Efectos de la N-Acetilcisteína y Metionina en intoxicación aguda con plomo en ratas wistar

L Calderón de C ¹, M Carrasco ², R Hernández N ³, R Naranjo ⁴, L Lacruz ⁵

¹ Médico Especialista en Toxicología. Especialista en Neumonología, profesora Asociado de la Facultad de Medicina. ULA.

² Médico Especialista en Toxicología. Facultad de Medicina. ULA.

³ M. Sc. en Educación. Ph. D. en Metodología Matematica en Educación, profesor Titular de la Facultad de Humanidades. Coordinador General de Informática. ULA.

⁴ Bioanalista. Magíster en Toxicología analítica, Coordinadora de Laboratorio Analítico, Departamento de Farmacología y Toxicología. Facultad de Medicina. ULA.

⁵ Médico Especialista en Toxicología, profesor Titular, Coordinador del postgrado de Toxicología Médica, Jefe de Unidad de Toxicología. Facultad de Medicina. ULA

Resumen

El Plomo es un elemento ubicuo en el ambiente. El estrés oxidativo es considerado un mecanismo por el cual causa toxicidad. La finalidad de este trabajo fue determinar el efecto de la N-Acetilcisteina y Metionina en la intoxicación con Plomo, sobre los niveles sanguíneos de Plomo, Hematocrito (Hto), ALA-D y niveles de malondialdehido (MDA) en hígado y riñón. Se utilizaron 60 ratas Wistar, con peso promedio de 185 g. dividas en cinco grupos. Grupo 1, el Control, se determinaron niveles básales, el Grupo 2 de Intoxicación, los grupos restantes una vez intoxicados recibieron tratamiento de la forma siguiente Grupo 3 N-Acetilcisteína (NAC), Grupo 4 Metionina (MET), Grupo 5 NAC + MET. Los resultados mostraron que la NAC disminuye los niveles de plomo en sangre en un 23% (p< 0.05), aumenta el Hto y la actividad del la ALA-D. La combinación NAC+MET disminuye los niveles de plomo en sangre en un 41% (p<0.001) con un aumento del Hto (p<0.05) y aumento de la actividad de ALA-D en un 16% (p<0.001). En relación al MDA en hígado y riñón, la NAC disminuye los niveles de MDA en hígado en un 29% (p<0.05). El tratamiento NAC+MET induce a un aumento significativo estadísticamente de MDA en hígado y disminución en riñón. En esta investigación se puede concluir que la NAC muestra un efecto quelante débil sobre los niveles plasmáticos de plomo y revierte las alteraciones a nivel de parámetros sanguíneos estudiados, además revierte la peroxidación lípidica a nivel hepático. La combinación NAC + MET tiene un comportamiento dual, a nivel hepático es prooxidante y a nivel renal antioxidante.

Palabras claves: Intoxicación por Plomo, Productos reactivos al tiobarbiturico, Malondialdehido (MDA), N-Acetilcisteina (NAC), Metionina (MET).

Abstract

Lead is a ubiquitous element in the environment. Oxidative stress is considered a mechanism which causes toxicity. The objective of this work is to determine the effect of N-Acetylcyteine and Methionine on lead poisoning in blood levels for lead, hematocrit, ALA-D and levels of malondialdehide (MDA) in the liver and kidneys. Sixty Wistar rats with an average weight of 185 g. were used. They were divided into five groups. In Group 1, the control, basal levels were determined, in Group 2, intoxication and in the rest of the groups, once intoxicated, they received treatment in the following manner: Group 3, N-Acetylcyteine (NAC). Group 4 Methionine (MET) and Group 5 NAC + MET. Results showed that NAC lowers lead levels in the blood in 23% (p<0.05) increases hematocrit and ALA-D activity. The combination of NAC + MET lowers the levels of lead in the blood in 41% (p<0.001) with a hematocrit increase (p<0.05) and an increase in the ALA-D activity of 16% (p<0.001). With respect to the MDA in the liver and kidneys, NAC lowers the levels of MDA in the liver in 29% (p<0.05). The NAC +MET treatment induces a statistically significant MDA increase in the liver and a decrease in the kidney. In this research, it can be concluded that NAC shows a weak Chelate effect on the plasmatic levels of lead and reverts alteration at the level of the blood parameters studied in addition to reverting lipidic peroxidation at the hepatic level. The combination of NAC + MET has dual behavior, at the hepatic level it is pro-oxidant and at the renal level antioxidant.

Key Words: lead poisoning, products reactive to thiobarbituric, N-Acetylcyteine (NAC), Methionine (MET)

Introducción

El plomo (Pb) es un contaminante ambiental y ocupacional conocido desde hace más de 2000 años y en los años 60 pasó de problema de salud ocupacional a problema de salud pública¹.

En Venezuela no existen datos de la prevalencia de la intoxicación por Pb en la población general, no obstante se conoce que las enfermedades ocupacionales en orden de frecuencia son la hipoacusia (37,5%), la dermatosis (32,34%) y saturnismo (16,13%)², y aunque se desconoce la cantidad de trabajadores expuestos, la intoxicación por Pb figura como una de las primeras causas de morbilidad en las consultas de Medicina del Trabajo del Seguro Social².

Por otra parte, cabe mencionar que se han realizado estudios en la población infantil en diferentes ciudades de Venezuela (Caracas, Valencia, Maracay, Mérida) donde demuestran que existe una relación directamente proporcional entre los niveles de Pb ambiental con concentraciones del Pb en la sangre (Pb-S)^3,4,5, de igual forma han correlacionado el Pb-S en madres y sus hijos recién nacidos, confirmándose el paso del Pb a través de la placenta en los nacidos (5,6), también se ha relacionado los valores de Pb-S y Pb ambiental en niños considerados como "alto" riesgo biopsicosocial, así como diversas alteraciones orgánicas como consecuencia de la exposición al Pb^5,6,7.

En relación a las formas de intoxicación con Pb las más frecuentes son por exposición ambiental en niños y por exposición ocupacional en adultos^8,9. El Pb se absorbe por ingestión o por inhalación, al llegar a la sangre se une a los eritrocitos en un 90%, para ser transportado y distribuido a los diferentes órganos y tejidos del organismo¹⁰, se distribuye de manera inicial en los tejidos blandos, en particular el epitelio tubular renal, el hígado y el sistema nervioso,¹⁰ donde se acumula y de manera progresiva ocasiona daño, que induce a una variedad de signos y síntomas que dependen del tipo de intoxicación⁹.

En las intoxicaciones agudas los efectos son principalmente a nivel hematológico caracterizado por disminución de Hb, Hto, y a nivel enzimático disminución de la enzima δ-aminolevulínico ácido deshidratasa (ALA-D)^11,12, de igual manera el Pb tiene efectos a nivel gastrointestinal y renal en este tipo de intoxicación¹¹.

Los efectos tóxicos del Pb son muy diversos, pues van desde efectos sutiles, bioquímicos y preclínicos a efectos clínicos que manifiestan daños orgánicos establecidos. Esta gran diversidad de efectos es producto de varios mecanismos de toxicidad. El mejor conocido es la alta afinidad del Pb por los grupos sulfhidrilo (-SH) de proteínas, tanto estructurales como funcionales (entre ellas las enzimas). Al interaccionar el metal con la enzima, el Pb provoca cambios, interfiriendo con la función de la misma¹¹.

Otro mecanismo descrito recientemente es que el Pb induce a daño oxidativo, hecho que da origen a transformaciones profundas de la membrana celular que pueden conducir hasta su destrucción, dando lugar a una serie de productos de descomposición como el malondialdehido (MDA), el cual se emplea como indicador directo del daño celular y de la peroxidación lípidica^12,13. Así mismo se ha demostrado que el Pb altera el mecanismo antioxidante de las células^{14, 15}.

En los últimos años se ha introducido en el tratamiento de la intoxicación por Pb el uso de antioxidantes como la N-Acetilcisteína (NAC) y la Metionina (MET) ya que actúan como barredores de radicales libres bloqueando el daño oxidativo y aumentando la defensa antioxidante a través de los grupos tioles presentes en estos fármacos.

Con el propósito de conocer los efectos de la NAC y la MET sobre los parámetros sanguíneos (niveles de Pb, Hto y actividad de ALA-D) porque se consideran indicadores confiables de exposición a dicho metal, y niveles de MDA en hígado y riñón por tratarse de órganos de choque del Pb y de eliminación del mismo en una intoxicación aguda, se diseñó un estudio experimental tipo ensayo terapéutico en ratas wistar intoxicadas con 30mg/kg de acetato de Pb.

Métodos

Se seleccionaron ratas Wistar, del género masculino, entre 12 y 15 semanas de nacidas, con un peso promedio de 185 g, fueron distribuidas aleatoriamente en cinco grupos de 12 ratas cada uno. Estas fueron alimentadas con ratarina (Super Rat®) y agua ad libitum, manteniéndose a una temperatura ambiental de 27ºC. Se dividió el estudio en dos fases: Primera Fase en la cual se realizó la determinación de niveles de plomo, hematocrito, y ALA-D en sangre. Segunda Fase donde se determinó los productos reactivos al ácido tiobarbiturico (TBARS) el malondialdehido (MDA) en hígado y riñón.

Fase 1: Al grupo 1 se le denominó grupo control y solo recibieron alimento y agua ad libitum. Al grupo 2 se le denominó grupo de intoxicación, y se les administró acetato de plomo a dosis de 30 mg/Kg. i.p. durante siete días. El grupo 3, 4 y 5 fueron denominados grupos de experimentación, luego que se intoxicaron durante siete días al grupo 3 se le administró NAC por vía oral a través de cánula, a dosis de 100mg/Kg./día, al grupo 4 se les administró MET por vía oral a través de cánula, a dosis de 200mg/Kg./día y al grupo 5 se le administró la combinación NAC+MET durante siete días. Entre el día quince y dieciséis del experimento a cada una de las ratas de todos los grupos se sometieron a anestesia con cloroformo, luego se hizo una incisión toracoabdominal y se extrajo aproximadamente 10 ml de sangre desde la vena cava y fue transferido a tubos de plástico con heparina, previamente tratados con ácido nítrico al 5%, se dividió la muestra en 5 ml para determinar plomo, 2 ml para hematocrito (Hto) y 2 ml para ALA-D. Fase 2: De los grupos 3, 4, y 5 de los arriba descrito, se seleccionaron al azar 6 animales se sacrificaron mediante un trauma cervical, y mediante disección se obtuvieron muestras de 2 g. de tejido hepático y renal, para la determinación del MDA.

Determinación de Niveles de Plomo en sangre: La concentración de plomo en las muestras de sangre se determinó por Espectrofotometría de Absorción Atómica utilizando la técnica de Zinterhofer y col 1971¹⁶ y los resultados se expresaron en µg/dl.

Determinación de Hematocrito: Se midió por micrométodo en el cual el tubo de microhematócrito capilar se llenó por atracción capilar con la sangre hasta por lo menos la mitad. El extremo por donde se llenó se selló con plastilina y fueron colocados en la microcentrifuga por 5 minutos de 10000 a 12000 G. El microcapilar fue leído en una tabla milimetrada CRITOCAP.

Determinación de ALA-D: Se determinó por la técnica de Tomokuni Katsumaró 1974¹⁷ y los resultados se expresaron en µMol por Porfibilinogeno/hora/ml de células de glóbulos rojos.

Determinación de Productos reactivos al ácido tiobarbiturico (Malondialdehido): Luego de la intoxicación aguda con acetato de plomo, se extrajo el hígado y riñón de las ratas, los cuales fueron transferidos a tubos que contenían 500µl de Krebs-Bicarbonato, previamente gaseados con N2 y luego fueron homogeneizados a 4ºC. Se determinó el malondialdehido como producto final de la lipoperoxidación por la técnica de Bird y Draper modificada por García 2003¹⁸, los resultados se expresaron en µmol de MDA por mg de proteína.

Análisis Estadístico: Se utilizó el sistema SPSS 10.0 para Windows, para la elaboración de la base de datos y correspondiente procesamiento estadístico. Los datos de las variables Plomo, Hematocrito, ALA-D y MDA fueron evaluados mediante: a) Análisis descriptivo, b) ANOVA, c) MANOVA, d) Post Test (Tukey), considerándose significativo cuando el valor de p fue menor de 0,05 (p< 0,05).

Resultados

Los datos obtenidos demostraron que los niveles de plomo en sangre aumentó, con respecto al grupo control, en un 50% (p<0.0001) en animales intoxicados con 30mg/kg de acetato de Pb (Tabla 1). La administración de la NAC redujo los niveles séricos de Pb en un 23% (p< 0.05) cuando se compara con el grupo de intoxicación. Con la administración de MET no se observa cambios estadísticamente significativos en los niveles de Pb en sangre, al comparar con el grupo de intoxicación. La combinación de NAC+MET induce a una disminución de los niveles sanguíneos de Pb en un 41% (p<0.0001) con respecto al grupo de intoxicación.

Con relación a la variable Hto se observa una disminución en el grupo de intoxicación con respecto al control en un 12% (p<0.05), con la administración de NAC aumenta el Hto en un 12% con respecto al grupo de intoxicación (p<0.05), con la MET se registra un aumento mayor (16%, p<0.05), con la combinación de los fármacos (NAC+MET) el aumento del Hto sigue siendo en un 16%. (p<0.001).

Con la enzima ALA-D se presentó variaciones significativas entre los grupos, en el grupo de intoxicación se observa una disminución del 19% (p<0.05) con respecto al grupo control, cuando se administra NAC aumenta la actividad de la enzima en un 40% (p<0.05), con la MET aumenta en un 45% (p<0.05) y con la NAC+MET aumenta en un 48% (p<0.05) con respecto al grupo de intoxicación.

El nivel del MDA no presentó variaciones significativas entre los grupos control y de intoxicación, tanto en hígado como en riñón. En el hígado se observó una disminución del MDA de 1,7 ±0,2 µM/mg proteína a 1,2 ±0,2 µM/mg proteína (p<0.05) cuando se administra la NAC. Con la administración de NAC+MET aumenta el MDA en un 39% (p<0.01) (Figura 1), al comparar con el grupo de intoxicación.

En riñón solo se observa variación significativa cuando se administra la combinación de los fármacos NAC+MET, se reduce el MDA de 0,93±0,42 µM/mg proteína a 0,76±0,12 µM/mg proteína con respecto al grupo de intoxicación (p<0.05) (Figura 2).

Discusión

El Pb es un metal ubicuo, que tiene efectos sobre varios sistemas biológicos, siendo los sistemas hematopoyético, renal y hepático, los primeros en afectarse en una intoxicación aguda por este metal¹⁰.

El tratamiento de la intoxicación aguda por Pb se fundamenta en la eliminación del metal desde el torrente sanguíneo y de los sitios de acumulación¹⁹.

Actualmente se ha adicionado al tratamiento el uso de antioxidantes, tomando en cuenta el mecanismo oxidante del Pb sobre los sistemas biológicos, recientemente descrito^20,21.

Los resultados obtenidos en esta investigación muestran que una dosis de 30mg/kg/dia de acetato de Pb, por 5 días, vía i.p. aumenta la concentración del mismo en sangre a 42,0 µg/dl ± 9,2. En contraste con estos resultados en una investigación realizada por Tangeng y col,²² determinaron que después de una dosis subaguda de 100 mg/kg/día de acetato de plomo, por 7 días, el nivel de Pb en sangre aumentó a 41µg/dl ± 6,4. En la presente investigación se utilizó una dosis 3 veces menor que en el estudio mencionado y los resultados son similares. Al respecto existen varios reportes de laboratorios que obtienen aumentos importantes de Pb en sangre, que obedecen no solo a la dosis de exposición sino también al contenido de Pb en agua potable y alimentos que reciben los animales^{9,22, 23}. Es probable que en este estudio, suceda algo similar, aunque no se haya hechos determinaciones de Pb en agua y alimento que reciben los animales en experimentación.

Por otra parte, esta concentración de Pb en sangre nos indica que estamos en presencia de una intoxicación moderada, si tomamos como referencia la clasificación de intoxicación ocupacional por Pb, publicada por el Departamento de Administración de Salud y Seguridad Ocupacional de los Estados Unidos ²⁴ y utilizada en los diferentes laboratorios de nuestro país, en la cual describe tres fases de Intoxicación aguda por exposición al Pb, una fase de Intoxicación subclínica donde el Pb -S se halla alrededor de los 40 µg/dl y los efectos son mínimos, la siguiente fase es de Intoxicación moderada en el cual el Pb-S está entre los 41 y 60 µg/dl y los efectos son más evidentes y por último la Intoxicación clínica donde los niveles de Pb-S están por encima de los 70 µg/dl.

La primera manifestación de los efectos hematopoyéticos en la intoxicación aguda moderada por Pb es la anemia microcítica, detectada por disminución de la Hb y el Hto¹². Estas alteraciones se debe en primer lugar a que el metal bloquea los grupos tioles (-SH) de las enzimas (tiolprivos), elementos que son indispensables para la función enzimática. El Pb al interaccionar con las enzimas, provoca cambios en la conformación de la estructura terciaria de la proteína, interfiriendo en su función catalítica^10,12. Así la enzima más sensible al Pb es la ALA-D. Ésta es una enzima indispensable para la síntesis del Hem, que contiene abundantes grupos sulfhidrilos, lo cual normalmente forma complejos metálico-enzimáticos con el zinc. Al existir concentraciones tóxicas de Pb en el medio intracelular, éste desplaza el zinc, ocupando su lugar en la enzima y en consecuencia, la inactiva. En segundo lugar se inhiben otros sistemas enzimáticos que se relacionan con la integridad de la membrana eritrocitaria induciendo a una hemólisis. ²⁵ La disminución de la actividad de la enzima ALA-D, induce a una disminución de la Hb y el Hto. Estos parámetros son utilizados como indicadores de toxicidad en el ámbito ocupacional²⁴.

En el presente estudio se corrobora lo anteriormente descrito, en el cual los valores de la enzima ALA-D se encuentra inhibida reportando valores por debajo de los normales (0.6 - 1.2 µMol PBG/ hora/ml) y el Hto se encuentran por debajo de lo normal (41-45%)

El hígado y el riñón son los principales órganos encargados de la excreción del Pb. En una intoxicación aguda por Pb, el 16% del metal regresa a través de las secreciones biliares, a las vías gastrointestinales por la circulación enterohepática produciendo toxicidad a lo largo del recorrido. ²⁶ El riñón por su parte constituye el principal órgano excretor del Pb, el cual filtra aproximadamente el 75% del Pb absorbido, lo que le hace ser un órgano blanco²⁷.

Algunos estudios han sugerido que el mecanismo por el cual el Pb ejerce toxicidad en estos órganos es por estrés oxidativo^12,15, sin embargo el mecanismo para explicar como el Pb puede producir deterioro oxidativo de macromoléculas biológicas no está muy claro, no obstante se describe un aumento del MDA tanto en hígado como riñón, indicando que es la acción oxidante el encargado de alterar sus funciones²⁵.

En esta investigación, los niveles de MDA tanto en hígado como en riñón, no muestra un aumento estadísticamente significativo. Aunque reportes previos han indicado el aumento del MDA como indicador de daño oxidativo en hígado y riñón, los diferentes estudios han utilizado dosis más alta desde 60µg/g hasta 2g de acetato de Pb^{25, 26,27}.

En este estudio no se observó un aumento significativo del MDA en ningún órgano (hígado y riñón), es probable que la dosis no sea suficiente para inducir el deterioro oxidativo, o que el mecanismo antioxidante supera los radicales libres formados y no permite la cascada de lipoperoxidación. También se debe tener en cuenta que las diferencias de resultados puedan estar influenciadas a parte de la dosis, por varios factores entre ellos la diferencia de especies, la vía de administración, el tiempo y la técnica empleada.

El efecto de la NAC sobre los parámetros que se estudiaron sugiere que es un fármaco que induce la disminución de los niveles de Pb en sangre en un 41% (p<0.001) adjudicándole un efecto quelante débil, asimismo tiene la capacidad de inducir un aumento de la actividad de la enzima ALA-D en un 11% y por consiguiente aumenta el nivel de Hto. Con la administración de MET aunque no se observó una disminución estadísticamente significativa, de los niveles sanguíneos de Pb, si se observó un aumento de la actividad de la enzima ALA-D y en consecuencia aumento del Hto. La combinación de los fármacos (NAC+MET) tiene una acción marcada en la disminución de los niveles de Pb en sangre, aumentando además la actividad de la enzima ALA-D.

Tanto la NAC como la MET tienen en su estructura química grupos thioles (-SH), y es probable que esto sea lo que le permite interactuar en forma directa con el Pb para formar quelatos y ser eliminados, disminuyendo así los niveles de Pb en sangre. Estudios previos han reportado este mecanismo para la NAC en la intoxicación por metales pesados^19,28, y aunque no existen trabajos publicados sobre el efecto quelante de la MET, desde el punto de vista de estructura química pudiera tener algún efecto quelante por los grupos thioles contenidos, sin embargo, se debe tomar en cuenta la diferencia en la posición de estos grupos²⁹. En la NAC el grupo -SH se encuentra en la parte libre de la cadena, que le permite actuar rápidamente, mientras que en la MET el grupo thiol está dentro de la estructura y necesita ser biotransformado para dejarlo libre. Cuando se administra la combinación de fármacos NAC+MET los efectos sobre los parámetros en estudio son marcados y los resultados beneficiosos, quizás se deba a un efecto sinérgico³⁰.

Con respecto a los resultados obtenidos con los fármacos en estudio a nivel de hígado y riñón existe una clara diferencia de comportamiento. En hígado se observó que la NAC disminuye en forma significativa los niveles de MDA, pero la MET y la combinación de NAC+MET aumenta los niveles de MDA en este órgano.

A nivel renal, la NAC y la MET no inducen ningún cambio en los niveles de MDA, solo se observa una disminución estadísticamente significativa con la asociación de NAC+MET.

Mucho de estos resultados se explican por la cinética de los fármacos que aquí se estudiaron. La NAC ingerida por vía oral, es desacetilada en el intestino, incorporándose la mayor parte como cisteína al hígado, donde, completa su desacetilación. Este, en conjunto con los aminoácidos glicina y ácido glutámico forma las bases para la biosíntesis del glutatión (GSH). El GSH junto a un grupo thiol (-SH) cedido por la cisteína le confiere a la NAC su poder antioxidante^31,32. Además la NAC tiene su grupo sulfidrilo (-SH) libre y es un donador de H y por tal es un eficaz agente reductor. Frena las reacciones oxidativas que pueden tener lugar e impide la oxidación de importantes moléculas estructurales y funcionales y el comienzo de lesiones por radicales libres³². Penetra en células y a través de sus reacciones subsiguientes se transforma en Glutatión reducido. Al donar su radical H la NAC ejerce un efecto antioxidante directo y restaura a nivel intracelular el Glutatión.³³

La MET para su conversión en cisteína necesita una serie de reacciones químicas en donde la metionina se condensa primero con ATP, formando S-adenosilmetionina. El grupo S-metilo activado se transfiere a varios compuestos aceptores. La metionina se depura por metilación con metiltransferasa como catalizadores, empleando S-adenosilmetionina como donador del grupo metilo, en estas reacciones se producen radicales libres, que pueden ser neutralizados siempre que no exceda la capacidad de la defensa enzimática.

Por otra parte, el efecto prooxidante de los antioxidantes ha sido descrito en otras investigaciones donde reportan la interacción de los thioles que generan radicales reactivos (radicales thiyl), lo cual le concede la acción oxidante^33,34.

En conclusión, la NAC tiene efectos beneficiosos para disminuir niveles de Pb en sangre, restaurar la actividad de la ALA-D y aumentar el Hto. Sobre los niveles de MDA el comportamiento es diferente, actúa como antioxidante a nivel hepático y no tiene efecto a nivel renal. La MET por su parte, tiene menos efectos sobre la disminución de los niveles de Pb en sangre, pero tiene capacidad de aumentar la actividad de la ALA-D y aumentar el Hto. La combinación del NAC+MET aumentan los efectos beneficiosos a nivel sanguíneo.

Los resultados obtenidos en este estudio acerca del efecto de la NAC y la MET en hígado y riñón sobre los niveles de MDA, no son claros y necesitamos más estudios para explicar el comportamiento de estos fármacos en los diferentes órganos. Sin embargo, la NAC ofrece efectos beneficiosos a nivel hepático actuando como antioxidante.

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