1. Laboratorio de Fisiología Molecular, Instituto de Medicina Experimental, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela
2. Universidad Técnica de Munich, Alemania.
3. Instituto de Biología Molecular de Enfermedades Infecciosas, Universidad de Würzburg, Alemania.

Aunque el rol inmunológico central jugado por las LC durante la infección con Leishmania se conoce ampliamente, no se sabe si el LPG afecta su maduración y migración a los nódulos linfáticos. En el trabajo aquí referido presentamos evidencias de que la exposición de LC de ratones BALB/c al LPG tiene consecuencias en su maduración y fenotipo. Luego de una incubación de 24 h en presencia de LPG 3 µg ml-1 ocurre un aumento en la expresión de moléculas de superficie como la cadena alfa del receptor de interleukina-2 (CD25), la cual ha sido implicada en procesos de activación celular y las moléculas de adhesión CD31 (PECAM-1) y VE-cadherin (VE-CAD) implicadas en cambios de la migración celular. Estos cambios ocurren sin alteraciones en la expresión del MHC-clase II. Los efectos observados pueden ser mediados por factores solubles liberados por L. major al cultivo, como es el caso del dominio de carbohidratos de LPG ya que los mismos ocurren de forma similar cuando las LC se incuban en LCM.

Palabras Clave: Leishmania, Células dendríticas, Maduración celular, Migración celular.

Abstract:

Despite the immunological changes recognized to be produced during Leishmania major infection it is not known whether Leishmania lipophosphoglycan (LPG), the most abundant glycolipid on the parasite surface, affects the maturation of Langerhans cells and their immune functions. Now we provide evidence that exposure of BALB/c-derived Langerhans cells to LPG has consequences for their maturation and phenotype. Up-regulation of adhesion molecules, such as CD31 and VE-Cadherin, are observed after overnight exposure of Langerhans cells to LPG. On the other hand, expression of major histocompatibility complex (MHC) molecules was not affected. Many of the changes are also induced in Langerhans cells incubated with L. major-conditioned medium, indicating that the observed effects may be mediated by soluble factors released by L. major into the culture, as it is the case for the carbohydrate moiety of LPG. These results provide new insights into the immunoregulatory role of dendritic cells during Leishmania infection. The changes in surface molecule expression induced by the exposure of Langerhans cells to LPG might reflect enhanced maturation of the cells and facilitation of their migration from the infected skin into the draining lymph nodes.

Key Words: Leishmania, Dendritic cells, Cell maturation, Cell migration.

Las células de Langerhans (LC) juegan un papel muy importante en la inmunidad de la piel. Esto se debe a que luego de su exposición a un agente inflamatorio, ellas maduran y adquieren la capacidad de migrar desde la piel a los ganglios linfáticos, expresan un fenotipo característico de células dendríticas (DC) y presentan los antígenos transportados desde la periferia a las diferentes poblaciones de linfocitos T respondedores⁽¹⁾. El agente etiológico de la leishmaniasis, el protozoario Leishmania presenta un ciclo de vida con dos formas funcional y bioquímicamente diferentes; el amastigote aflagelado de forma esférica y de vida intracelular en el fagolisosoma del macrófago y el promastigote, alargado, con un flagelo anterior y de vida extracelular en el tracto digestivo del insecto vector. Clínicamente, la leishmaniasis se presenta bajo distintas manifestaciones a nivel de piel, mucosas u órganos internos y esta diversidad está parcialmente determinada por la especie de Leishmania involucrada^(2,3).

El lipofosfoglicano (LPG) es un glicolípido muy abundante en la superficie del promastigote. Esta molécula tiene una amplia actividad inhibitoria; por ejemplo, la secreción de IL-1b disminuye significativamente en macrófagos estimulados con lipofosfosacárido bacteriano (LPS) y tratados con LPG⁽⁴⁾. Los cambios inmunológicos que ocurren durante la infección con Leishmania y el papel central jugado por las LC está bastante estudiado; sin embargo, no se conoce si el LPG modifica la maduración y migración de las LC y por ende su función presentadora de antígenos. El objetivo del presente trabajo ha sido estudiar el efecto del LPG purificado de Leishmania (L.) major sobre la expresión de moléculas de adhesión de la superficie celular y la maduración de las mismas. Los resultados encontrados nos permiten concluir que la exposición de LC de ratones BALB/c al LPG trae consecuencias funcionales en su maduración y fenotipo. Los cambios observados son también producidos por un medio condicionado por Leishmania, lo cual sugiere que los efectos pueden ser mediados por factores solubles liberados por el parásito al medio de cultivo, como el dominio de carbohidratos del LPG.

Los promastigotes de L. major (MHOM/IL/81/FE/BNI) se cultivaron en medio RPMI GIBCO a 26ºC, suplementado con Glutamina 2 mM, suero fetal bovino al 10%, Hepes 10 mM pH 7,5, gentamicina 160 mg/ml, NaHCO₃^- 7,5% y 2-mercaptoetanol 5x10^-5 M. Al llegar a la fase estacionaria de crecimiento se colectaron los parásitos, se lavaron 2 veces con PBS y se guardaron a –70°C hasta su procesamiento.

La purificación del LPG se realizó siguiendo el protocolo de McConville, et al⁽⁵⁾. El pellet de un pool de 10¹⁰ parásitos se resuspendió en 3,75 ml de cloroformo/metanol/agua (4:8:3). Esta suspensión se sonicó dos horas por períodos de 10 min con pausas de 5 min, a 4°C, se centrifugó la suspensión a 1500 x g, 20 min, a 4°C, se repitió la extracción lipídica y se centrifugó de nuevo la suspensión. El pellet obtenido se resuspendió en 10 ml de agua saturada con butanol y se realizó una extracción butanólica con agitación, a 4°C, por 18 h. Seguidamente la suspensión se centrifugó a 10000 x g, 30 min y se desecó durante toda la noche. El residuo se resuspendió en 5 ml de acetato de amonio 0,1 M, pH 7,2, 5% propanol y se fraccionó en una columna hidrofóbica de octyl-sepharosa, utilizando como fase móbil un gradiente de propanol de 15% a 60% preparado en acetato de sodio 0,1 M, pH 7,2. Se colectaron fracciones de 3 ml a las cuales se les evaluó refractométricamente la concentración de 1-propanol, el contenido de proteínas y el contenido de carbohidratos^(6,7). Las muestras que contenían carbohidratos se reunieron y desecaron, se resuspendieron en agua desionizada a una concentración de 1 µg µl^-1 y se guardaron a –20°C hasta su uso.

El LCM se preparó según el método de Kierszenbaum, et al⁽⁸⁾. Suspensiones de L. major en fase estacionaria de crecimiento se ajustaron a una densidad de 2x10⁷ cel ml^–1 y se incubaron durante 24 h a 37°C, 5% CO₂. La suspensión de células se centrifugó a 2500 x g, 20 min, se pasó el sobrenadante a través de un filtro estéril de 0.22 µm a fin de eliminar todos los restos celulares y se almacenó a –20°C hasta su uso. El LCM preparado de esta manera se consideró al 100% y se diluyó para los experimentos posteriores según la necesidad.

Las suspensiones de LC se prepararon a partir de piel de oreja de ratón BALB/c tripsinizada⁽⁹⁾. Las mitades ventrales gruesas se incubaron a 37°C con 10 ml de tripsina 1% en PBS, 90 min, mientras que las mitades dorsales delgadas se incubaron a 37°C con 10 ml de tripsina 0.6% en PBS, 45min. Estas preparaciones contienen 3-5% de LC absolutamente puras que expresan el complejo mayor de histocompatibilidad tipo II (MHC-clase II)⁽¹⁰⁾.

LC, 3 x 10⁶ por pozo se incubaron toda la noche a 37°C, 5% CO₂ en platos de 12 pozos en ausencia de estimulantes (control), o en presencia de 100 ng ml^-1 LPS (LPS), o 3 µg ml^-1 LPG (LPG) o 25% LCM (LCM). Al día siguiente se recogieron cuidadosamente las células no adheridas y se utilizaron para evaluar la expresión de los marcadores de superficie escogidos.

Las LC recogidas se incubaron 30 min a 4°C con un anticuerpo anti ratón-I-A^d-biotinilado y rata-anti CD86 (B7-2), o rata-anti-CD25, o rata-anti CD31, o rata-anti-VE-Cadherin y los isotipos respectivos a una dilución 1:100 en PBS, 2% suero fetal de bovino. Seguidamente se tiñeron con streptavidina-FITC y asno-anti-rata-PE a una dilución 1:100 en PBS, 2% suero fetal de bovino. Las células que expresaron el MHC clase II se analizaron para la expresión del resto de los marcadores de superficie luego de establecer una ventana de adquisición en un sorteador de células por fluoresecencia de Becton Dickson.

La densidad de LPG en la membrana de Leishmania aumenta durante la metaciclogénesis⁽¹¹⁾. Debido a sus propiedades inmunogénicas se piensa que juega un papel esencial en la interacción del parásito y su célula hospedera⁽¹²⁾. Sin embargo, aunque el rol inmunológico central jugado por las LC durante la infección con Leishmania se conoce ampliamente, no se sabe si el LPG afecta su maduración y migración a los nódulos linfáticos. En el trabajo aquí referido presentamos evidencias de que la exposición de LC de ratones BALB/c al LPG tiene consecuencias en su maduración y fenotipo. Luego de una incubación de 24 h en presencia de LPG 3 µg ml-¹ ocurre un aumento en la expresión de moléculas de superficie como la cadena alfa del receptor de interleukina-2 (CD25), la cual ha sido implicada en procesos de activación celular⁽¹³⁾ y las moléculas de adhesión CD31 (PECAM-1) y VE-cadherin (VE-CAD) implicadas en cambios de la migración celular^(14,15) (Figura 1). Estos cambios ocurren sin alteraciones en la expresión del MHC-clase II ni de la molécula coestimulatoria B7-2 (Figura 2).

Los efectos observados pueden ser mediados por factores solubles liberados por L. major al cultivo, como es el caso del dominio de carbohidratos de LPG⁽¹⁶⁾ ya que los mismos ocurren de forma similar cuando las LC se incuban en LCM al 25%, equivalente a una concentración de LPG purificada de 3 µg ml^-1 y a una relación parásito a LC de 3 a 1.

Estos resultados otorgan nuevos datos sobre el papel inmunoregulatorio de las células dendríticas durante la infección con Leishmania ya que los cambios en la expresión de las moléculas de superficie inducidos por la exposición de las células de Langerhans al LPG pueden reflejar alteraciones en la maduración y en la capacidad de migración de la célula desde la piel infectada hasta el ganglio linfático.

Los cambios inmunológicos que ocurren durante la infección con Leishmania y el papel jugado por las células de Langerhans (LC) de la piel está bastante estudiado, sin embargo, no se conoce si el lipofosfoglicano (LPG), el glicolípido más abundante en la superficie de este parásito, modifica la maduración y migración de las LC y por ende su función presentadora de antígenos. Durante el desarrollo del presente trabajo hemos evidenciado que la exposición de LC al LPG trae consecuencias funcionales en su fenotipo. Así, aunque la expresión del MHC clase-II no se modifica, se evidencia una sobre-expresión de las moléculas de adhesión CD31 y VE-Cadherina, así como de CD25. Muchos de los cambios son producidos también por un medio condicionado por Leishmania. Esto indica que los efectos encontrados pueden ser mediados por factores solubles liberados por el parásito al medio de cultivo, como es el caso del dominio de carbohidratos del LPG. Los cambios en la expresión de las moléculas de superficie inducidos por la exposición de las células de Langerhans al LPG, reflejan alteraciones en la maduración de las LC y pueden reflejar modificaciones en su migración desde la piel infectada hasta el ganglio linfático.

Financiado por el CDCH PI 09-33 (4356-99 y 4581-2000). La Dra. Alicia Ponte-Sucre gozó de una beca de la Fundación Humbolt y de una beca sabática del CDCH-UCV para visitar el laboratorio de la Dra. Heidrun Moll.