1. Histotecnólogo del Laboratorio de la Sección de Patología Cardiovascular del Instituto Anatomopatológico José A. O´Daly – UCV. (IAP-UCV).
2. Jefe de la Sección de Patología Cardiovascular del Instituto Anatomopatológico José A. O´Daly – UCV. (IAP-UCV).

    La observación y evaluación de la MEC reticular en los cortes de miocardio facilita la interpretación de los procesos patológicos como: hipertrofia y atrofia celular, necrosis, engrosamiento de las membranas basales vasculares y engrosamiento y desorganización del endomisio y perimisio. Se compararon los cortes de 10 casos con enfermedades cardiovasculares teñidos con cuatro métodos de impregnación metálica para la visualización de fibras reticulares de la MEC. De los métodos empleados (Gridley, Gomori, Snook y Wilder) se consideró que el de Gomori ofreció mayor grado (IV) de optimización (3/8) para la visualización de los elementos tisulares evaluados (perimisio, endomisio, membrana nuclear y basal).

Palabras Clave: Fibras reticulares, Matriz extracelular reticular, Métodos de impregnación metálica histológica.

    The valorarion of the reticular extracellular matriz (ECM) in the myocardial sections is usefull in order to interpretate certain pathologic proceses such as: cell hypertrophy and atrophy, necrosis, thickness of vascular basement membrane and tickness and disorganization of the endomysium and perimysium. Sections of 10 cardiovascular disease cases were compared using four methods of metal impregnation to visualize reticular fibers in the ECM. Of the four methods used (Gridley, Gomori, Snook and Wilder) the Gomori method offered a highest level of optimization (3/8) to visualize the histological elements evaluated (perimysium, endomysium, nuclear and basement membrane).

Key Words: Reticular fibers, Reticular extracellular matrix, Histological methods of metal impreganation.

    El estudio de la matriz extracelular (MEC) ha cobrado importancia en estos últimos años, como respuesta o remodelación del miocardio ante varias injurias⁽¹⁾. Los tipos de remodelamiento de la matriz extracelular colágena (MEC) se identifican con las coloraciones para fibras colágenas: van Gieson, Mallory, Masson, Gomori y otras. Estas coloraciones permiten identificar dos tipos de remodelación del tejido colágeno: la fibrosis de tipo reparativa y reactiva^(2,3).

    Siendo las fibras colágenas los principales elementos fibrilares de la MEC es fundamental identificarlas en los procesos patológicos miocárdicos. Las otras fibras, reticulares y elásticas están más en contacto directo con los elementos celulares o cardiomiocitos, conforman el endomisio y constituyen el andamiaje donde se ordenan las células^(4,5,6). En varios procesos patológicos, como la hipertrofia celular se observan importantes modificaciones del endomisio que alteran la disposición espacial normal celular y causan anormalidades en la microvasculatura⁽⁷⁾.

    Las fibras reticulares se llaman también argirófilas por su marcada tendencia a impregnarse con las sales de plata, resisten a la digestión pépsica y trípsica y a la necrosis excepto en los infartos agudos del miocardio dónde se ha demostrado pérdida del tejido conectivo argirófilo⁽⁸⁾.

    Las fibras reticulares son isótropas (no tienen birrenfringencia) y no se observan a la luz polarizada: aunque son Ácido Periódico-Schiff positivas porque contienen mucopolisacáridos, se evidencian claramente con las técnicas de impregnación argéntica las cuales dan mejores resultados desde el punto de vista de nitidez y homogeneidad.

    Por estas razones, el estudio de la estructura de las fibras reticulares en la patología del músculo cardíaco es muy importante.

    En la mayoría de los trabajos sobre remodelación^(9,10) se utilizan tinciones para evidenciar las fibras reticulares. Por ende, opinamos que es interesante observar el miocardio patológico con varios métodos de impregnación metálica para fibras reticulares con la finalidad de determinar cual de ellos ofrece mayor precisión en la disposición y morfología de la matriz extracelular reticular (MECR).

    El objetivo principal de este trabajo es comparar con cuatro técnicas de impregnación metálica para fibras reticulares, la morfología de la MEC y escoger el método que ofrece mayor facilidad y rapidez de ejecución, así como el menos contaminante para el técnico y el medioambiente.

    La MEC está constituida por la sustancia fundamental por fibras (colágenas, reticulares y elásticas) y células. Las fibras de la MEC constituyen en conjunto el andamiaje el cual sostiene los elementos celulares parenquimatosos (los cardiomiocitos) y a las células mesenquimáticas del tejido conectivo⁽⁴⁾. Las fibras reticulares forman verdaderas redes o enrejados compactos que rodean cada célula o grupos celulares de una función común. No se disponen en haces, sino en filamentos entrecruzados que dan lugar a redes perivasculares, (Figura 1).

    Se denomina impregnación metálica a la precipitación de un metal (plata) reducida sobre las fibras reticulares y otros elementos determinados de los tejidos. El metal entra en contacto con los tejidos bajo la forma de solución salina; la reducción es debida en parte a la acción propia del tejido y a la de sustancias reductoras utilizadas en cada técnica o a agentes físicos como la luz. El metal forma un compuesto metal-orgánico para sensibilizar el tejido y luego la plata reemplaza ese metal. La plata amoniacal es la que impregna las fibras reticulares. Ese metal sensibilizante puede ser una solución de nitrato de uranilo (Técnica de Wilder), de nitrato de plata diluida (Técnica de Gridley) o de aluminio férrico (Técnica de Gomori).

    Técnicas de impregnación con Plata. Principios: En estas técnicas la sal de plata más empleada es el nitrato de plata, de allí que esta operación se denomina también nitratación.

Con esta técnica se impregnan dos tipos de elementos:

• Las fibras reticulares de la MEC que rodean células y vasos para poner en evidencia los límites de los elementos celulares obteniéndose una imagen negativa de estos últimos.

• Los elementos citológicos (núcleo, aparato de Golgi) y elementos nerviosos los cuales dan una imagen positiva.

    Las técnicas para fibras reticulares esencialmente son de dos tipos: 1) En cortes congelados, los cuales derivan del método tanno-argéntico de Achucarro (1911) y 2) Las derivadas de la técnica de Bielchowsky (1904) para cortes congelados o en parafina.

    El número de variantes derivadas de las técnicas madres son numerosas.

    Los métodos modernos de impregnación argéntica, pueden ser clasificados en dos grandes grupos, partiendo del tipo de solución al que se exponen los tejidos para lograr la impregnación. De esta manera, tenemos métodos de plata amoniacal y de metenamina plata.

1) Métodos de Plata Amoniacal: Todos los métodos de plata amoniacal, tienen los siguientes pasos principales: Oxidación, sensibilización, exposición a la solución de plata, reducción, tonificación, remoción de la plata que no ha reaccionado y la coloración de contraste.

    Muchos de los métodos de plata amoniacal tienen mecanismos similares^(11,12). Todos utilizan como base la solución de Bielchowsky que se prepara precipitando 20cc de nitrato de plata al 5% con 5 gotas de hidróxido de sodio al 40%. Luego se redisuelve el precipitado resultante añadiendo gota a gota amoníaco y se completa con agua destilada hasta obtener un volumen total de 40cc.

    La Oxidación de los tejidos sirve para amplificar la subsecuente tinción de las fibras reticulares. Los oxidantes pueden variar de acuerdo a las técnicas. Los lavados, luego de la oxidación sirven para remover el exceso de reactivo.

    El paso de sensibilización es básicamente una impregnación con una sal metálica que forma compuestos orgánico-metálicos con el tejido y luego este metal sensibilizado es reemplazado por la plata de la solución de nitrato de plata.

    Posteriormente, los tejidos son tratados con la solución de plata amoniacal. Usualmente, no hay cambios de color hasta que las secciones realmente se hayan reducido. Este proceso de reducción es comúnmente denominado revelado, y las técnicas de plata-diamina requieren concentraciones variables de formalina (formaldehido HCHO) como agente reductor.

    La plata metálica visible que resulta del proceso de reducción puede ser marrón o negra, dependiendo de la cantidad de plata y del tamaño de las partículas. Estos depósitos pueden ser tonalizados convirtiéndolos en depósitos de oro metálico que son púrpura negros, al tratarlos con cloruro de oro (AuCl3). El oro metálico es mucho más estable que la plata metálica, y los cortes tratados con esta solución muestran un mejor contraste y claridad que los que no han sido tratados con la solución.

    El tratamiento final de la sección para su contraste es la inmersión de las láminas en una solución de tiosulfato de sodio que forma complejos solubles con la plata iónica que no ha reaccionado con el tejido. Esta remoción de la plata no reactiva previene una tardía reducción no específica de la plata con la luz, al igual que remueve el exceso de cloruro de oro que pueda estar presente en el tejido.

2) Métodos de metenamina de plata: Los métodos de metenamina de plata de Jones y Gomori, están basados en la producción de grupos aldehidos a partir de los grupos a-glicol de los carbohidratos presentes en las fibras reticulares y en las membranas basales luego de la exposición de los tejidos a una solución de ácido peryódico. Estos aldehidos se reducen con los complejos de metenamina de plata dando como resultado plata metálica visible. El cloruro de oro y el tiosulfato de sodio, son usados en estos métodos y cumplen las mismas funciones que en las impregnaciones de plata amoniacal⁽¹²⁾.

    Se tomaron muestras de ventrículo izquierdo de 10 corazones con patología miocárdica, autopsiados en el Instituto Anatomopatológico José A. O´Daly de la UCV.

    Se eligieron cuatro técnicas de impregnación argéntica para fibras reticulares: Retículo de Gridley, Snook, Gomori y de Wilder(11), (Tabla 1 y 2).

    Se tomaron importantes precauciones a la hora de realizar las impregnaciones: Todo el material fue fijado con formol tamponado (Buffer) al 10% debido a que una mala fijación dará como resultado una impregnación poco precisa. Se utilizaron productos químicos absolutamente puros y agua bidestilada certificada. No se debe usar agua destilada comercial o el subproducto comercial de condensación, ya que puede estar ácida y tener impurezas.

    Se conservaron en la oscuridad las soluciones de las sales de oro y plata y los líquidos osmiados. El polvo es inadecuado para la integridad de estas soluciones, por esta razón fue cuidadosa la limpieza de los frascos. Antes de utilizar los envases lavamos la boca de éstos y se secaron cuidadosamente así como su tapa. Nunca se dejaron destapados. También, la oscuridad fue necesaria durante la impregnación sobre todo en el momento en que las sales metálicas entran en contacto con las sustancias orgánicas reductoras.

    En el momento de la impregnación se usó abundante líquido sobre los cortes. La solución incubadora en el método de Gomori se agitó frecuentemente durante la impregnación para renovar la superficie de contacto.

    Todas las soluciones se almacenaron en envases de vidrio rigurosamente limpios. Es recomendable usar utensilios nuevos que se destinarán sólo para las técnicas de impregnación de plata. No se pusieron en contacto con las soluciones de sales o con los fragmentos a impregnar, ningún objeto de metal (hierro o acero). Las pinzas, eran de plástico. Algunos autores opinan que el tejido fijado con algún fijador que contenga mercurio, éste debe ser removido con tiosulfato de sodio yodado.

    Para valorar la sensibilidad de las técnicas se estableció una gradación de la calidad de los elementos tisulares observados (I al IV), considerando cuatro grados de optimización de visualización de daño celular miocárdico y alteraciones de la MEC, (Tabla 3).

    En la tabla 4 se exponen los diagnósticos anatomo-patológicos cardíacos de los 10 casos seleccionados para el estudio realizado.

    En la tabla 5 están tabulados los grados de optimización establecidos para la visualización en el miocardio de las fibras reticulares; en los casos teñidos con los cuatro métodos de impregnación argéntica descritos.

    Los parámetros evaluados en el estudio histopatológico fueron: fibras perivasculares (1); endomisio (2); perimisio (3); necrosis celular (4); contornos de núcleos y cromatina nítida (5); gránulos citoplasmáticos como la lipofucsina(6); membranas basales de los capilares (7) y linfáticos (8), (Tabla 6).

    En varios cortes de miocardio se observó precipitado metálico especialmente en los tratados con el método de Snook (n° de cortes 5/10). Los precipitados metálicos se observaron mayormente en los cortes teñidos con Wilder y Snook. En cuatro casos las lesiones patológicas tisulares no pudieron ser evaluadas por defecto de tinción ocasionado posiblemente por fijación tisular inadecuada en el momento de la autopsia. En los seis casos restantes, los cortes impregnados con los diferentes métodos mostraron diversos grados de optimización de visualización de los elementos estudiados. Se observaron nítidamente los contornos celulares y membranas basales de los capilares y linfáticos. El perimisio o perivascular estaba aumentado en varios casos de HTA. En un infarto reciente se observó desorganización de las fibras reticulares del miocardio. En la mayoría de los cortes, se tiñeron los pigmentos de lipofucsina y otros elementos citoplasmáticos. El cambio más observado fue la hipertrofia celular, (Figura 2).

    Las fibras reticulares han sido consideradas como precursoras de las fibras colágenas, siendo denominadas anteriormente "precolágenas". Según algunos autores constituyen los haces finales deshilados de las fibras colágenas. Sin embargo, están rodeadas de histiocitos y no de fibroblastos. A la microscopía electrónica tienen una estructura periódica axial como las de la colágena. Entre las colágenas y ellas varía el contenido de aminoácidos y no dan "cola" a la cocción, ni tiñen con los tricrómicos para fibras colágenas. Están formadas por colágeno de tipo III asociado a glicoproteínas, en las paredes arteriales y musculares, colágeno tipo V y IV en las membranas basales⁽¹³⁾.

    Por otra parte, la MEC juega un importante papel en la migración celular y por lo tanto en la morfogénesis tisular. Han sido descritos defectos específicos del metabolismo del colágeno en enfermedades humanas y en animales domésticos. Las alteraciones de la disposición de la MEC reticular contribuyen a una mejor y adecuada interpretación de las alteraciones histopatológicas.

    Todos los métodos para impregnar fibras reticulares con nitrato de plata derivan del procedimiento inicial publicado por Ramón y Cajal en 1903, el cual constituye la más preciosa adquisición de la técnica histológica moderna. El principio de estos métodos consiste en impregnar fragmentos o preparados de tejidos prefijados con una solución débil de nitrato de plata y luego reducir el metal con un reductor fotográfico como el pirogalol o hidroquinona.

    Han sido descritos dos: método de Ramón y Cajal de alcohol amoniacal (1910), método de Ramón y Cajal al nitrato de uranio (1914), método de Da Favio al nitrato de cobalto (1920); método Jahnel (1917) y métodos para los cortes histológicos: métodos de Sand (1916); método de Balbuena (1925); métodos amoníaco argénticos. Todos estos métodos utilizan el líquido de Bielschowsky que se prepara disolviendo con el amoníaco del óxido de plata precipitado del nitrato mediante el hidróxido de sodio.

    En este trabajo, tres de las impregnaciones de plata utilizadas pertenecen al grupo de los métodos de plata amoniacal: Snook, Gridley y Wilder, a diferencia de Gomori, el cual pertenece al de los métodos de metenamina de plata y cuyos principios fundamentales difieren⁽¹²⁾; sin embargo, dentro del mismo grupo de las impregnaciones de plata amoniacal, en cada uno de los métodos empleados, aún cuando parten del mismo principio, se usaron reactivos y tiempos de reacción diferentes en cada uno de sus pasos.

    Aunque todos los métodos utilizados en este trabajo mostraron los elementos mas importantes de la matriz extracelular, consideramos que el método de Gomori es el que nos ofrece mayores ventajas no sólo desde el punto de vista técnico sino que nos permitió observar con mayor nitidez la estructura de las fibras reticulares en el miocardio.

    Se ha observado una tendencia a la precipitación de plata en las técnicas de plata amoniacal sobre todo en la de Snook y atribuimos este fenómeno a la rapidez que exige esta técnica en los lavados, además que la exposición a los reactivos se hace en un puente donde las soluciones entran directamente en contacto con el aire y el contacto con éste, aunque sea mínimo acelera el proceso de descomposición de la solución de plata. Este fenómeno es menos frecuente en la técnica del Gomori ya que la solución de plata para la impregnación se hace en forma de baño (coplyn) cubre completamente las láminas y va a la estufa tapado de manera que la exposición es controlada casi completamente aun cuando cada cierto tiempo esta debe agitarse.

    Además con la técnica de Gomori, los cortes a pesar del calor que reciben directamente tienden a desprenderse menos que los que han sido teñidos con las otras tres técnicas, y es debido a que las concentraciones de las soluciones utilizadas para la impregnación son muy altas y afectan a los tejidos sobre todo cuando el procesamiento de estos es deficiente (fijación, deshidratación impregnación). Es importante señalar también que el grosor de los cortes histológicos repercute en la calidad y la ejecución de la técnica. Cortes con más de 3µ de grosor se sobre impregnan y se desprenden, lo cual no pasa en los cortes de 2µ a 3µ. De igual manera los tiempos de reacción de la Técnica de Gómori (Tabla 2) a pesar de no ser tan rápida como el Snook o el de Wilder ofrecen la ventaja de pasos mas largos en la tinción los cuales permiten controlar de mejor manera la calidad de la impregnación. Lo mismo se aplica respecto a la poca cantidad de reactivos usados en su ejecución, (Tabla 1).

    La escogencia de un solo método de impregnación metálica para visualizar la MEC, facilita el trabajo del laboratorio de técnica histológica cardiovascular y permite desarrollar destreza técnica cada vez mayor y más precisa, lo cual redundará finalmente en un mejor estudio complementario del miocardio.

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