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Revista de la Facultad de Medicina
versión impresa ISSN 0798-0469
RFM v.25 n.1 Caracas ene. 2002
O De Marcucci1, I Escalona1 y J Espinoza1.
RESUMEN:
Los efectos de nutrientes sobre la cantidad de PDC presente en las mitocondrias hepáticas fueron estudiados en ratas Sprague-Dawley que recibieron dietas ricas en sacarosa. Después de 21 días de recibir una dieta rica en sacarosa, libre de grasa (SLG), los animales se separaron en dos grupos, uno que continuó con la misma dieta (inducción) y el otro, la dieta suplementada con aceite de pescado al 10% (represión). Luego de 3 semanas, la actividad mitocondrial de PDC fue titulada con IgG anti-PDC de rata para establecer la cantidad de proteína necesaria para neutralizar 200 mg de IgG (PE; punto de equivalencia). La dieta SLG causó un incremento en la actividad del complejo y disminución en el PE en relación con los animales control, mientras que la dieta con aceite de pescado produjo efectos contrarios. La inmunotitulación es un método sensitivo para cuantificar cambios en la expresión de PDC causados por manipulaciones nutricionales.
Palabras Clave: Complejo piruvato deshidrogenasa, Inmunotitulación, Sacarosa.
ABSTRACT:
The effects of nutrients on the amount of pyruvate dehydrogenase complex (PDC) present in hepatic mitochondria were investigated in Sprague-Dawley rats fed on a high-sucrose diet. After 21 days of feeding on a high-sucrose fat-free diet (SLG), the animals were separated in two groups: one continued on the SLG diet (induction) and the other received the same diet supplemented with 10% fish oil (repression). After 3 weeks, mitochondrial PDC activity was titrated against anti-rat PDC Ig G to establish the amount of protein required to neutralize 200 mg of IgG (PE, equivalence point). The SLG diet produced an increase in the total activity of the complex and a decrease in PE as compared with control animals. Fish oil feeding produced the opposite results. Results indicate that immunetitration is a sensitive method to detect changes in the expression levels of PDC due to dietary manipulation.
Key Words: Pyruvate dehydrogenase complex, Immunetitration, Sucrose feeding.
INTRODUCCIÓN
El complejo piruvato deshidrogenasa (PDC) cataliza la descarboxilación de piruvato con la formación de CO2, acetil-CoA y NADH. Desde hace algún tiempo se ha propuesto que la actividad de este complejo multienzimático podría estar relacionada con el control de la utilización del acetil-CoA para la síntesis de grasas (lipogénesis) y colesterol (colesterogénesis) en el hígado. Estudios realizados en nuestro laboratorio han demostrado la existencia de mecanismos regulatorios que operan a largo plazo sobre el sistema del PDC. Cuando animales experimentales son sometidos a dietas que estimulan la formación de grasas, es decir dietas ricas en sacarosa y bajas en grasa, se observa una inducción del complejo, la cual es inhibida por la adición de grasa poliinsaturada a la dieta. En este trabajo se describe el empleo del método de inmunotitulación para cuantificar las modificaciones en la cantidad de enzima presente en las mitocondrias hepáticas, en animales sometidos a dietas ricas en sacarosa, suplementadas o no con aceite de pescado. Con este modelo de inducción-represión enzimática se iniciaron los estudios sobre los mecanismos que regulan la expresión de los genes que codifican los componentes del complejo, para compararlos con los que se han descrito para las enzimas lipogénicas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se formaron 10 grupos de 4 ratas macho de la cepa Sprague Dawley de 120 g de peso corporal. El grupo 1 se sacrificó al inicio del experimento y sirvió como control; los 9 grupos restantes se alimentaron ad líbitum con una dieta rica en sacarosa y libre de grasa (SLG) hasta el día de su sacrificio. Los animales se sacrificaron a los 7 días (grupo 2), 14 días (grupo 3), 21 días (grupo 4), 28 días (grupos 5 y 6), 35 días (grupos 7 y 8) y 42 días (grupos 9 y 10). A partir del día 21, los grupos 6, 8 y 10 empezaron a recibir una dieta rica en sacarosa suplementada con 10% de aceite de pescado (S+AP), mientras que los grupos 5, 7 y 9 continuaron recibiendo la dieta SLG. El aceite de pescado se empleó en estos experimentos porque se ha demostrado previamente que tiene un efecto represor del PDC más marcado que el aceite de maíz(1,2).
La inmunotitulación se realizó con antisuero anti-PDC de rata y extractos mitocondriales preparados siguiendo un procedimiento previamente descrito en el cual se emplea digitonina para lisar y eliminar los lisosomas y se añaden inhibidores de proteasas para evitar la disgregación e inactivación del PDC(3). Las mitocondrias hepáticas se aislaron por centrifugación diferencial y se incubaron por 15 min a 30ºC en un medio con 10 mM de carbonil cianuro-m-clorofenil hidrazona para activar al PDC. Luego, las mitocondrias se resuspendieron en 50 mM KPi pH 7,0; 2% Tritón X-100; 10 mM EGTA; 2% suero de rata; 1 mM cloruro de benzamidina; 0,1 mM leupeptina; 1 mM fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF) y 1 mM Na-tosil -L-lisina clorometil cetona (TLCK), se congelaron en nitrógeno líquido y se descongelaron bruscamente 3 veces sumergiendo los tubos en agua a temperatura ambiente, luego de lo cual se centrifugaron a 8.000 g por 5 min. Se determinó la concentración de proteínas de los extractos, los cuales se almacenaron a -80ºC(4).
Para los ensayos de inmunotitulación, se utilizó un rango de proteínas desde 100 mg hasta 1,2 mg de los extractos mitocondriales en un volumen final de 200 mL en 140 mM NaCl; 5 mM KPi pH 7,4; 2% Tritón X-100; 0,2 mg/mL albúmina de suero bovino; 0,1 mM DTT; 0,1 mM PMSF; 0,5% de suero de rata y 200 mg de IgG anti PDC purificada en el laboratorio. Luego de incubar, primero a temperatura ambiente por 30 min. y luego durante 12 - 16 horas a 4ºC, se centrifugaron las muestras por 2 min. a 8.000 g, se determinó la actividad total del PDC (PDCT) en los sobrenadantes. Las actividades del PDC y de la citrato sintetasa (CS) fueron estimadas en los extractos y en los sobrenadantes empleando métodos espectrofotométricos(1).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La actividad total del PDC en los animales alimentados ad líbitum con una dieta SLG, aumenta significativamente con respecto al grupo control (alimentado con ratarina) a partir de la primera semana de dieta (Figura 1). Luego de una semana de haber cambiado la dieta SLG por una suplementada con aceite de pescado, los niveles del PDCT decrecen y se hacen similares a los del grupo control, mientras que, en los animales que continuaron consumiendo la dieta SLG, la actividad de PDCT continuó incrementándose. Esto sugiere que las grasas poliinsaturadas, pueden reprimir el aumento en la actividad total del PDC provocado por la dieta SLG aún en presencia de la sacarosa en la dieta, posiblemente modificando la cantidad de enzima presente. Para comprobar esta hipótesis, se emplearon métodos inmunológicos para cuantificar la inducción producida por la dieta SLG y el efecto represor de la grasa poliinsaturada en términos de la cantidad de PDCT inmunoreactiva presente en los extractos.
Figura 1: Efectos de dietas ricas en sacarosa suplementadas o no con grasa poliinsaturada sobre la actividad total de la PDC en hígado de rata
* Indica diferencias significativas respecto al control a p < 0,05.
j
Indica diferencias significativas respecto a la dieta SLG a p < 0,05.
Los resultados de las inmunotitulaciones se muestran en la Figura 2. El análisis por regresión lineal de estos valores permitió calcular el punto de equivalencia (PE) para cada extracto. Este PE representa la cantidad de proteína, presente en el extracto, que se requiere para neutralizar una determinada cantidad de IgG, en este caso 200
mg de IgG. Los valores promedio de estos puntos de equivalencia, así como de las actividades del PDC para cada uno de los grupos estudiados se muestran en la Tabla 1. Cuando ocurre inducción del PDC, es decir, cuando el contenido mitocondrial de la enzima aumenta, los valores del PE descienden, ya que es necesario añadir una menor cantidad de extracto para obtener la neutralización del antisuero. Por el contrario, si hay represión y el contenido mitocondrial de la enzima disminuye, el valor del PE aumenta.
Figura 2: Inmunotitulación del PDC en extractos mitocondriales de hígados de ratas, alimentadas con dietas ricas en sacarosa suplementadas o no con grasas poliinsaturadas
Cada punto representa el promedio ± SEM, n = 4. Los coeficientes de regresión lineal variaron entre 0,9877 y 0,9997.
Al analizar los resultados mostrados en la Tabla 1, se observa que la actividad específica de la CS no fue afectada significativamente en los diferentes grupos. Los pequeños cambios en la actividad específica observados para los grupos SLG 28 días, SLG 42 días y S+AP 7 días con respecto a los controles, pueden explicarse en base a diferencias en el grado de extracción de la enzima durante el aislamiento de las mitocondrias y la obtención de los extractos. La actividad específica del PDC respecto a CS, incrementó gradualmente durante el período en que se administró la dieta SLG hasta alcanzar valores de 2,5 veces el valor control a los 42 días. Así mismo, los valores del PE disminuyeron 2,7 veces en el mismo período, respecto al valor control. Al sustituir la dieta SLG por S+AP, se produjo un descenso de la actividad de 2,5 veces, acompañado de un aumento del PE de 2,2 veces, al cabo de 7 días.
Tabla 1: Inmunotitulación del complejo piruvato deshidrogenasa en extractos mitocondriales
| Grupo | CS/ mg prot. | mU PDCT/ CS | PE/ mg prot. |
| Control (ratarina) | 0,404 ± 1,20 a | 171,4 ± 6,4 a | 878,0 ± 6,4 a |
| SLG 7 días | 0,436 ± 0,04 a | 204,4 ± 4,3 b | 429,0 ± 5,4 b |
| SLG 14 días | 0,466 ± 0,04 a | 203,6 ± 3,2 b | 404,6 ± 2,8 b |
| SLG 21 días | 0,348 ± 0,001 a | 210,4 ± 2,9 b | 326,6 ± 5,3 c |
| SLG 28 días | 0,321 ± 0,01 b | 233,5 ± 4,3 c | 325,9 ± 10,4 c |
| SLG 35 días | 0,380 ± 0,02 a | 367,4 ± 2,1 d | 327,4 ± 14,7 c |
| SLG 42 días | 0,308 ± 0,03 b | 414,9 ± 5,4 e | 318,7 ± 4,7 c |
| S + AP 7 días | 0,487 ± 0,02 c | 179,6 ± 3,2 a | 700,5 ± 0,8 d |
| S + AP 14 días | 0,443 ± 0,01 a | 190,9 ± 1,8 f | 784,9 ± 0,4 e |
| S + AP 21 días | 0,398 ± 0,001 a | 192,3 ± 6,3 f | 810,3 ± 10,3 f |
Se muestran los valores promedio ± la desviación estándar de la media de las actividades totales del PDC (PDCT), de la citrato sintetasa (CS) y de los puntos de equivalencia de cada grupo. Las diferentes letras indican diferencias significativas respecto al control a p < 0,05.
CONCLUSIONES
Los cambios observados en la actividad específica del complejo (PDCT/CS) pueden ser atribuidos a cambios en el contenido mitocondrial de la enzima, ya que la reactividad inmunológica medida en base al punto de equivalencia se modificó en forma similar a las variaciones de actividad total.
Los resultados refuerzan las observaciones previamente descritas utilizando"immunoblotting"(1) y, además, nos permiten estimar cuantitativamente pequeños cambios en la expresión de la enzima hepática. Esta metodología nos permitirá analizar y evaluar los factores nutricionales y hormonales que influyen en la regulación de la expresión del PDC en el hígado y en otros tejidos de la rata.
AGRADECIMIENTO
Financiado por CONICIT Proyecto S1-95000697 y CDCH Proyecto 09-33-4605-2000.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Da Silva L, De Marcucci OL, Kuhnle ZR. Dietary Polyunsaturated Fats Suppress the High-Sucrose-Induced Increase of Rat Liver Pyruvate Dehydrogenase Levels. Biochem. Biophys. Acta. 1993; 1169: 126-134. [ Links ]
2. De Marcucci OL, Da Silva L, Kuhnle ZR, Mayz R. Efectos de Dietas sobre la actividad del Complejo Piruvato Deshidrogenasa Hepático. Implicaciones Sobre el Metabolismo Hepático. Archivos Latinoamericanos de Nutrición. 1995; 45: 293-299. [ Links ]
3. Denyer GS, Kerbey AL, Randle PJ. Kinase Activator Protein Mediates Longer-Term Effects of Starvation on Activity of Pyruvate Dehydrogenase Kinase in Rat Liver Mitochondria. Biochem J. 1986; 239: 347-354. [ Links ]
4. Markwell MA, Haas SM, Bieber LL, Tolbert NE. A Modification of the Lowry Procedure to Simplify Protein Determinations in Membrane and Lipoprotein Samples. Anal. Biochem. 1978; 87: 206-210. [ Links ]
