Cambios a largo plazo en la actividad del complejo piruvato deshidrogenasa (PDC) hepático en respuesta a distintas dietas modifican la cantidad de enzima presente. En este trabajo se determinaron los niveles de mRNA correspondientes a la subunidad E1a del complejo mediante RT-PCR semicuantitativo. Se determinó que la dieta rica en sacarosa produjo un incremento de 40% en los niveles de mRNA correspondiente a la subunidad E1a con respecto a los animales control luego de 7 días. Al cabo de 14 a 21 días, el incremento fue de sólo 20%. La adición de aceite de pescado a las dietas redujo los niveles de mRNA a niveles indistinguibles del control en sólo 7 días. La regulación de la expresión del gene para E1a puede atribuirse a modificaciones en las tasas de transcripción genética o en la estabilidad del mensajero transcrito, en forma similar a las enzimas que regulan la lipogénesis.

Palabras Clave: Complejo piruvato deshidrogenasa, E1a, Regulación genética.

Studies on the long-term regulation of pyruvate dehydrogenase complex (PDC) have shown that the total amount of enzyme changes in response to different diets. In this report, the levels of mRNA for E1a subunit of the complex were estimated by semi-quantitative RT-PCR. A high-sucrose fat-free diet produced a 40% increase in the levels for the mRNA after a week. After 14-21 days of diet the increase was only by 20%, but the addition of polyunsaturated fat from fish oil reduced the levels of mRNA to the values obtained from control animals in only a week. Regulation of the expression of this gene may be due to changes in the rate of transcription or on the stability of the mRNA transcribed, as has been shown for other enzymes related to the control of lipogenesis.

Key Words: Pyruvate dehydrogenase complex, Gene expression, E1a.

Estudios previos han demostrado que la regulación, por parte de nutrientes y hormonas, de la expresión de la mayoría de las enzimas glicolíticas y lipogénicas ocurre a nivel transcripcional o post-transcripcional^(2,3). Para establecer si los mecanismos que regulan la expresión de los genes correspondientes al PDC, operan en una forma similar a como lo hacen para las enzimas lipogénicas, se realizaron estudios sobre la influencia de la administración de dietas ricas en sacarosa, suplementadas o no con grasas poliinsaturadas (aceite de pescado) sobre los niveles de mRNA correspondientes a la subunidad E1a del complejo.

Se emplearon ratas macho de la cepa Sprague-Dawley agrupadas en 10 grupos de 4 animales cada uno. Todos los grupos recibieron ad líbitum una dieta rica en sacarosa y libre de grasa (SLG) hasta el día 21, a partir del cual 3 grupos comenzaron a recibir la dieta de sacarosa suplementada con aceite de pescado. El sacrificio de cada grupo de animales se realizó cada 7 días a partir del inicio del experimento y se tomaron muestras de tejido hepático que se almacenaron en nitrógeno líquido. A partir de estas muestras se realizó la inmunotitulación del complejo y el aislamiento y purificación del RNA total⁽⁴⁾, que luego fue analizado mediante RT-PCR semicuantitativo y cuantificación con un densitómetro GS-670 de Biorad. Para la amplificación se seleccionaron cebadores específicos para el gen de la subunidad E1a de acuerdo a Amessou, et al⁽⁵⁾ y para el gen de b-actina según Kabir, et al⁽⁶⁾, este último fue utilizado como control interno de la amplificación. Para verificar que el producto de amplificación de E1a correspondía con este gen se realizó la secuenciación del fragmento amplificado⁽⁷⁾.

La Figura 1 muestra el resultado típico del aislamiento del RNA total (panel A) sobre un gel de agarosa en el que se observan claramente las bandas correspondientes a los RNA ribosomales 28S y 18S, lo que indica la ausencia de degradación del RNA durante la purificación. En el panel B de la misma figura se muestran los productos de amplificación para E1a (aproximadamente 296 pares de bases) y para b-actina (aproximadamente 235 pb).

La secuencia del fragmento amplificado mediante los cebadores para E1a se encuentra representada en la Figura 2. Esta secuencia es idéntica a la publicada para E1a de tejidos somáticos de rata⁽⁹⁾.

Luego de 7 días de dieta SLG se observa un incremento de 1,4 veces en los niveles de mRNA correspondiente a la subunidad E1a con respecto a los animales control (Figuras 1-B y 3). Luego de 14 y 21 días, el incremento fue de sólo 1,2 veces con respecto a los controles. La adición de aceite de pescado redujo los niveles de mRNA a niveles indistinguibles del control en sólo 7 días.

La comparación de estos resultados con los valores de actividad del complejo indica que el incremento en la actividad del complejo en respuesta a dietas hiperlipogénicas, está acompañado de un incremento en los niveles de mRNA al menos para la subunidad E1a. Esto puede deberse a un incremento de las tasas de transcripción del gen o a un aumento en la estabilidad del mensajero transcrito. Los resultados sugieren que la expresión de los genes que codifican al complejo (al menos a la subunidad E1a) es modulada por el tipo de nutrientes (carbohidratos y grasas) a nivel de la transcripción o de la estabilidad de los mensajeros.

Resultados preliminares de nuestro laboratorio obtenidos de animales a los cuales se administró la dietas SLG durante plazos inferiores a los 7 días, indican que los niveles de mRNA para la subunidad E1a se elevan tempranamente con respecto a los animales control, alcanzando un máximo (2,5 veces) entre los 3 y 5 días de dieta. Proximamente iniciaremos estudios sobre la expresión del gen que codifica para la subunidad E1b del PDC a fin de establecer si es regulada por factores nutricionales en forma similar a E1a y si existe una expresión coordinada de ambas subunidades.

Los autores desean expresar su agradecimiento al Dr. Adolfo Borges (Facultad de Medicina, UCV) por la secuenciación del fragmento de E1a y sus valiosas sugerencias para la realización del trabajo. Asimismo estamos agradecidos al Centro Nacional de Enfermedades Reumáticas del H.U.C. y al Prof. Mulchand Patel (University of New York, Buffalo) por el apoyo técnico para la realización del trabajo. Financiado por CONICIT Proyecto S1-95000697, CDCH Proyecto 09-33-4605-2000 y la ayuda Nº 00022/99 del Fondo para la Investigación de la Facultad de Medicina.