Defensinas

Las defensinas son péptidos catiónicos de pequeño tamaño, presentes en un gran número de especies tanto en el reino animal como en el reino vegetal ¹⁵. Fueron reportadas por primera vez en el bovino en 1991 ¹⁶ y, posteriormente, en un estudio realizado por Jones y Bevins en 1992 ¹⁷ y se describieron en el epitelio intestinal humano con un papel importante en la respuesta inmunitaria innata con actividad antiviral y antibacterial potente ¹⁸. Desde su descubrimiento, han sido intensamente investigadas por su actividad antimicrobiana y sus funciones inmunomoduladoras multifacéticas bajo condiciones fisiológicas y patológicas ^19,20. Es por ello que actualmente se les ha renombrado como péptidos de defensa del hospedador (PDH) ^9,15, considerando su función y participación en el proceso de cicatrización ^21,22, la homeostasis y el manejo de la diversidad del microbioma.

Las defensinas están constituidas por 16 a 50 aminoácidos, con un peso molecular de 3-4.5 kDa y una alta concentración de arginina; su estructura contiene hojas beta plegadas con 6 residuos de cisteína estabilizadas por tres enlaces disulfuro intramoleculares conservados ^19,23,24. De acuerdo a la topología de los enlaces disulfuro, se clasifican en defensinas alfa, beta y teta (α, β y θ)¹⁹. Actualmente, se han identificado 6 tipos de α-defensinas en humanos ^19,25,26,27 y 31 tipos de β-defensinas, de las cuales, solo las β-defensinas 1, 2, 3, 4, 5 y 6 (hBD-1, hBD-2, hBD-3, hBD-4, hBD-5, hBD-6) han sido aisladas de los tejidos humanos ²⁸. La θ-defensina se expresa en el reino animal y se encuentra exclusivamente en los monos. Se presentan 6 isoformas en los macacos rhesus y la isoforma Defensina Teta Rhesus-1 (DTR-1) es la más abundante ^18,29.

β-defensinas

Las β-defensinas más estudiadas son la hBD-1, hBD-2, hBD-3, hBD-4. La hBD-1 es secretada de forma constitutiva; se expresa en el tracto genitourinario y respiratorio ¹⁹. La hBD-1 puede ser modulada por mediadores inflamatorios, mientras que la hBD-2 y hBD-3 son expresadas al ser estimuladas por citocinas proinflamatorias ^30-33.

En algunas condiciones como el embarazo se presenta un incremento significativo de hBD-1, lo cual sugiere que otros factores no infecciosos la podrían inducir ^34,35. La hBD-2 se encuentra en el epitelio de las superficies internas y externas del cuerpo humano, tales como la piel y el tracto respiratorio e intestinal. Este tipo de defensina es inducida por un estímulo infeccioso ³⁰. Se ha observado que existe una expresión basal mínima, la cual aumenta enormemente mediante la inducción de patrones moleculares asociadas a patógenos (PAMPs) tales como lipopolisacáridos, peptidoglucanos, lipoarabinomanano o algunas citocinas proinflamatorias como el Factor de Necrosis Tumoral alpha (TNF-α), Interleucina-1beta (IL -1β) e Interferón gamma (IFN-γ) ^30,36. La hBD-3, al igual que la hBD-2, es inducible por estímulos inflamatorios y es detectable in vitro posterior a la coestimulación con IL -1 o TNF-α ³⁷. Este tipo de defensina es de mayor tamaño (5kD) y su mecanismo de acción es similar a las anteriores defensinas. Es posible detectarla en células epiteliales del tracto respiratorio, genitourinario, piel, amígdalas, corazón y músculo esquelético; igual que las otras hBDs tienen un amplio espectro de acción antimicrobiano ^34,35,38.

La hBD-4 se expresa en testículo, estómago, útero, tiroides, pulmón, riñón y neutrófilos; además, se expresa en células epiteliales de la cavidad oral ^39-41. Ha sido poco descrita en la EP, aunque podría tener actividad bactericida y fungicida, además de actividad quimiotáctica para monocitos, siendo inducible por algunas citocinas y PAMPs; sin embargo, se inactiva con altas concentraciones de sal. García y col. ¹¹, se refieren a esta defensina como la más potente de todas, aunque esto no ha sido comprobado en otros estudios ^36,40,41.

En el epitelio oral normal, el RNAm para hBD-1 y hBD-2 se expresan fuertemente en el estrato espinoso, granuloso y corneo ^30,42,43. En los tejidos gingivales, hBD-1 y hBD-2 se encuentran localizadas en el epitelio del surco, pero no en el epitelio de unión; esto podría deberse a la diferenciación de los queratinocitos en los estratos del epitelio (Fig. 1) ³⁰.

Fig. 1 Expresión de las β-defensinas 1,2 y 3 en el estrato basal, espinoso y granuloso del epitelio en salud periodontal. 

Los patrones de localización para hBD- 3 en el epitelio escamoso estratificado, podrían ser los mismos para hBD-1 y hBD-2; sin embargo, hBD-3 ha sido localizada principalmente en el estrato basal del epitelio gingival, por lo que se ha propuesto que podría ser el vínculo entre epitelio gingival y el tejido conectivo, funcionando como enlace entre la inmunidad innata y adaptativa ^30,44,45. De igual manera, las hBDs han sido localizadas en las glándulas salivales y en el fluido crevicular. En este sentido, se ha encontrado la presencia del ARNm de hBD-1, 2 y 3 en la glándula parótida, submandibular y las glándulas salivales menores ^25,46.

Las defensinas son activas contra bacterias Gram positivas y Gram negativas, hongos y virus, incluyendo especies de microbios orales como son: A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia y F. nucleatum^47,48. La capacidad antibacteriana de las hBDs depende de su concentración en la saliva, siendo para hBD-1 150 ng/mL, hBD-2 450-550 ng/mL, mientras que para hBD-3 es de 730 ng/mL ⁴⁷. Estas concentraciones son suficientes para desarrollar su actividad bactericida por sí mismas o actuando en sinergia con otros factores bactericidas presentes, tales como la histatina-5, lactoferrina, mucinas y lisozima ^12,42,50.

Se ha estudiado la expresión de estas moléculas en estados patológicos y han sido comparadas en individuos libres de enfermedad; por ejemplo, se ha documentado la elevación de hBD-2 en saliva no estimulada de niños con caries dental de 6-12 años en comparación con niños sanos (Tabla 1) ^51,52. Sin embargo, existen algunas condiciones que pueden afectar la actividad antimicrobiana de las hBDs tales como las altas concentraciones de sodio en la saliva, ya que altera la unión del AMP a la bacteria ⁴⁸. En condiciones óptimas las hBDs responden a diversas bacterias, virus, parásitos e infecciones fúngicas ¹⁵. Estos péptidos catiónicos interaccionan con las cargas negativas de las membranas de las bacterias Gram positivas y negativas, de igual forma sobre hongos y virus con envoltura.

El mecanismo de acción biológico lítico de los AMPs que inlcuyen a las hBDs, se da mediante cinco pasos. En primer lugar, los AMPs interactúan con los fosfolípidos de la membrana de la célula del hospedador estableciendo un contacto primario con las células blanco a través de interacciones electrostáticas e hidrofóbicas; en segundo lugar, ocurre un ajuste estructural en la membrana celular (conformación en una estructura de hélice o barril); en tercer lugar, se presenta una acumulación hasta un nivel estequiométrico activo; en cuarto lugar, se presenta una alteración de la membrana a través de la permeabilización o despolarización, ocasionando alteraciones en su función que puede ser transitoria o estable y, finalmente, la muerte de la bacteria ⁵⁴.

Se han propuesto algunos modelos hipotéticos para la formación de poros en la membrana, tales como el modelo en forma de barril, poro toroidal, alfombra y agregado. Respecto al modelo de barril, al presentarse un aumento en la cantidad y/o expresión del péptido que se une a la membrana, se produce agregación y una transformación conformacional que ocasiona el desplazamiento de los fosfolípidos locales y el adelgazamiento de la membrana ⁵⁵.

Durante el proceso de penetración dentro de la bicapa fosfolipídica, las regiones hidrofóbicas helicoidales de los péptidos de α-hélice y los péptidos de hoja β-plegada están cerca de las regiones hidrofóbicas del fosfolípido de la membrana, mientras que las regiones hidrofílicas de las hélices peptídicas están hacia dentro; de esta forma, las moléculas se disponen en paralelo para formar la luz central ⁵⁶.

El mecanismo del modelo de poro toroidal es similar al del modelo de barril, la diferencia es que en el modelo de poro toroidal las hélices peptídicas se insertan en la membrana y se unen a los lípidos para formar complejos de poro toroidal. Los AMPs acumulados localmente en altas concentraciones inducen la deformación de la flexión en las moléculas lipídicas, lo que permite que los péptidos y la cabeza de los grupos lipídicos se inserten dentro del centro hidrofóbico de los lípidos ⁵⁶.

En el modelo de alfombra, se requieren altas concentraciones de AMPs para formar micelas y la consecuente destrucción de la membrana microbiana ⁵⁵.

Cuando la concentración del péptido alcanza el umbral, los AMPs cubren la membrana en grupos y provocan su ruptura de manera similar a un surfactante. No se produce la formación de canales, ni inserción de los péptidos en el centro hidrofóbico de la membrana. Este efecto es lo suficientemente potente para inducir la lisis total o parcial de la membrana celular; los AMPs al atravesarla actúan sobre moléculas intracelulares ocasionando la muerte celular (Fig. 2) ⁵⁷.

Fig. 2 Clasificación de los mecanismos de acción de los péptidos antimicrobianos y β-defensinas. 

En el modelo de agregado, los AMPs se unen a la membrana citoplasmática aniónica, obligando a los péptidos y lípidos a formar una micela en un complejo péptido-lípido ⁵⁸.

A diferencia del modelo de alfombra, los canales formados por AMPs, los iones de lípidos y agua permiten que el contenido intracelular se filtre y provoquen la muerte celular. Estos canales también pueden ayudar a que los AMPs se transfieran al citoplasma y ejerzan su función. Este mecanismo explica por qué los AMPs no solo se dirigen a la membrana citoplasmática, sino que también pueden atravesar la membrana hacia el citoplasma para actuar sobre moléculas intracelulares ⁵⁷. De esta forma por su naturaleza anfipática, las hBDs son capaces de insertarse en la membrana fosfolipídica de los patógenos, ocasionando así, la destrucción de la membrana celular ^15,59. De igual manera, las hBDs tienen objetivos intracelulares e interfieren con los procesos metabólicos, incluyendo la síntesis de componentes celulares de vital importancia (Fig. 2) ⁶⁰.

Por otra parte, existen algunas condiciones que pueden alterar la efectividad de las hBDs como lo es el cloruro de sodio (NaCl). La presencia de NaCl (100mM) reduce la actividad antimicrobiana de hBD-1 y 2 entre un 50-80% hacia A. actinomycetemcomitans y S. mutans; sin embargo, la actividad antimicrobiana de hBD-3 no se ha visto afectada (200mM) ⁴⁸. En la cavidad oral, las hBDs están expuestas constantemente a los iones en la saliva que contienen 800mM de NaCl. La concentración de NaCl salival es menor de la que se necesita para inactivar a las hBDs; sin embargo, el NaCl no es el único ión presente en la saliva ⁴⁸. De hecho, el efecto orquestado de los iones salivales de Sodio (Na²⁺), Magnesio (Mg²⁺⁺) y Calcio (Ca²⁺⁺), pueden afectar parcial o totalmente la función de las hBDs; por lo tanto, es plausible que estos péptidos sean inactivos contra las bacterias fuera de los tejidos, así como en la saliva ⁴⁸.

En estudios experimentales en ratas libres de gérmenes, se ha observado la producción de precursores de hBDs en ausencia de infección ¹⁵. Estudios in vitro en células renales embrionarias, han descrito la expresión de diferentes receptores tipo Toll (TLRs) y hBD-3 mediando la activación de la transcripción del factor NF-κB, que dependen de la expresión de TLR1 y TLR2; esto demuestra que la señalización de TLRs no está restringida de manera única a PAMPs sino que también puede ser iniciado por hBDs ¹⁵. Las hBDs se consideran como un enlace entre la respuesta inmunitaria innata y adaptativa, de tal manera que se ha reportado que la hBD-3 puede intervenir rápidamente estimulando macrófagos vía TLR-4 e impedir la expresión de genes proinflamatorios ¹⁵. De igual manera, inducen la expresión de moléculas coestimuladoras sobre monocitos y células dendríticas (CDs) mieloides dependientes de TLRs, actuando como quimiotáctico para linfocitos T y células dendríticas inmaduras¹⁵. Las observaciones experimentales y clínicas sugieren que las hBDs son capaces de activar a los macrófagos y favorecer la respuesta proinflamatoria a través de ligandos para TLRs; sin embargo, es necesario ampliar los estudios tanto en animales como en humanos para esclarecer este punto.

A lo largo de la evolución las hBDs han adquirido roles adicionales en un proceso conocido como neofuncionalización, mientras mantienen su rol de defensa original ¹⁵. Se considera que las funciones inmunomoduladoras de las hBDs ^61,62 no son mutuamente exclusivas y, por lo tanto, no se deben compartimentalizar sus funciones en una u otra, sino deben ser vistas como parte de la evolución en progreso, como elementos críticos con múltiples roles en funciones complejas contra enfermedades, es por ello que la expresión a través de las mucosas los implica como mediadores fundamentales y centinelas de la homeostasis y la salud ¹⁵.

β-defensinas en salud y enfermedad periodontal

La salud periodontal es definida como la ausencia de inflamación clínicamente detectable ⁶³. La cavidad oral es un ambiente expuesto a una multitud de bacterias; en promedio 800 especies residentes, de las cuales de 150 a 200 son típicamente encontradas en muchos individuos ^1,64. Estas bacterias son increíblemente complejas y forman comunidades diferentes que viven sobre los O. D., lengua, paladar duro y tejidos epiteliales ⁶⁴. La gingivitis inducida por placa y la periodontitis son consideradas como procesos inflamatorios, en los cuales existe una disrupción de la homeostasis provocada por la presencia de una biopelícula, que de manera inicial, se presenta en una forma incipiente y, en la medida que progresa, se convierte en una forma disbiótica hasta ocasionar la destrucción de los tejidos de soporte del O. D., como se ha mencionado con anterioridad ^1,65. La flora bacteriana es controlada inicialmente por el sistema inmunitario innato del epitelio oral, la saliva y el fluido crevicular a través de proteínas y AMPs ⁶⁵. Por otro lado, al presentarse un desequilibrio entre la flora oral normal y los patógenos, se forma rápidamente la biopelícula oral sobre la superficie dental; si esto no se corrige, la inflamación gingival progresará posiblemente hacia una periodontitis produciendo pérdida ósea alveolar y finalmente la pérdida dental ⁶⁶. La función de los AMPs en la cavidad oral no solo se limitan a controlar el crecimiento bacteriano, sino también a prevenir el crecimiento de la biopelícula. Para tales efectos, bloquea -de manera directa- la aparición de mecanismos de resistencia bacteriana o interfiere con los sistemas de la regulación de la expresión génica, en respuesta a las fluctuaciones en la densidad de población celular de la comunidad bacteriana ⁶⁷. Todo ello representa una condición primordial para controlar la EP y mantener la salud periodontal clínica ⁶⁸. La inflamación es una respuesta de los tejidos vasculares en la que el sistema inmunitario del hospedador actúa para eliminar la fuente inductora del estímulo inflamatorio ⁶⁸. Las infecciones microbianas como la gingivitis inducida por placa y la periodontitis comienzan como una inflamación. Se presenta como una secuencia de eventos bioquímicos coordinados que inician con la rápida migración de leucocitos al sitio de la infección, seguido por un aumento del flujo sanguíneo que transporta diferentes mediadores los cuales controlan el curso de la inflamación ⁶⁸. En un inicio, este proceso inflamatorio es benéfico para el hospedador; sin embargo, pueden presentarse mecanismos de resolución inflamatoria ineficientes, que no permiten la eliminación del cuerpo extraño o los mismos patógenos; si esto ocurre, podría darse un proceso inflamatorio crónico ⁶⁸. Un gran número de estudios han reconocido a los AMPs, particularmente las hBDs, como moléculas que están implicadas en múltiples actividades proinflamatorias tales como: neutralización de bacterias, quimioataxis y activación de células inmunitarias, neovascularización y cicatrización de las heridas, así como también, actividad anti o pro tumoral ⁶⁹. Es importante mencionar que los AMPs interactúan también con la inmunidad innata ⁷⁰, a través de Receptores de Reconocimiento de Patrones (PRRs), Receptores para quimiocinas (CCRs), el inflamosoma y el sistema del complemento. De esta manera, regula algunos procesos celulares fundamentales en las células del sistema inmunitario, tales como la diferenciación, proliferación y muerte celular programada ^68,71. En épocas recientes, se ha enfatizado que la hBD-2 tiene la capacidad de unirse fuertemente al componente del complemento C1q. Curiosamente, esta proteína no afecta de manera significativa la vía de activación alternativa, pero puede inhibir la vía de activación clásica del complemento y puede estar involucrada en la protección contra la activación descontrolada de la respuesta inmunitaria innata, la interaccion entre hBDs y la respuesta inmunitaria serán explicadas con más detalle, más adelante ^72,73.

Las actividades señaladas controlan la inflamación y/o aceleran el proceso de reparación de los sitios infectados, apoyando la función microbicida para la resolución del proceso infeccioso ⁷⁴. En este contexto, las hBDs pueden definirse como alarmas o señales de peligro; es decir, moléculas endógenas conocidas como Patrones Moleculares Asociados a Daño (DAMPs) que se liberan de las células dañadas o moribundas e inician una amplia gama de funciones fisiológicas y fisiopatológicas ^68,71. Así, la hBD-3 crea una disrupción en la biosíntesis de la pared celular uniéndose a regiones ricas en lípidos de la misma, de esta manera, participa rápidamente en el reconocimiento y respuesta a patógenos ^75,76.

En diversos estudios se ha demostrado que la expresión de hBDs se correlaciona con el estado inflamatorio del tejido gingival ^77-79. Por ello, con el objetivo de conocer el papel que desempeñan las hBDs en la enfermedad periodontal, se han realizado estudios clínicos en humanos, experimentales in vivo e in vitro. Dommisch ⁴³, investigó la expresión de las hBDs-1, 2 y 3 en biopsias gingivales de individuos sanos, con gingivitis y periodontitis. En el tejido sano no se encontraron variaciones en la expresión de las hBDs-1, 2 y 3, mientras que en la gingivitis se presentó un aumento en la expresión de la hBD-2 y en la periodontitis hubo una sobre expresión de hBD-2 y hBD-3. Adicionalmente, la expresión de hBD-3 se limitó al estrato basal en condiciones de salud y se extendió al estrato espinoso superficial en condiciones patológicas. Estos datos sugieren que, en la primera etapa del proceso inflamatorio, es decir, en la gingivitis, existe una sobreexpresión de hBD-2, mientras que, en etapas avanzadas de periodontitis, existe una sobreexpresión de hBD-3, además de una alta expresión de hBD-2 ⁴³.

Vandar Seul y cols. ⁸⁰, estudiaron la expresión del ARNm de las hBD-1 y 2 en los tejidos gingivales de individuos sanos, con gingivitis, periodontitis agresiva y crónica; los resultados demostraron que la expresión génica de la hBD-1 fue baja en gingivitis y periodontitis agresiva, y significativamente alta en el grupo de periodontitis crónica, más que en el grupo control (p <0.001). La expresión del ARNm de hBD-2 en gingivitis fue más baja que en el grupo control y más alta en periodontitis crónica, mientras que en la periodontitis agresiva hubo un incremento en su expresión génica. Por su parte, Ebrahem y col. ⁸¹ analizaron la expresión de las hBDs-1, 2 y 3 en fluido crevicular de pacientes con periodontitis agresiva posterior a la terapia periodontal no quirúrgica, se observó un incremento en la frecuencia de la expresión de la hBDs-1 y 3 posterior a la terapia periodontal. Yong y cols. ⁸², estudiaron la correlación que existe entre periodontopatógenos, parámetros clínicos y expresión de hBD-2; encontraron que la concentración de hBD-2 en fluido crevicular en sitios con EP fue más alta comparada con sitios en salud. Concluyeron que la prevalencia, composición y número de copias de los periodontopatógenos están íntimamente relacionados con la severidad de los datos clínicos de la EP. Brancatisano y cols. ⁸³, evaluaron el nivel de hBD-3 en el fluido crevicular de individuos sanos y con periodontitis; demostraron que, en sujetos con periodontitis, la expresión de hBD-3 fue menor al ser comparado con sujetos sanos. Costa ⁸⁴, analizó los niveles de hBD-1 en el fluido crevicular en sujetos con y sin periodontitis; encontró que en sujetos con salud periodontal los niveles de hBD-1 fueron más altos que en pacientes con periodontitis crónica, sugiriendo un rol protector de la hBD-1 ante la susceptibilidad a la periodontitis crónica (Figs. 3 y 4). Pereira y cols. ⁸⁵, evaluaron los niveles de hBD-1 y hBD-2, en el fluido crevicular de individuos con y sin periodontitis; sus resultados demostraron que los individuos con periodontitis presentaron altos niveles de hBD-2 y hBD-3. Sidharthan y su grupo ⁸⁶, analizaron los niveles de Interleucina-22 (IL-22) y hBD-2 en el fluido crevicular en pacientes sanos, con gingivitis y periodontitis crónica y encontraron que los niveles de hBD-2 fueron significativamente más altos en la periodontitis crónica cuando se comparó con el grupo de gingivitis y sanos (P<0.001), indicando el rol de la IL-22 y hBD-2 en la respuesta inmunitaria durante la periodontitis (Tabla 2).

Fig. 3 Expresión de las β-defensinas en el epitelio gingival en gingivitis. 

Fig. 4 Expresión de las β-defensinas en el epitelio gingival en periodontitis. 

Los datos existentes permiten detectar cambios en la expresión de hBDs en diversos cuadros clínicos dentro de la enfermedad periodontal, evidenciando su participación en la respuesta microbicida e inflamatoria. La identificación de hBDs en fluido crevicular y saliva permite su detección de una manera sencilla, fácil y no invasiva, con el objeto de determinar la actividad inflamatoria de la enfermedad; sin embargo, es necesario considerar algunas situaciones en las que puede encontrarse una disminución de las hBDs y que podrían influir en la interpretación. Una de las responsables es la degradación de hBDs por enzimas proteolíticas producidas por los patógenos periodontales y el hospedador, tales como las proteasas tipo tripsina y las gingipaínas de P. gingivalis que degradan a las hBD-1, hBD-2, y hBD-3 ⁸⁷. Otras de las enzimas proteolíticas del hospedador que pueden contribuir a la degradación de las hBDs son los miembros de la familia de enzimas cisteín-proteinasa, catepsina B y L, las cuales tienen la capacidad de inactivar a la hBD-2 y hBD-3 en condiciones in vitro⁸⁸. Estas enzimas son producidas predominantemente por macrófagos y suelen aumentar en los tejidos gingivales en el inicio y progresión de la periodontitis ⁸⁸. Por otra parte, se ha postulado que una mayor participación de la inmunidad adaptativa en comparación con la inmunidad innata durante la enfermedad periodontal, es la responsable en la disminución de la secreción de las hBDs ⁸⁸. La expresión de las hBDs, está modulada por el estado inflamatorio de los tejidos; por lo tanto, el incremento de la expresión de las hBDs, ocasiona la presencia de citocinas inflamatorias, por ejemplo, las hBDs-2 y 3 inducen la producción de TNF-α, IL -1 e IFN-γ ⁸⁹. En un estudio in vitro⁹⁰ se observó que las hBD-2 y hBD-3 inducen la maduración de las CDs; las CDs activas son fuente importante de citocinas que reclutan a otras poblaciones celulares, como las células T, las Natural Killer (NK), monocitos y CDs adicionales ⁹¹. En este sentido se ha sugerido que, al pasar de una lesión gingival inicial a una establecida, las funciones antibacterianas de las hBDs son reemplazadas por la inmunidad celular ⁹², favoreciendo la secreción de IL -8, y el factor estimulador de colonias de macrófagos-1 (MCP-1) y al oncogen que es un regulador de crecimiento (GRO) ⁹². Se observó también que las CDs responden de manera diferente a las hBDs-2 y 3; la hBD-2 induce la producción de IL -6 mientras que hBD-3 induce grandes niveles de MCP-1. La inducción de IL -6 e IL -8, pueden ser particularmente importantes ya que son quimiotácticos para neutrófilos y células Th17 ⁹². Por otro lado, MCP-1 actúa como quimiotáctico para monocitos y células Treg ⁹³. Esto indica que las hBDs-2 y 3, inducen de manera selectiva la expresión de citocinas, sugiriendo que las hBDs tienen un rol único en la respuesta inmunitaria al utilizar diferentes receptores para estimular CDs; TLR4, CCR6 y CD91 han sido implicadas como receptores para hBD-2, mientras que TLR1 y TLR2 como receptores para hBD-3 ⁹⁴. De tal manera que las hBDs no solo actúan como quimiotácticos para células inmunitarias, sino también inducen patrones de citocinas únicos, que son cruciales en la respuesta inmunitaria hacia bacterias⁹⁰. Otro aspecto importante a considerar es el polimorfismo genético, que se ha asociado con una disminución de hBDs predisponiendo a desarrollar periodontitis, por lo que la relación entre el polimorfismo funcional de los genes de las hBDs y la susceptibilidad a padecer periodontitis es probable, pero necesita ser estudiada a fondo ⁸³.

Los estudios experimentales, por su parte, permiten tener condiciones más controladas que brindan información adicional y valiosa. El desarrollo de la gingivitis clínica se ha estudiado de manera extensa en un modelo denominado gingivitis experimental, descrito inicialmente por Löe y Theilade ⁹⁵. Ha sido utilizado en investigación clínica como una herramienta en el estudio de la fisiopatología de la gingivitis en el cual se miden parámetros clínicos (placa e índice gingival) ⁹⁶ e histológicos en lesiones asociadas a gingivitis para evaluar diferentes grados de inflamación, efectos de agentes farmacéuticos que inhiben la formación de placa bacteriana, así como el efecto en la inmunidad innata. Esto podría ayudar a comprender el proceso inflamatorio gingival en humanos, en un tiempo corto y con reversión de la inflamación ⁹⁵. Esta situación no se podría conocer exactamente en pacientes con gingivitis inducida de manera natural, puesto que no se tiene certeza en qué momento se inicia el proceso inflamatorio y, por tanto, no se puede hacer una correlación entre distintos parámetros clínicos y el inicio de la enfermedad. Sin embargo, una desventaja que tiene el modelo es la duración de la inducción ya que se lleva a cabo en un tiempo no prolongado; por lo tanto, solamente puede ser útil para conocer el fenómeno inflamatorio agudo. Al respecto, se han realizado modificaciones en la fase de inducción, a partir del modelo original de Löe ⁵⁰, en el que propuso dos fases, la de inducción y la de resolución en un tiempo de 21 días. Posteriormente, ha sido modificado por el modelo experimental de Salvi ⁹⁷ y Offenbacher ⁹⁸. Ramírez-Thomé y cols. ⁹⁹, realizaron un estudio de 35 días, en el que consideraron 28 días para la fase de inducción y 7 días para la fase de resolución (35 días), a diferencia de los estudios de Dommisch ^11,43 que propone un modelo de 14 días y no comprende una etapa de resolución de la gingivitis. Este modelo permite evaluar la expresión de AMPs, por ejemplo, Dommisch y cols. en el 2019 ⁴³ evaluaron la secuencia y expresión diferencial de las hBDs-2 y 3, quimiocina ligando 20 (CCL20), psoriasina/S100A7 (S100A7), y calgranulina A/B (S100A8, S100A9) en biopsias y fluido crevicular, el resultado indicó que hay una expresión elevada de ARNm en los diferentes AMPs explorados. Respecto al análisis de proteínas en muestras de fluido crevicular, encontraron un patrón de expresión similar para hBD-2 y CCL20. Con resultados similares, Dommisch y col. ¹⁰⁰ monitorearon la expresión de hBD-2 e IL -8 en fluido crevicular, encontrando elevadas concentraciones de hBD-2 e IL -8. En otro estudio ⁹⁹ donde se evaluaron parámetros clínicos, microbiológicos y expresión de hBD-1 y 2 en muestras de saliva, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la expresión de hBD-2; sin embargo, se encontró una mayor concentración de hBD-1, en saliva total en el día 21 y 28 comparado con el día 0. Este aumento coincide con la elevación de hBD- 1 durante la fase de inducción (estadísticamente significativa en relación a la hBD-2). Los resultados de diferentes estudios muestran que el comportamiento de los AMPs y que, posiblemente, el tiempo de inducción de la gingivitis genera un sesgo en el momento de comparar los resultados entre los diferentes estudios. En consecuencia, se requieren más estudios controlados con parámetros a medir más uniformes y concretos (Tabla 3).

Los estudios in vitro, presentan un papel importante en el esclarecimiento de la participación de las hBDs en la enfermedad periodontal. De acuerdo a Krisanaprakornkit y cols. ⁷⁵, la incubación de células epiteliales gingivales con F. nucleatum, demostró un aumento en la expresión del RNAm de la hBD-2. Vankeerberghen y cols. ¹⁰¹, examinaron la estimulación de las hBDs-1, 2, 3 y 4, utilizando células epiteliales incubadas con bacterias comensales y periodontopatógenas, encontrando que F. nucleatum incrementó la secreción de hBD-2 y hBD-3 en las células epiteliales, pero no la hBD-1 y la hBD-4. Por otro lado, P. gingivalis no estimuló la secreción de hBD-2 y hBD-4, pero si la secreción de hBD-1 tras 14 horas de incubación, siendo similar el resultado para A. actinomycetemcomitans que induce la secreción de hBD-1. La incubación de células epiteliales con A. actinomycetemcomitans indujo transitoriamente la expresión de hBD-3, pero después de 3 horas la expresión regresó a los niveles basales. Este cambio dependiente del tiempo en la secreción de las hBDs, puede ser atribuido a la virulencia de las bacterias, ya que invade monocapas de las células epiteliales gingivales en 90 minutos y después se replica intracelularmente. Durante la invasión, P. gingivalis inhibe la proliferación y migración de las células epiteliales, modulando el comportamiento de las células del hospedador para su propio beneficio e inhibiendo también la secreción de las hBDs ⁸. Otro estudio ⁶⁹, evaluó las hBDs-1, 2, 3, 4 y LL -37, y se encontró que las hBDs-2, 3 y 4 pero no hBD-1, estimulan a los queratinocitos humanos para incrementar su expresión génica y la producción de la proteína quimiotáctica para monocitos-1(IP-10), proteína inflamatoria de macrófagos alfa-3, IL -6, IL -10, y RANTES (Tabla 4).

En un estudio donde se evaluó a la hBD-3, en CDs expuestas a hemaglutinina B (HagB) de P. gingivalis, se propone que HagB, induce la producción de metaloproteasas de la matriz (MMP) en las CDs y que la hBD-3 en conjunto con HagB, altera los perfiles de inducción de MMP, disminuyendo la respuesta de la MMP-1, 7 y 9; esto sugiere que hBD-3 puede alterar la producción de MMP inducida por antígenos antimicrobianos ¹⁰².