel proteínico, se observó una fuerte expresión de tipo granular predominantemente en el citoplasma de las células tumorales (Fig. 7). En la Tabla I se detalla las características clinicopatológicas de los pacientes y la expresión del receptor c-Met por IHQ.

El análisis de la correlación de Pearson mostró una relación positiva significativa entre los niveles del ARNm a nivel genético con respecto a la expresión a nivel proteico del receptor c-Met en los especímenes de pacientes con cáncer gástrico (r = 0,858, p<0,001) (Fig. 8). Finalmente, el coeficiente de regresión demostró un aumento en la IHQ de 0,957 por cada unidad densitométrica de la amplificación del ARNm del receptor c-Met.

DISCUSIÓN 

Hay un incremento en las investigaciones a nivel de la biología molecular en el carcinoma gástrico. Pero no existe en la literatura en español reportes sobre la relación de la amplificación a nivel molecular del ARNm del receptor c-Met con el cáncer gástrico. Por tales motivos, surge este estudio en la región Centro-Occidental de Venezuela, para así comparar los resultados con los publicados en los reportes internacionales.

El 91,7% de los pacientes en este estudio presentaron cáncer gástrico avanzado, y de ellos, el 75% se encontraba en T4, quienes presentaron elevados niveles en el ARNm del receptor c-Met en comparación con los casos catalogados como T1, T2 y T3. Tsugawa y colaboradores (32) reportaron una incidencia alta de diseminación peritoneal en los pacientes con amplificación genética del c-Met. En ésta investigación, se evidenció que hubo diseminación en peritoneo parietal anterior y posterior, así como también en peritoneo visceral de asas delgadas en la misma paciente, quien presentó la más alta amplificación del ARNm del receptor. En los pacientes con invasión linfática N2 y N3, se apreció una amplificación del ARNm del c-Met en el 83,3% de los casos, al relacionarlos con los grupos N1 y N0, en concordancia con estudios previos (33). 

Además del análisis de la amplificación del ARNm del c-Met por medio del RT-PCR, se evaluó a nivel protéico de dicho receptor por medio del método de IHQ, encontrando que los pacientes con alta expresión del receptor c-Met, presentaron mayor invasión tumoral en la profundidad de la pared gástrica, infiltración a órganos vecinos, así como también hacia los ganglios linfáticos (N2 y N3), observándose mayor expresión (++++) en los tumores menos diferenciados y en los casos en estadios avanzados del cáncer gástrico (III y IV). 

Nakajima y colaboradores reportaron que tanto la amplificación genética y la sobreexpresión de la proteína del receptor c-Met en el cáncer gástrico, están relacionados con el grado de invasión en la profundidad de la pared gástrica, a los ganglios linfáticos y al pobre pronóstico de los pacientes (33). Se ha demostrado además, que los pacientes con amplificación genética del receptor c-Met, presentaron un período libre de enfermedad más corto (p=0,0216) y una sobrevida general más baja (p=0,0134) comparado con el grupo de pacientes sin amplificación genética (34). En un estudio previo, pero a nivel de la proteína del receptor c-Met, se observó que los pacientes que mostraron alta expresión en la inmunorreactividad del receptor c-Met, presentaban una supervivencia muy pobre (24). En la presente investigación, hubo una correlación entre las expresiones del ARNm con el de la proteína del receptor c-Met, demostrándose que mientras mayor era la amplificación genética en el ARNm, se apreciaba mayor inmunorreacción en la proteína del receptor, en línea con reportes previos (35). Sin embargo, otros autores, observaron que en tejidos como riñón, tiroides, placenta y páncreas, presentaron niveles elevados del ARNm del c-Met, pero no se correlacionaban debido a la inmunorreactividad apenas detectable en la proteína del receptor c-Met por IHQ (36). Una explicación pudiera ser una vida media extremadamente corta del ARNm del receptor c-Met en el mecanismo postranscripcional reportado en líneas celulares de carcinoma humano derivados del ovario, mama, endometrio, y que pudiera estar regulado de manera diferente para cada tejido (31). 

Tajima y colaboradores, utilizando el HGF recombinante humano con I125, describieron una correlación entre la amplificación del ARNm del c-Met con la afinidad del receptor a su ligando en varias líneas celulares (36). Los niveles séricos del HGF fueron reportados elevados en los pacientes con cáncer gástrico, asociados a mayor invasión tumoral en la pared gástrica e infiltración de células cancerosas en los capilares venosos dentro del tumor (37). En una investigación aparte, el 61,5 % de los pacientes portadores de cáncer gástrico, se les detectaron la amplificación del ARNm del receptor c-Met en las células tumorales circulantes en la sangre periférica utilizando la técnica del RT-PCR, y fueron asociados a invasión tumoral y metástasis a ganglios linfáticos (38).

En estudios previos, se ha encontrado un alto grado de expresión proteica y amplificación genética del receptor c-Met en el grupo de pacientes con cáncer gástrico primario con metástasis hepática comparado con el grupo sin metástasis hepática (26). En una investigación similar, se observó un nivel elevado del ARNm del receptor c-Met usando el método RT-PCR en los tejidos con cáncer colorrectal primario con respecto al tejido normal, encontrando además una sobreamplificación del ARNm del receptor c-Met en el tejido hepático metastásico (39). De esta manera, la amplificación del ARNm del receptor c-Met, es uno de los mecanismos para la activación de la carcinogénesis, demostrando su rol en la progresión de las células tumorales hacia fenotipos más agresivos en el carcinoma gástrico (26, 29, 32). Así mismo, en el presente trabajo se demostró que los elevados niveles del ARNm del receptor c-Met está correlacionado a mayor invasión tumoral en la profundidad de la pared gástrica, incremento en la metástasis a los ganglios linfáticos, alta frecuencia en tumores pocos diferenciados o indiferenciados, aumento en el estadiaje del cáncer gástrico, y en la sobreexpresión por IHQ de su receptor a nivel proteico en los pacientes con carcinomas gástricos. 

Por todo lo discutido anteriormente, la amplificación del ARNm y/o la sobreexpresión a nivel proteico del receptor c-Met, pudieran ser utilizados como factores pronósticos y como potencial blanco terapéutico tanto a nivel genético como a nivel de la proteína del receptor c-Met en el cáncer gástrico. 

AGRADECIMIENTOS 

El nitrógeno líquido utilizado para congelar los especímenes fue obtenido por la colaboración de la planta productora de dicho elemento ubicado dentro del Decanato de Ciencias Veterinarias de la Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado” (UCLA) y luego fueron almacenados en un refrigerador de –80°C localizado en el Laboratorio de Microbiología del Decanato de Ciencias de la Salud de la UCLA que gentilmente nos facilitaron hasta la extracción del ARN total. Se decidió realizar las tomas de las muestras del tejido gástrico en la Clínica Razetti debido al apoyo recibido por parte de la Unidad FECUNDAR para el depósito transitorio de las muestras dentro los envases especializados que contiene nitrógeno líquido hasta su traslado al refrigerador de –80°C. 

A la profesora María Eugenia Camargo, adscrita al Departamento de Ciencias Funcionales, Sección de Bioquímica, Laboratorio de Genética Molecular “Dr. Yunis Turbay” de la UCLA, por su importante colaboración en la extracción del ARN total, y en el análisis de la intensidad de las bandas del ARNm. 

Al Dr. Douglas García, adscrito al Departamento de Medicina Preventiva y Social, Sección de Epidemiología y Bioestadística de la UCLA, por sus valiosos consejos en la revisión del manuscrito. 

Este trabajo fue financiado por el Consejo de Desarrollo Científico, Humanístico y Tecnológico (C.D.C.H.T.) de la UCLA. 

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