1. Sección de Bioquímica Médica, Instituto de Medicina Experimental, Facultad de Medicina, UCV.
2. Laboratorio de Productos Naturales, Escuela de Química, Facultad de Ciencias, UCV.

RESUMEN:

En microsomas intactos, dos flavonas purificadas a partir de hojas de Bauhinia megalandra, inhiben la actividad de la glucosa-6-fosfatasa en una manera dependiente de su concentración. Ambas flavonas incrementan el valor del K_M para glucosa-6-fosfato, sin modificar el valor de V_MAX. Los resultados permiten concluir que ambas flavonas inhiben competitivamente al transportador de glucosa-6-fosfato (T1), sin afectar ni a la subunidad catalítica ni al transportador de fosfato/pirofosfato (T2) del sistema de la glucosa-6-fosfatasa.

Las flavonas inhiben la capacidad neoglucogénica de rebanadas de hígado incubadas en buffer Krebs-Ringer bicarbonato suplementado con lactato y albúmina saturada con oleato.

La inhibición que ejercen las flavonas sobre el transportador T1 del sistema de la glucosa-6-fosfatasa microsomal, puede explicar la disminución de la capacidad neoglucogénica de las rebanadas de hígado, lo cual podría reducir la concentración de glucosa sanguínea en pacientes diabéticos.

Palabras Clave: Bauhinia megalandra, Glucosa-6-fosfatasa, Flavona, Diabetes

ABSTRACT:

In intact microsomes, two flavones purified from Bauhinia megalandra leaves inhibit glucose-6-phosphatase in a concentration dependant way. Both flavones increased the glucose-6-phosphatase K_M for glucose-6-phosphate without change in the V_MAX. This result allowed to conclude that both flavones competitively inhibit the glucose-6-phosphate transporter (T1) without affecting the catalytic subunit nor the phosphate/pyrophosphate transporter (T2) of the glucose-6-phosphatase system.

The flavones strongly inhibit the neoglucogenic capacity of liver slices incubated in Krebs-Ringer bicarbonate buffer supplemented with lactate and oleate saturated albumine.

The inhibition of G-6-P transporter (T1) of hepatic microsomal G-6-Pase system, produced by both flavones might explain the decrease in the neoglucogenic capacity of the rat liver slices and, in turn, it could reduced the blood glucose levels in diabetic patients.

Key Words: Bauhinia megalandra, Glucose-6-phosphatase, Flavone, Diabetes.

La Glucosa 6-fosfatasa (G-6-Pasa) es la enzima que cataliza la reacción final de los procesos de neoglucogénesis y glucogenolisis siendo, por lo tanto, un factor clave en la regulación de la glicemia. Se encuentra ubicada en retículo endoplasmático (RE) y envoltura nuclear de hígado, riñón e islotes pancreáticos. En mamíferos la enzima del RE se ha descrito como un sistema multicomponente⁽¹⁾ formado por, al menos, 5 polipéptidos: la subunidad catalítica, asociada a una proteína estabilizadora, se orienta hacia el lumen del RE y tres proteinas transportadoras: T1 media el transporte del sustrato glucosa 6 fosfato (G-6-P) hacia el lumen del RE y T2 y T3 permiten la salida de los productos ortofosfato (Pi) y glucosa, respectivamente, hacia el citosol.

Varias plantas son utilizadas por la medicina tradicional venezolana para el tratamiento de la hiperglicemia presente en la diabetes. Entre tales plantas se puede citar a Bauhinia megalandra (casco de vaca), cuyo extracto foliar acuoso es capaz de inhibir la neoglucogénesis hepática y la actividad de la G-6-Pasa⁽²⁾.

En el presente trabajo reportamos el efecto sobre la actividad neoglucogénica hepática y sobre los parametros cinéticos de la G-6-Pasa y pirofosfatasa (PPasa) de dos flavonas purificadas a partir de hojas de B. megalandra.

Para todos los experimentos se utilizó ratas macho de la cepa Sprague Dawley ayunadas durante 24 horas y de peso corporal entre 180 y 200 g. Se purificó los microsomas a partir del hígado según el procedimiento descrito por Marcucci, et al⁽³⁾.

La obtención de las flavonas 5,7,5´-Trihidroxi-2´-O-ramnosilflavona (flavona A) y 5,7,2´-Trihidroxi-5´-O-ramnosilflavona (flavona B) a partir de las hojas de B. megalandra se llevó a cabo tal como describe Perdomo⁽⁴⁾. La actividad de la G-6-Pasa y Pirofosfatasa (PPasa) se ensayó⁽⁵⁾ en microsomas intactos y en rotos (tratados con histonas). Se determinó el efecto inhibidor de las flavonas a una concentración final de 20 µM en el medio de reacción. La integridad de los microsomas se determinó usando manosa 6 fosfato como sustrato⁽⁵⁾, siendo siempre superior a 95%; los valores de K_M y V_MAX se calcularon mediante el programa Enzfitter⁽⁶⁾. Se escogió la concentración de 20 µM de flavonas, pues mayores concentraciones hacen muy inexacto el cálculo de los valores de K_M y V_MAX en microsomas intactos.

La neoglucogénesis se estudió incubando, a 37ºC y en atmósfera O₂:CO₂ (95:5), rebanadas de hígado en buffer Krebs-Ringer bicarbonato⁽⁷⁾ suplementado con albúmina saturada con oleato, en presencia o en ausencia de 10 mM de lactato. El efecto de las flavonas se estudió a una concentración final de 40 µM en el medio de incubación. La incubación se llevó a cabo durante 90 minutos tomando cada 30 minutos una alícuota del medio para la determinación de glucosa. Al finalizar la incubación, las rebanadas se deshidrataron con acetona y se secaron a 70ºC para determinar su peso seco.

La figura 1 muestra el efecto de concentraciones crecientes de las flavonas A y B sobre la actividad de la G-6-Pasa, ensayada a 1mM de G-6-P. En microsomas intactos puede observarse una buena correlación entre la concentración de las flavonas y el porcentaje de inhibición enzimática. En contraste con microsomas intactos, en los cuales la inhibición de la G-6-Pasa se observa a partir de 10 µM de cualquiera de las flavonas, en microsomas rotos la inhibición se manifiesta a una concentración de flavonas mayor a 100 µM.

Como se observa en la tabla 1, el K_M para G-6-P, medido en microsomas intactos, incrementa 63% en presencia de la flavona A y 50% en presencia de la B, siendo estos cambios estadísticamente significativos. Ninguna de las dos flavonas modifica la V_MAX medida en microsomas intactos, ni los parámetros cinéticos medidos en microsomas rotos. Además, ninguna de las flavonas afecta los parámetros cinéticos de la actividad PPasa (Tabla 1), cuando ésta es ensayada en microsomas intactos o en rotos.

Ambas flavonas reducen drásticamente la neoglucogénesis hepática (Figura 2): a 30 minutos la inhibición es de 85%, a 60 minutos es de 50% y a los 90 minutos es de 41%. Aunque la inhibición por efecto de las flavonas parece disminuir con el tiempo, la observación de la figura muestra que la pendiente de la recta que corresponde a las rebanadas incubadas con flavonas es menor que la pendiente control.

La figura 1, además de mostrar un efecto dependiente de la dosis de flavona a la cual se realizó el ensayo, muestra que la G-6-Pasa medida en microsomas intactos es más sensible que la subunidad catalítica, indicando que el transportador T1 es el blanco principal para la acción de estos compuestos.

La observación de que ambas flavonas incrementan el K_M para G-6-P en microsomas intactos sin afectar los otros parámetros cinéticos para G-6-P o para PPi, ni en microsomas intactos ni en rotos, es clara evidencia de que actúan como inhibidores competitivos del transportador T1, sin afectar la subunidad catalítica ni el transportador T2. Por otra parte, el comportamiento reportado anteriormente⁽²⁾ del extracto acuoso como inhibidor no competitivo de T1 puede ser atribuida al carácter heterogéneo de dicho extracto y, es posible que varios compuestos, actuando individualmente o de manera sinérgica, estén afectando el sistema de la G-6-Pasa en diferentes maneras. A este respecto es importante mencionar la presencia en las hojas de B. megalandra de otras fracciones, aun no caracterizadas químicamente, y que poseen capacidad inhibitoria de la G-6-Pasa⁽⁴⁾.

Es interesante mencionar que las flavonas A y B son inhibidores mas potentes del transportador T1 del sistema de la G-6-Pasa que la florizina, pues en el presente trabajo hemos encontrado que estos flavonoides son inhibidores efectivos a concentraciones tan bajas como 20 µM, en comparación a la concentración de 1 mM de florizina reportado por Arion, et al⁽⁸⁾ para detectar el efecto de este compuesto.

Las flavonas aisladas a partir de hojas de B. megalandra actúan como inhibidores competivos del transportador T1 del sistema de la G-6-Pasa microsomal, sin afectar la subunidad catalítica ni el transportador T2 e independientemente de la posición de sustitución de la ramnosa en el anillo de flavona.

Las flavonas reducen drásticamente la neoglucogénesis hepática medida en rebanadas de hígado incubadas en buffer Krebs-Ringer bicarbonato.

Los resultados obtenidos en el presente trabajo pueden explicar la utilización de las hojas de B. megalandra para el tratamiento empírico de la diabetes.

Financiado por: CONICIT n^o : S1-95000685 y CDCH nº PI 09-33-4706-2000.