Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica, Volumen 20 - Número 1, 2001 (38-42)

1. Sección de Biomembranas, Instituto de Medicina Experimental y Cátedra Patología General y Fisiopatología, Escuela Luís Razetti, Facultad de Medicina. Universidad Central de Venezuela.

En este trabajo se demuestra que la actividad de V-ATPasa presente en fracciones de membrana plasmática del músculo liso de las vías aéreas es inhibida de manera específica y a baja dosis por el cloruro de tributil tin (TBT). Este compuesto representa una de las sustancias tóxicas, de gran utilización en la industria y se ha demostrado que puede afectar a las células y tejidos de humanos con una potencialidad para producir enfermedades.

Palabras Claves: V-ATPasa, Músculo liso, Membrana plasmática.

In this work, it is demonstrated that the V-ATPase activity presents in a plasma membrane fraction from tracheal smooth muscle is specifically inhibited by tributyl tin chloride (TBT). This compound belongs to a great family of toxic pollutants with broad use in modern industry and they can affect humans tissues and cells and produce diseases.

Key Words: V-ATPase, Smooth muscle, Plasma membrane.

Los compuestos órgano-metálicos del tipo alquiltin, en particular el tributiltin (TBT), son sustancias empleadas como limpiadores de las cañerías en la industria a nivel marino. Estos compuestos son sumamente tóxicos para la flora marina^(1,2) y en humanos^(3,4,5). Recientemente se ha demostrado que estos compuestos son capaces de inhibir las V-ATPasas en mamíferos^(6,7).

Las ATPasas vacuolares (tipo V) son enzimas que generalmente participan en procesos fundamentales de las células; ellas hidrolizan ATP, generando un gradiente de protones el cual es usado para la acidificación de los compartimientos celulares, tales como lisosomas^(8,9) vesículas de Golgi⁽¹⁰⁾, vesículas rodeadas de clatrina⁽¹¹⁾, sinápticas y endocíticas⁽¹²⁾ y funcionan exclusivamente como bombas de protones dependientes de ATP⁽¹³⁾.

Las V-ATPasas han sido descritas a nivel de la membrana plasmática, en numerosos tipos de células, especialmente en la células epiteliales de riñones de vertebrados donde pueden estar relacionadas con los procesos de acidificación celular⁽¹⁴⁾, también participan en la destrucción activa de la matriz ósea, donde participa el osteoclasto⁽¹⁵⁾, así como también en la membrana plasmática del acrosoma del espermatozoide y del tracto reproductor masculino^(16,17). También están presentes en el epitelio de la córnea, donde su principal función está referida a la regulación de la presión del globo ocular^(18,19).

Una V-ATPasa, asociada a una fracción de la membrana plasmática del Músculo Liso de las Vías Aéreas (MLVA), ha sido recientemente caracterizada por nosotros^(20,21).

Las V-ATPasas son enzimas multiméricas con una composición de subunidades análoga a las Fo.F1 ATPasas, poseen un dominio hidrofílico V1, involucrado en la hidrólisis de ATP (dominio catalítico) y un dominio hidrofóbico Vo enlazado a la membrana y responsable de la conductancia de protones⁽⁶⁾.

Varios compuestos inhiben indistintamente las ATPasas de tipo V y F, siendo uno de ellos el ciciclohexil carbodimida (DCCD), el cual reacciona covalentemente con un polipéptido transmembrana que forma el canal para la conductancia de protones⁽²²⁾. Los compuestos trialquil y triaril tin, inhiben a las ATPasas de tipo F y V⁽²³⁾. En trabajos con mitocondrias aisladas, se ha establecido que estos compuestos son inhibidores potentes de la síntesis de ATP mitocondrial, inhibiendo directamente la ATP sintetasa, y se ha determinado que el Tributil tin cloruro (TBT) es un catalizador efectivo en el intercambio anión/hidróxido e inhibe la fosforilación oxidativa mitocondrial de una manera similar a como lo hace la oligomicina^(8,9,10). El desacoplamiento inducido por el TBT es atribuido a la acción de un intercambio cloruro/hidróxido, seguido por la salida de cloruro de la mitocondria^(24,25). Así mismo, Apps y Webster⁽²²⁾ han descrito que el TBT es un poderoso inhibidor de la V-ATPasa en gránulos cromafines de la médula suprarenal.

Debido a la gran homología existente entre las V y F ATPasas, en este trabajo nos propusimos determinar el efecto del TBT sobre la actividad de la V-ATPasa presente en el MLVA, con la finalidad de caracterizar el efecto de este alquiltin sobre este tipo de V-ATPasa.

Los siguientes compuestos, fueron adquiridos de la casa Sigma: ATP (ácido adenosin trifosfato) (A5394), TBT, Trizma base, MES, Sacarosa, PMSF (fenil metil sulfonil fluoruro) y DTT (Ditiotreitol). El resto de los reactivos químicos fueron de las casas Merck (Alemania) y Fisher (USA).

Las membranas plasmáticas (fracción P1) fueron aisladas del músculo liso traqueal de bovino, siguiendo el método de fraccionamiento subcelular descrito por Lippo et al⁽²⁶⁾. Luego, dicha fracción P1 fue extraída con una alta fuerza iónica en un medio que contiene: Tris-HCI 20 mM, pH 7,2; Sacarosa 0.3 M; DTT 0.5 mM y KCl 0.6 M en una relación 1:40. La extracción se realizó en frío con agitación por 1 hora y luego se centrifugó a 150.000 g por 30 minutos. El sedimento se lava dos veces con el amortiguador de resuspensión que contiene: Tris-MES 20 mM pH 7,2; Sacarosa 0.3 M y DTT 0.5 mM y se resuspende en un volumen determinado hasta obtener una concentración final aproximada de 1 mg/ml de proteínas. Este fue el material biológico utilizado en la realización de los experimentos que se describen a continuación:

Determinación de la actividad de ATPasa: La ATPasa se determinó siguiendo el procedimiento descrito previamente⁽¹⁷⁾. El medio de incubación básico contiene amortiguador Tris-MES 30 mM pH 6,8; MgCl₂ 5 mM y KCl 150 mM, el volumen final de incubación es de 1 ml. Después de agregar el TBT, a cada una de las concentraciones ensayadas, se les añadió entre 20 a 30 mgs de proteínas de membranas plasmáticas (fracción P1) tratadas como se describió previamente y se pre-incubó 5 minutos a 37 °C. Posteriormente se agregó el ATP a una concentración final de 5 mM y se incubó 1 minuto a 37 °C. La reacción se detuvo agregando 100 ml de TCA (ácido tricloroacético) frío al 50%. Se centrifugó a 3000 x g por 10 minutos a 4 °C y el sobrenadante se guardó a -80 °C para la ulterior determinación del fosfato al día siguiente.

La cuantificación del fosfato liberado se hizo según el método de Fiske-Subbarow⁽²⁷⁾ modificado por nosotros en cuanto al tiempo y temperatura de incubación⁽²⁰⁾. La actividad de la V-ATPasa = Actividad ATPásica en presencia de 150 mM KCl - Actividad ATPásica en ausencia de KCl.

Para la determinación de la concentración de proteínas se usó el método de Lowry⁽²⁸⁾ modificado por Bensadoun y Weinstein⁽²⁹⁾.

Los compuestos alquil-tin son sustancias que se utilizan como ingredientes de pinturas de uso industrial para evitar el crecimiento de seres marinos (Fouling)⁽³⁰⁾ sobre estructuras inmersas en el mar. Estos órgano-metálicos son incorporados al planckton marino⁽²⁾ y de esta manera estos compuestos pasan a las cadenas alimenticias que conducen hasta el humano, como resultado del consumo de productos de origen marino⁽¹⁾.

El tributil-tin (TBT y el trifenil-tin (TFT) son capaces de inducir apoptosis, afectando el desarrollo de líneas celulares humanas, como es el caso del linfocitoma Jurkar-t⁽⁴⁾. Efectos tóxicos similares se han descrito para líneas celulares de neuroblastoma⁽³⁾. También, estas sustancias pueden alterar, de manera significativa, las funciones de las células del sistema inmunológico humano como son las células NK(Natural Killer)⁽¹⁸⁾ y los linfocitos⁽³⁾.

En este trabajo se demuestra que el TBT a bajas concentraciones y de manera específica inhibe la actividad de la V-ATPasa presente en las membranas plasmáticas del músculo liso traqueal. Esta inhibición parece ser similar a la inhibición encontrada para la V-ATPasa de los gránulos cromafines⁽¹²⁾ en los cuales se han descrito modificaciones que afectan el sitio catalítico de esta enzima, el cual se encuentra localizado en la subunidad A (72Kda). Aún más, otros autores han descrito que el TBT puede afectar el transporte de protones a través del sector Vo de la V-ATPasa⁽⁶⁾. La conducción de protones ocurre a través de un canal formado por la subunidad del proteolípido (16Kda)⁽⁶⁾. Es factible que en nuestro caso, ambos componentes como son la subunidad A y el 16Kda-proteolípido pudiesen ser los afectados por el TBT dependiendo de la concentración del compuesto alquil-tin.

De nuestros resultados se puede inferir que otras V-ATPasas de importancia médica como las que se encuentran localizadas en las células epiteliales del riñón^(31,32), en la membrana plasmática del osteoclasto^(14,15) y en el acrosoma del espermatozoide humano⁽¹⁶⁾ son sistemas biológicos que pueden ser afectados por estos compuestos alquil-tin.

Los autores desean agradecer el financiamiento recibido del CDCH a través del proyecto No. 09-33-4259-98 y a la Licenciada Violeta N. de Herrera, por la preparación de las membranas plasmáticas.