Mecanismos moleculares de la disfunción endotelial: de la síntesis a la acción del óxido nítrico

Alejandro Guillermo Acosta, Johnny Áñez Vermolen, Carla Verónica Andara, Valmore Bermúdez Pirela, Fernando Bermúdez Arias

La Universidad del Zulia. Facultad de Medicina. Centro de Investigaciones Endocrino-Metabólicas "Dr. Félix Gómez", Maracaibo. Venezuela E-mail: climacoc@hotmail.com

Resumen

La relevancia clínica y científica de las alteraciones de la síntesis y de la biodisponibilidad del óxido nítrico en el curso de la disfunción endotelial se fundamenta en que esta variación es un factor común en la patogénesis de las enfermedades cardiovasculares. Dichas alteraciones se han demostrado en modelos animales y en humanos, en el ámbito de condiciones patológicas tan peligrosas y diversas como la hipertensión, la hipercolesterolemia, el envejecimiento, el consumo de cigarrillo, la diabetes y la insuficiencia cardíaca. El conocimiento de los procesos relacionados con estas alteraciones se hace entonces de vital importancia para la comprensión de la fisiopatología de dichas enfermedades, así como, para la generación de estrategias terapéuticas innovadoras y eficaces en el tratamiento de estas patologías.

Palabras Clave: óxido nítrico, óxido nítrico sintetasa, disfunción endotelial, enfermedades cardiovasculares.

Abstract

The clinical and scientific relevance of synthesis and bioavailability of nitric oxide alterations in endothelial dysfunction is based on the fact that it is a common factor in the pathogenesis of cardiovascular diseases. These alterations have been demonstrated in animal models and in humans, in the scope of as dangerous pathological conditions as cigarette smoking, hypertension, hypercholesterolemia, aging, diabetes and heart failure. The knowledge of the processes related to these alterations becomes of remarcable importance for the understanding of the genesis of these diseases, and from this point, for the generation of innovating and effective therapeutic strategies in the treatment of these pathologies.

Key words: nitric oxide, nitric oxide synthesis, endothelial dysfunction, cardiovascular diseases.

Recibido: 23/05/2006 Aceptado: 20/07/2006

Introducción

Las células endoteliales vasculares constituyen un órgano estructuralmente simple, pero funcionalmente complejo que regula procesos tan diversos como la hemostasis, la fibrinolisis, la inflamación, la presión arterial, el metabolismo de las lipoproteínas y la angiogénesis, y de esta forma jugando un papel esencial en la homeostasis del sistema vascular. Las alteraciones que se presentan en uno o más de estos fenómenos fisiológicos es lo que se conoce como disfunción endotelial¹ (Fig. 1). No obstante que la asociación entre los factores de riesgo y las enfermedades cardiovasculares está bien documentada, es frecuente la observación de individuos que presentan numerosos de estos factores que no desarrollan enfermedad cardiovascular, lo cual hace pensar en la existencia de un "conector activador" que una vez afectado en forma significativa enlaza los factores de riesgo con las patologías cardiovasculares mediante ciertos procesos anómalos. Dada su localización estratégica y sus propiedades biológicas, es probable que el endotelio vascular constituya este "eslabón perdido" en la cadena de acontecimientos que culmina con las complicaciones del sistema cardiovascular². La alteración de la relajación dependiente del endotelio debido a la disminución de la síntesis y/o de la biodisponibilidad del óxido nítrico (NO) constituye a la vez, el fenómeno más temprano, y la más importante característica de la disfunción endotelial³.

Figura 1: Disfunción Endotelial.

El óxido nítrico cumple una serie de funciones relacionadas con la homeostasis del sistema vascular como la regulación del tono de los vasos, inhibición de la agregación plaquetaria, inhibición de la adhesión y trasmigración leucocitaria, así como la ordenación de la proliferación y migración de las células musculares lisas, entre otras. De ello se deduce que la reducción de la actividad de esta molécula constituye uno de los elementos claves en todos los procesos fisiopatológicos que culminan en las enfermedades cardiovasculares⁴. Sin embargo, estos fenómenos, además de ser variados y complejos no han sido completamente dilucidados⁵.

El endotelio en condiciones normales emite múltiples señales moleculares que le conceden propiedades antiagregante plaquetaria, antitrombótica y antiaterogénica, lo cual lo hace un órgano esencial en el mantenimiento de la homeostasis del sistema vascular. Bajo condiciones patológicas se producen alteraciones en uno o más de los mecanismos de señalización molecular emitidos por éste, lo cual es conocido como disfunción endotelial.

Biología de la sintetasa de óxido nítrico endotelial (eNOS)

El NO es un radical libre producido exclusivamente por la enzima sintetasa de óxido nítrico (NOS). Han sido descritas tres isoformas de esta enzima, las cuales son altamente homólogas en su estructura primaria. Una isoforma es induciblemente expresada en las células fagocíticas y por eso recibe el nombre de sintetasa de óxido nítrico inducible (iNOS). Las otras dos isoformas son expresadas constitutivamente, aunque su expresión puede ser modulada por diversos factores, éstas son las formas neuronal o nNOS, y la endotelial o eNOS⁶. La eNOS sintetiza el NO a partir de L-arginina mediante un paso de oxidación de 5 electrones por medio del intermediario NG-hidroxi-L-arginina^7,8. Los sustratos utilizados por esta enzima son el aminoácido L-arginina, el oxígeno molecular y la nicotinamida adenina dinucleótido (NADPH). Los cofactores requeridos son la tetrahidrobiopterina (BH4), la flavina adenina mononucleótido (FMN) y la flavina adenina dinucleótido (FAD). Además, la enzima contiene sitios de enlace para el grupo hemo y la calmodulina, siendo ambos esenciales para su actividad. Después del enlace de la calmodulina cargada de calcio con la eNOS entre el dominio reductasa COOH-terminal y el dominio oxigenasa NH2-terminal de la enzima, los electrones son donados por el NADPH en el dominio reductasa, estos a su vez, son subsecuentemente transportado por intermedio del dominio del enlace a la calmodulina hacia el dominio oxigenasa que contiene el grupo hemo, lo cual resulta en la formación de los productos enzimáticos citrulina y NO⁹. (Fig. 2).

Figura 2: Biología de eNOS

El NO es producido principalmente por los leucocitos, las neuronas y las células endoteliales. En las últimas la eNOS sintetiza NO a partir de su sustrato la L-arginina mediante un paso de oxidación de 5 electrones por medio del intermediario NG-hidroxi-L-arginina.

REDUCCIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE NO. Alteración de la trascripción de eNOS

Aunque el término inducible ha sido restringido para iNOS, la expresión de eNOS también está regulada por una serie de estímulos¹⁰. Se ha comprobado la existencia de varios factores que disminuyen la expresión de eNOS, entre los cuales se incluye el factor de necrosis tumoral (TNF-α), el cual desestabiliza el ARNm de eNOS, aparentemente por medio del incremento del enlace de proteínas reguladoras al extremo 3’ de la molécula de ARNm^11,12. Otros estímulos que han sido reportados como reductores de la estabilidad del ARNm incluyen lipopolisacáridos¹³, hipoxia¹⁴ y altas concentraciones de las moléculas de las lipoproteínas de baja densidad oxidadas (LDL oxidada)¹⁵, Todos estos factores se encuentran íntimamente implicados en la patogenia de las enfermedades cardiovasculares, por lo cual se puede deducir que la alteración de la síntesis del NO participa en la fisiopatología de estas patologías Fig. 3.

Figura 3: Disminución de la Expresión de eNOS

Diversos elementos propatogénicos como el TNF-α, el lipopolisacαrido, la hipoxia y las altas concentraciones del LDL oxidada son capaces de desestabilizar la molécula de ARNm de la eNOS, ocasionando una reducción transcripcional de las concentraciones de eNOS.

Alteración de la función de la eNOS. Disminución de BH4 y desacoplamiento

Bajo ciertas circunstancias, eNOS puede generar superóxido en lugar de NO, fenómeno que se debe fundamentalmente a la disminución de las cantidades de su cofactor BH4, denominado desacoplamiento de la oxidación de NADPH en la síntesis de NO¹⁶. La generación de superóxido es mediada a través del grupo hemo de su dominio de oxigenasa¹⁷ y es dependiente de la presencia de su sustrato arginina, y su cofactor BH4¹⁸. Cuando la concentración de alguno de estos dos últimos es relativamente baja, eNOS genera superóxido¹⁹. Las células de los mamíferos generan BH4 por medio de la acción de la enzima guanosina trifosfato (GTP) ciclohidrolasa I (GTPCH I)²⁰. Estudios fisiológicos han demostrado una reducción significativa de los niveles de GTPCH I, y de BH4, en diversos estados patológicos como en los casos de insulinorresistencia, en pacientes con alto consumo de cigarrillo y en individuos hipercolesterolémicos, probablemente mediante el incremento de las moléculas de LDL-oxidadas, así como por un aumento en su expresión debido a ciertas citoquinas pro inflamatorias como el TNF-α y la interleuquina-1β (IL-1β)^{21, 22, 23, 24}. Aún más, ha sido demostrado por estudios clínicos en humanos y de experimentación en animales, que la administración aguda de BH4 mejora la disfunción endotelial asociada con hipercolesterolemia, aterosclerosis, hipertensión y hábito tabáquico^25,28. Estos mecanismos exponen un importante nexo entre estados prepatogénicos y un proceso implicado de forma significativa en la aparición de disfunción endotelial. Fig. 4

Figura 4: Desacoplamiento de eNOS

Para la síntesis del NO por parte de la eNOS son necesarias concentraciones adecuadas de BH4 y de su sustrato la L-arginina. Cuando alguno de estos factores se encuentra disminuido en cantidad suficiente, la enzima no es capaz de generar NO, produciendo en su lugar un radical libre altamente perjudicial para la biología de las células como es el anión superóxido.

Inhibición Competitiva de eNOS por dimetilarginina asimétrica

La dimetilarginina asimétrica (ADMA) es un aminoácido que circula en el plasma, que es excretado por la orina, y se encuentra en células y tejidos²⁹. Esta molécula es sintetizada por las células endoteliales a partir de la arginina por la acción de una enzima perteneciente al grupo de las denominadas proteína arginina metil transferasas (PRMTs) específicamente la PRMT-1³⁰. Su importancia radica en la elevada capacidad que presenta esta molécula para inhibir la síntesis de óxido nítrico, y por ende, exhibir múltiples efectos patógenos en el sistema cardiovascular³¹. La expresión y actividad de la PRMT-1 en las células endoteliales se ve modulada por diversos estímulos. Los niveles de esta enzima se ven incrementados en respuesta a moléculas de LDL³² y al estrés de flujo, ocasionando por ende una elevación en los niveles intracelulares de la ADMA. Por el contrario su actividad puede ser bloqueada por la supresión de una cinasa que fosforila al conjunto de proteínas conocidas como inhibidores kβ (Iβ), las cuales una vez fosforiladas son incapaces de retener en el citoplasma al factor nuclear kβ (NFkβ), el cual entonces es libre de traslocarse al núcleo donde ejerce sus funciones como factor de trascripción Iβ³³, sugiriendo la existencia probable de un papel regulador por parte de las citoquinas en el incremento de su actividad. Además de lo anterior, se ha demostrado que múltiples factores pro patogénicos (hipercolesterolemia, hiperglicemia, citoquinas pro inflamatorias, hiperhomocisteinemia, entre otros) pueden ocasionar una alteración de la actividad de la enzima que metaboliza a la ADMA, la dimetilarginina dimetilaminohidrolasa (DDAH), mediante la generación de un estado de estrés oxidativo, ocasionando de esta forma, una elevación significativa de las concentraciones de la ADMA intracelular³⁴, Así podemos ver el nexo que une múltiples factores de riesgo para enfermedades cardiovasculares con la elevación de la ADMA y la disfunción endotelial, participando el estrés oxidativo como un factor esencial en este mecanismos fisiopatológico. Fig. 5.

Figura 5: ADMA y Disfunción

La dimetilarginina asimétrica (ADMA) al igual que la L-arginina es un aminoácido que circula en el plasma, es excretado por la orina, y es encontrado en células y tejidos. Cuando las concentraciones de la primera (ADMA) exceden las de la segunda (L-arginina), se produce una inhibición competitiva de la síntesis de NO por parte de eNOS que conduce a la génesis de la disfunción endotelial

Aumento de la actividad de la arginasa

La arginasa es una enzima encargada de la conversión de la arginina a ornitina, y de allí a úrea. Esta enzima se encuentra en el organismo humano en dos isoformas, la arginasa I que esta constitutivamente expresada en las células endoteliales, y la arginasa II, que puede ser inducida en éstas células por el lipopolisacárido y el interferon-γ³⁵. De lo anterior se desprende que ciertos procesos infecciosos agudos o inflamatorios crónicos, bien sean sistémicos o del árbol vascular podrían producir un aumento importante en los niveles de la arginasa, lo cual repercutiría directamente en una disminución significativa del sustrato de eNOS (arginina), y por ende, de la síntesis de NO.

Lípidos y Caveolae

Estudios realizados por varios grupos de investigadores han indicado que la ubicación de eNOS en la célula determina su actividad enzimática. Un sitio de particular importancia en la célula para la función de la enzima es la caveolae⁶. La caveolae es una estructura constituida por invaginaciones especializadas de la membrana plasmática que está presente en varios tipos celulares, en mayor número en las células endoteliales y en los adipocitos entre otros. Sus componentes principales son el colesterol, los glicoesfingolípidos, y algunas proteínas estructurales como la caveolina³⁶. Actualmente se está acumulando evidencia que indica que numerosos estímulos extracelulares ejercen su acción desencadenadora de señales de transducción mediante esta estructura³⁷. La ubicación de eNOS en el interior de la caveolae determina la inhibición de su actividad enzimática de la eNOS, debido a que en esta condición, la enzima se encuentra inactivada por el enlace con la caveolina-1³⁸. Esta última es una proteína integral de la membrana que se enlaza a eNOS impidiendo la interacción de ésta con la calmodulina cuando los niveles intracelulares de calcio se encuentran bajos³⁹. Niveles elevados de LDL oxidada ocasionan una disminución del contenido de colesterol de la caveolae, resultando esto en la traslocación de la caveolina-1 junto con eNOS al interior de la célula, y por ende, en la inhibición de su actividad⁴⁰. Asimismo, se ha demostrado que el suero hipercolesterolémico y la LDL no modificada son capaces de regular en alta los niveles de caveolina-1, aumentando de esta manera la formación de heterocomplejos entre eNOS y esta proteína, y en consecuencia disminuyendo la producción de NO por parte de la enzima^41,42. Además, se sabe que diversos lípidos proaterogénicos, como la lisofosfatidilcolina y la LDL oxidada, interfieren con la transducción de la señal a partir de los receptores que se encargan de desencadenar la activación de eNOS (receptores de acetilcolina, bradiquinina, serotonina, histamina, entre otros)^43,45. Esto arroja luz sobre otro mecanismo que correlaciona estados prepatogénicos y/o patológicos con la disminución de los niveles de NO, y por lo tanto, con la disfunción endotelial. Fig. 6.

Figura 6: Lípidos y Caveolae. La caveolae es una estructura especializada de la membrana plasmática donde convergen múltiples señales extracelulares y en cuya localización la eNOS se encuentra inactivada por su asociación a la caveolina-1. El suero hipercolesterolémico de por sí, y a su vez, diversos tipos de lípidos proaterogénicos que éste suele contener, ejercen diversas funciones perjudiciales sobre la actividad de eNOS mediante distintos mecanismos. Las moléculas de LDL-oxidadas y la lisofosfatidilcolina tienen la capacidad de inhibir la traslocación de la señal desde los receptores activadores de la eNOS hasta la enzima. Además esta lipoproteína es capaz de disminuir las concentraciones de colesterol en la caveolae, ocasionando una traslocación subsiguiente del heterocomplejo formado por eNOS y caveolina-1 hacia el citoplasma, determinándose así su inactivación. Por su parte, el suero hipercolesterolémico y las moléculas de LDL no modificadas son capaces de regular en alta los niveles de caveolina-1, aumentando la formación de heterocomplejos por parte de ésta con la eNOS, y ocasionando así la inactivación funcional de eNOS.

Disminucion de la biodisponibilidad de NO

Estrés oxidativo

Incluso con un nivel adecuado de producción de NO, bajo ciertas circunstancias este puede no alcanzar sus blancos biológicos debido a una disminución de su biodisponibilidad, lo cual se debe a la interacción de ciertos factores⁴⁶. Existe abundante evidencia experimental indicativa del papel de la inactivación oxidativa del NO como mediadora de la disfunción endotelial y de un fenotipo vascular propatogénico⁵. Por ejemplo, en los casos de hiperlipidemia, la síntesis excesiva de LDL incrementa la formación de LDL oxidada, lo cual resulta en un estado de estrés oxidativo que ocasiona la conversión del NO en peroxinitrito, reduciendo de esta manera sus efectos biológicos⁴⁶. Tanto el NO como el superóxido son radicales libres. Cuando estos dos últimos son expuestos el uno al otro, experimentan una reacción que procede a una velocidad de 6,7 x 109 M-1/s^{-1 47}. Esta es una velocidad aproximadamente tres veces más elevada que aquella a la que se desarrolla la reacción entre superóxido y superóxido dismutasa (SOD). De tal forma, que en un compartimiento en donde existan tanto NO, como superóxido y SOD, el superóxido es susceptible de reaccionar con cualquiera de los otros compuestos, dependiendo de las concentraciones a las que se encuentren estos últimos⁵. Los resultados de diversos estudios apoyan el papel del superóxido como el elemento esencial en la disminución de la biodisponibilidad del NO durante los estados de estrés oxidativo. En conejos con aterosclerosis aórtica, a pesar de la inducción de un aumento de la síntesis de NO hasta tres veces mayor en relación al nivel de síntesis de conejos sanos, hay una notable disminución de la capacidad de relajación dependiente del endotelio, la cual es corregida mediante el tratamiento con SOD⁴⁶. Asimismo, la infusión de ácido ascórbico mejora la respuesta vascular a la acetilcolina en fumadores, pacientes diabéticos e hipertensos^48,50.

Estrés hiperglicémico

La hiperglicemia por si misma incrementa la producción de radicales libres de oxígeno mediante el aumento del metabolismo del ácido araquidónico. En células aórticas endoteliales humanas, a pesar de que la exposición prolongada a altas concentraciones de glucosa aumenta la expresión de eNOS, concomitantemente ésta ocasiona la elevación de la producción de anión superóxido (probablemente a partir de la NADH/NADPH oxidasa) resultando de esto la inactivación de NO. Además, el estrés hiperglicémico prolongado ocasiona la acumulación de productos de glucosilación avanzada, los cuales son capaces de inactivar al óxido nítrico. De hecho, la alteración en la capacidad de relajación dependiente del endotelio en ratas diabéticas puede ser parcialmente restablecida por medio de la administración de aminoguanidina, un inhibidor de la formación de los productos avanzados de la glucosilación⁴⁶. De esta forma es fácil evidenciar la importancia de este mecanismo como uno de los nexos existentes entre la diabetes y el desarrollo de enfermedad cardiovascular.

Conclusiones

La disfunción endotelial, y más específicamente, la alteración en la síntesis o acción del NO, constituye un paso esencial en la fisiopatología de las enfermedades cardiovasculares más prevalentes. Debido a las variadas y esenciales funciones del NO (agente antiaterogénico, antitrombótico, antiproliferativo), cuando se genera una alteración en su producción, o su capacidad de ejercer efectos biológicos, se produce una modificación de la fisiología endotelial, verdadero punto de enlace para todos los fenómenos que culminan en patologías del sistema cardiovascular. Los múltiples procesos relacionados con la reducción de la síntesis y de la biodisponibilidad del NO están lejos de ser dilucidados por completo. Aunque, actualmente hay un cuerpo significativo y creciente de información está siendo conformado, sin embargo, se necesitan estudios que se avoquen a la comprensión de la biología de la eNOS y sus modificaciones patológicas en el curso de la disfunción endotelial. Esto último permitirá generar nuevas estrategias farmacológicas que permitan abordar las diversas patologías cardiovasculares desde su génesis, y de ésta manera prevenir sus temidas complicaciones de un modo más seguro y eficaz.

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