A Borges¹, S Sánchez de Villarroel¹, I Lippo de Becemberg¹, MJ Alfonzo¹ y R Gonzalez de Alfonzo¹.

1. Sección de Biomembranas, Instituto de Medicina Experimental, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela.

Palabras Clave: Guanilil ciclasa, Músculo liso de las vías aéreas, Péptido natriurético.

ABSTRACT:

Key Words: Guanylyl cyclase, Airway smooth muscle, Natriuretic peptide.

La enzima Guanilil Ciclasa (GC, E.C. 4.6.1.2) cataliza la producción de GMP cíclico (cGMP) a partir de GTP. El cGMP es un segundo mensajero involucrado en una amplia variedad de respuestas fisiológicas. Existen dos variantes moleculares de la GC: una isoforma particulada, enlazada a la membrana (mGC) y una isoforma soluble (sGC), la cual contiene un grupo hemo. Las isoformas particuladas son proteínas de una única subunidad que constan de un dominio extracelular, al cual se enlaza el ligando; un sector transmembrana; una región que enlaza ATP y es similar en estructura y función a diversas quinasas, y por último, un dominio intracelular que contiene el sitio activo donde ocurre la síntesis del cGMP⁽¹⁾. En vertebrados existen tres grupos de mGCs, a saber, las mGC sensibles a los péptidos natriuréticos (GC-A, sensible al péptido natriurético atrial (ANP) y la GC-B, sensible al péptido natriurético cerebral (CNP); la mGC activada por la enterotoxina de Escherichia coli y el péptido guanilina; y las mGCs específicas de órganos receptores.

El cGMP juega un rol significativo en el control del diámetro de las vías aéreas, ejerciendo un efecto relajante del músculo liso broncotraqueal mediante la activación de las quinasas dependientes del cGMP. En el músculo liso extraído de la tráquea de bovino (MLTB), se ha identificado una mGC sensible a agonistas muscarínicos, requiriéndose NaCl para tal activación⁽²⁾. Esta mGC parece ser regulada por los receptores muscarínico M2 y M3 del músculo liso a través de una proteína G sensible o insensible, respectivamente, a la toxina Petussis. Con la finalidad de caracterizar la mGC sujeta a esta novedosa regulación, el presente trabajo describe su caracterización a través de métodos moleculares y bioquímicos, revelándose que se trata de una mGC sensible al péptido natriurético CNP.

Se purificó RNA total a partir de MLTB empleando el reactivo Trizol™ (Gibco BRL). Se emplearon 5 mg de RNA para la síntesis de DNA complementario (cDNA) usando el kit SuperScript II RT-PCR (Gibco). El cDNA obtenido fue sujeto a amplificación por PCR usando los siguientes oligonucléotidos degenerados, diseñados para enlazarse a regiones que distan 270 bp y que codifica para un sector de 90 amino ácidos, altamente conservado entre todas las sGC y mGC descritas hasta el presente: (Sentido) 5’-GTI.TA(C/T). AA(G/A).GTI.GA(G/A).ACI.ITI.GGI.GA(T/C).III.TA(T/C).ATG-3’ y (Contrasentido) 5’-CC.(G/A)AA.IA(G/A).(G/A)CA.(G/A)TA.ICI.IGG-3’ (I corresponde al nucléotido modificado deoxi-inosina). Los productos de PCR fueron ligados al vector pCR2.1-TOPO^® (Invitrogen). Células de E. coli TOP10 transformadas con los productos de la ligación fueron sujetas a screening mediante PCR para colonias intactas empleando el cebador universal del bacteriofago M13 y un cebador sGC-específico como oligonucléotidos sentido y contrasentido, respectivamente. Los plásmidos con inserto que resultaron negativos para esta prueba fueron aislados por el método de la lisis alcalina y secuenciados en un secuenciador PE-ABI 377 automatizado.

Se emplearon los siguientes cebadores para la amplificación de cDNAs específicos para GC-A, GC-B y GC-C: GC-A (producto de 414 bp), sentido: 5’-AAGAGCCTGA-TAATACCTGAGTACT-3’; contrasentido: 5’-TTGCAGGCTGGGTCCTCATTGTCA-3’; GC-B (producto de 562 bp), sentido: 5’-AACGGGCGCATTGTGTATATCTGCGGC-3’; contrasentido: 5’-TTATCACAGG-ATGGGTCGTCCAA-3’; GC-C (producto de 553 bp), sentido: 5’-ATAAGTCAGGTGACTGCCGGA-3’; contrasentido: 5’-TGGCGTGCCACA-CATAACAAT-3’.

Las fracciones subcelulares del MLTB fueron obtenidas de acuerdo a lo descrito por Lippo de Bécemberg, et al⁽²⁾.

La figura 1A muestra los resultados obtenidos para la RT-PCR con cebadores de secuencia degenerada para la amplificación de las mGC La población de fragmentos correspondiente (270 bp) fue clonada en el plásmido pTOPO-TA con el fin de determinar la proporción de transcritos de GC presentes en el MLTB. De 500 clones procesados, 76% (380) correspondieron a la subunidad b1 de la sGC bovina. El 24% (120) de los clones restantes contuvo insertos de secuencia nucleotídica idéntica a la reportada para la mGC sensible al péptido CNP de cerebro de bovino⁽³⁾. La figura 1B muestra el resultado de la RT-PCR para el cDNA de MLTB usando cebadores específicos para GC-A (414 bp), GC-B (562 bp) and GC-C (553 bp), rindiendo en todos los casos los productos de tamaño esperado. Por otra parte, se midió la actividad de GC en fracciones subcelulares del MLTB con la finalidad de confirmar por medios bioquímicos la proporción de sGC:mGC obtenida por métodos moleculares. Los resultados indicaron que la fracción soluble contribuye con el 67% a la GC total del extracto del MLTB (5110 ± 250 pmoles cGMP/min/g tejido húmedo). La Figura 2 muestra el efecto de los péptidos ANP, CNP-53 y guanilina sobre la actividad de mGC del MLTB (fracción de membranas plasmáticas). Cada péptido produjo un efecto concentración-dependiente sobre la producción de cGMP. Sin embargo, el efecto obtenido para el CNP-53 (10^-5 M) fue aproximadamente 1.5 veces más potente que el obtenido en el caso del ANP, con una concentración-efecto 50% (EC₅₀) de ~10 nM. La guanilina no tuvo efectos apreciables sobre la actividad de mGC. El efecto obtenido al usarse CNP-53 o CNP-22 fue de magnitud comparable (resultados no mostrados).

Este trabajo permitió determinar que la isoforma particulada más abundante en el MLTB es del subtipo activado preferencialmente por el péptido natriurético CNP. La evidencia obtenida en este sentido por métodos moleculares se corroboró por ensayos bioquímicos, en donde la actividad de mGC fue ensayada en presencia de concentraciones crecientes de ANP, CNP y guanilina. La activación máxima obtenida con CNP (para 10^-5 M) fue 2.8 veces la actividad de GC basal. CNP resultó también el activador más potente de la mGC en comparación con ANP o guanilina. Con esta evidencia nos dedicamos ahora a explorar la posibilidad de que la GC-B del MLTB esté sujeta a regulación por los receptores M2 y M3. Los resultados moleculares y bioquímicos también permitieron hallar que la isoforma soluble contribuye el ~67% de la GC total. La proporción de sGC podría resultar más elevada si se toma en cuenta la retención de hemoproteínas en la fracción P.