Diseminación tisular de Cryptosporidium SPP en hospedadores murinos experimentalmente inmunosuprimidos

María Antonia de la Parte-Pérez*¹, Elizabeth Bruzual ², Pilar Hurtado¹ y Lucila Arcay ³

¹ Escuela de Enfermería, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela (UCV), Caracas, Venezuela.

² Escuela de Medicina “JM Vargas”, Facultad de Medicina, UCV. Caracas, Venezuela.

³ Instituto de Zoología Tropical, Facultad de Ciencias, UCV. Caracas, Venezuela.

Autor de correspondencia: delaparte@cantv.net

Resumen

Cryptosporidium spp. es un protozoario parásito perteneciente al Phylum Apicomplexa, el cual ha sido estudiado ampliamente a nivel humano y veterinario por ser el causante de la criptosporidiosis. En este trabajo estudiamos la diseminación tisular del parásito utilizando dos grupos de hospedadores murinos: uno constituido por ratones infectados y tratados con ciclofosfamida (CPA) por su efecto inmunosupresor y el segundo por animales infectados, no tratados. El análisis de las muestras del grupo parasitado y tratado presentó una amplia diseminación en el intestino, la tráquea, el pulmón, el bazo, en ganglios linfáticos, glándula tiroides, además del hígado, mientras que el grupo control mostró diseminación solamente en el intestino. Los resultados obtenidos en los roedores inmunosuprimidos sugieren resultados semejantes en cuanto a diseminación en el humano inmunodeficiente y la importancia de enfocarse hacia la prevención de la infección intestinal por este Coccidia en individuos con alteraciones del sistema inmune.

Palabras clave: Cryptosporidium spp., diseminación tisular, inmunosupresión, ciclofosfamida

Abstract

Cryptosporidium spp. is a protozoan parasite icluded in the Phylum Apicomplexa, that has been well studied in humans and animals for being the agent that causes cryptosporidiosis. In this experiment we studied the parasite dissemination to organs and systems in two groups of murine hosts: one constituted by infected mice treated with cyclophosphamide (CPA) to produce immunosuppression and the group control, which included infected animals not treated with CPA. The analysis of tissue specimens pertaining to the group of infected and treated animals, showed wide dissemination of the parasite in intestine, trachea, lung, spleen, lymph nodes, thyroid gland and liver, while tissue specimens from controls showed scarce dissemination to the intestine. Observations in organs and systems of the immunosuppressed mice suggest similar parasite behaviour in the immunodeficient human being, therefore the importance for the application of the preventive measures for the infection by this Coccidia in cases of immunodeficient individuals.

Keywords: Cryptosporidium spp., dissemination, immunosuppression, cyclophosphamide, CPA

Recibido: 06/10/2007 Aceptado: 05/03/2008

Introducción

Cryptosporidium spp. es un parásito perteneciente al Phylum Apicomplexa que incluye parásitos intracelulares obligatorios de importancia médica y veterinaria, capaz de infectar y transmitirse ampliamente y en el entorno familiar comparable con Shigella^1,2,3. Su ciclo reproductivo contiene uno o más estadíos haploides invasivos (asexual) y un estadío diploide resultante de su reproducción sexual^3,6. Fue descrito por primera vez en ratones por Tyzzer en 1907⁷ y actualmente se acepta que el género Cryptosporidium incluye aproximadamente 15 especies⁸. Constituye un parásito intracelular y extracitoplasmático cuyos esporozoítos invaden la célula epitelial mediante movimientos reptantes circulares y helicoidales, demostrados por video microscopía, permaneciendo en la superficie celular en un compartimiento membranoso^3,6.

A pesar de que la importancia clínica de este parásito es bien conocida, no así los mecanismos celulares y moleculares de la infección, los cuales están en estudio. Se ha descrito la presencia de blancos moleculares de anticuerpos protectores del hospedador en el complejo apical o en la superficie de los estadíos invasivos del parásito, los cuales pudieran mediar procesos biológicos cruciales como la motilidad, la adherencia a las células del hospedador, la modificación de su membrana plasmática y la penetración a ésta^4,6.

Cryptosporidium spp. ha sido estudiado ampliamente a nivel humano y veterinario, por ser el causante de la criptosporidiosis, un síndrome entérico caracterizado por cuadros gastrointestinales de severidad variable, en el cual influyen la condición inmunológica del hospedador, el parásito, además del medio ambiente que juega un papel importante^1,3,9,11.

La criptosporidiosis puede afectar a diferentes especies de vertebrados incluido el hombre, manifestándose con un periodo de prepatencia que oscila entre 2 y 14 días en diversos hospedadores domésticos y una variabilidad en el lapso de excreción de ooquistes, llegando a ser indefinida en pacientes inmunocomprometidos^3,8,12.

La diseminación del parásito a diferentes órganos ha sido descrita en la infección natural y en animales de experimentación inmunocomprometidos, siendo la colecistitis por Cryptosporidium la primera infección extraintestinal descrita por primera vez en 1983 y con bastante frecuencia desde esa fecha^13,14. También se reporta diseminado en el aparato respiratorio, hígado, páncreas y otras localizaciones extraintestinales^9,14.

En este estudio utilizamos como inmunosupresor la ciclofosfamida (CPA), uno de los agentes alquilantes más usados en la terapia antitumoral^15,16 el cual, por su acción inmunosupresora, ha merecido mucha atención en relación al control del rechazo de órganos después del transplante, así como en trastornos no neoplásicos acompañados de reactividad inmune alterada, incluyendo artritis reumatoidea^17,18 y en modelos de inmunosupresión en murinos^19,20. Se sabe que la CPA tiene efectos citotóxicos directos sobre las células normales y las tumorales lo cual impacta sobre el sistema inmune. La CPA a la dosis administrada en esta investigación produce linfopenia transitoria a expensas de los linfocitos CD19⁺ ,CD4⁺ y CD8⁺ con una reducción mayor del 90%, 70% y 55% respectivamente, hasta por 2 semanas después de haber culminado el tratamiento^17,21.

Materiales y métodos

Utilizamos 12 ratones machos jóvenes, pertenecientes a la cepa NMRI, los cuales fueron sometidos a iguales condiciones de experimentación. Los ratones se identificaron claramente y luego se distribuyeron en dos grupos de 6 individuos cada uno: el primer grupo de ratones (Mus musculus), parasitado y tratado con ciclofosfamida a dosis de 200 mg/Kg de peso corporal, por la vía endovenosa en la base de la cola, desde el primer día de infección y en días alternos durante cuatro (4) semanas y el segundo, infectado y no tratado, constituyó el grupo control. Ambos grupos fueron infectados por vía oro-esofágica con 0,2 mL de un aislado de Cryptosporidium spp. proveniente de heces de un paciente pediátrico con criptosporidiosis, preservadas en dicromato de potasio al 2,5%, procesadas según la técnica de Sheather (1953)²².

Semanalmente y durante cuatro (4) semanas, se sacrificó un ejemplar de cada grupo y se tomaron muestras de los sistemas digestivo, respiratorio y renal además de ganglios linfáticos, bazo y glándula tiroides, las cuales fueron fijadas en formol al 10%, incluidas en parafina y cortadas a 4 µm de espesor y teñidas por el método de Kinyoun²³, el cual se aplicó de acuerdo al siguiente procedimiento: desparafinado del corte histológico, seguido de tinción con la solución de Kinyoun durante una hora a temperatura ambiente, seguidamente se lavó con agua durante 5 minutos y posteriormente hicimos la diferenciación en dos cambios de alcohol ácido al 1% hasta que el tejido toma un color rosado y lavado posterior con agua durante 5 minutos. A continuación se realizó la tinción de contraste con solución de azul de metileno -sumergir rápidamente y sacar la lámina de la solución - deshidratar con dos cambios de alcohol al 100% y finalmente se elaboraron las láminas para ser observadas al microscopio con objetivo de inmersión.

Resultados

Los resultados obtenidos al estudiar la influencia de la ciclofosfamida (CPA) en relación con la diseminación tisular del parásito en los órganos estudiados pertenecientes a los animales infectados y tratados, se resumen en la Tabla I y algunos de éstos hallazgos se ilustran en las figuras 1, 2 y 3.

En relación a los tejidos de los animales pertenecientes al grupo control, éstos presentaron diseminación parasitaria en número escaso a nivel del tejido conjuntivo de la vellosidad intestinal.

Discusión

La carencia de especificidad de Cryptosporidium spp en los vertebrados y su elevada incidencia en humanos nos motivó a estudiarlo^1,3,9,11. Seleccionamos ratones Mus musculus ya que el modelo murino ha sido reportado por otros autores como modelo conveniente para el estudio de este parásito^3,13,24, pues permite el estudio de la diseminación a los diferentes órganos y tejidos, así como de la observación de sus efectos histopatológicos.

La diseminación tisular de Cryptosporidium spp. a órganos diferentes al aparato digestivo, está ampliamente descrita en modelos animales y en humanos inmunocomprometidos, en muchos casos por la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)^9,11,14. Diversos autores reportan infecciones hepatobiliares con mucha frecuencia, pancreáticas, respiratorias e incluso conjuntivales^14,25,30. En tejidos de corderos y cerdos jóvenes, destinados a la alimentación humana, se ha demostrado la presencia de ooquistes del parásito en la vesícula biliar, los ganglios linfáticos mesentéricos, la tráquea, el pulmón y el útero³¹. Diferentes autores al estudiar la criptosporidiosis en la escala de vertebrados, han establecido las áreas anatómicas más susceptibles de infección en animales inmunocompetentes e inmunocomprometidos^1,3,11,25,31.

En los mamíferos inmunocompetentes se observa infección intestinal, mientras que en inmunocomprometidos la diseminación del parásito ha sido reportada en el aparato gastrointestinal, el hígado, el páncreas, el sistema respiratorio y en áreas del sistema urinario principalmente^25,30.

En nuestro estudio observamos diferentes estadíos del ciclo biológico del parásito en el intestino, la tráquea, el pulmón, el bazo, los ganglios linfáticos, la glándula tiroides además del hígado en animales inmunocomprometidos, lo que coincide con los resultados publicados por otros investigadores en humanos inmunocomprometidos y en modelos animales de experimentación^11,25,30. En relación a las observaciones de las muestras correspondientes al grupo control, la diseminación se presentó únicamente a nivel intestinal y el número de parásitos presentes fue significativamente menor comparado con los hallazgos reportados para el grupo de estudio.

En nuestro trabajo, utilizamos la CPA por su efecto inmunosupresor y estos resultados sugieren mayor número de áreas parasitadas y mayor densidad parasitaria en los tejidos interesados. No hubo diseminación tisular a nivel de los órganos estudiados en el grupo control, excepto en el intestino y, en éste la presencia parasitaria fue escasa.

Los resultados obtenidos en los roedores inmunocomprometidos mediante la administración de CPA, sugieren resultados semejantes en cuanto a diseminación en el humano inmunocomprometido y la importancia de enfocarse hacia la prevención de la infección intestinal por este Coccidia en individuos con alteraciones del sistema inmune.

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