CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Y ESPECTROFOTOMETRÍA EN LUZ ULTRAVIOLETA:  VALIDEZ ACTUAL Y APLICABILIDAD PARA DETECTAR COCAÍNA O BENZOILECGONINA EN ORINAS DE PACIENTES FARMACODEPENDIENTES EN PROCESO DE RAHABILITACIÓN

CL Expósito de Goikoetxea¹.

¹ Profesor Agregado (MSc) de la Cátedra de Toxicología, Escuela de Bioanálisis, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela.

RESUMEN

     Este estudio intenta evaluar la validez actual y la aplicabilidad, como ensayos de rutina, de los métodos de Cromatografía en Capa Fina (CCF) y Espectrofotometría en Luz Ultravioleta (LUV), para detectar cocaína o su principal metabolito la benzoilecgonina, en muestras de orina de pacientes farmacodependientes, empleadas en el laboratorio de Toxicología de la Escuela de Bioanálisis de la Facultad de Medicina de la Universidad Central de Venezuela, para lo cual se recolectaron un total de 124 muestras de orina provenientes de pacientes farmacodependientes en proceso de rehabilitación del Ambulatorio "Parque Miranda" de la Fundación "José Félix Ribas", las mismas se sometieron a extracción con cloroformo en medio alcalino, Para la detección de la cocaína o la benzoilecgonina se empleó -en el caso de la CCF- el sistema para bases nitrogenadas (T1), mientras que el estudio espectrofotométrico se efectuó en el Shimadzu UV-160, utilizando como método de referencia el Inmunoenzayo Enzimático Heterogéneo ELISA. Se obtuvieron 78 (70,96%) resultados positivos con ELISA y ninguno con CCF ni con LUV; 36 (29,03%) negativos con ELISA y 124 (100%) con CCF y 124 (100%) con LUV. Al comparar los resultados positivos y negativos obtenidos por los tres métodos se encontró diferencia estadísticamente significativa (p<0,05). De acuerdo con estos resultados concluimos que la CCF y la LUV tal y como se emplean en nuestro laboratorio no se pueden aplicar como ensayos presuntivos o de screening en el análisis toxicológico de las citadas muestras.

Palabras Clave: Cromatografía en capa fina (CCF), Espectrofotometría en luz ultravioleta (LUV), Cocaína, Benzoilecgonina, Farmacodependientes.

ABSTRACT

     This study intended to evaluate the current validity and the applicability, as a routine analytical method, of thin layer chromatography (TLC) and UV spectrophotometry methods in the detection of cocaine and its major metabolite -benzoylecgonine- among drug addicts seeking treatment at the ambulatory center "Parque Miranda" of the "José Félix Ribas" Foundation, as employed in the Laboratory of Toxicology, School of Bioanálisis, Facultad de Medicina, Central University of Venezuela, using heterogeneous immunoassay (ELISA) as reference technique. Cocaine and benzoylecgonine were isolated by alkaline extraction with chloroform in 124 urine samples. The T1 system was employed for TLC method, while for the UV spectrophotometry assay the Shimadzu UV-160 was used.. 78 (70,96%) positive results were obtained with ELISA and none with TLC or UV spectrophotometry; 36 (29,03%) negative results were obtained with ELISA and 124 (100%) with TLC and UV spectrophotemetry. A significant statistically difference (p<0,05) was observed when comparing results from the three methods, suggesting that they cannot be applied as used en our laboratory- for presumptive or screening techniques in toxicology analysis of urine samples.

Key Words: Thin layer chromatography (TLC), UV spectrophotometry, Cocaine, Benzoylecgonine, Drug addicts.

 

 INTRODUCCIÓN

    El uso de sustancias con efectos psicotrópicos se ha convertido en un severo problema que afecta a los individuos y a las sociedades contemporáneas⁽¹⁾.

    La drogadicción es un problema universal; prácticamente no existe nación en el mundo que no se vea afectada de alguna manera por el abuso de sustancias que causan dependencia, tanto legales (tabaco, alcohol y medicamentos psicotrópicos) como ilegales. Estas últimas, por las implicaciones que el narcotráfico conlleva, significan riesgos adicionales para los gobiernos, poniendo en riesgo la estabilidad interna de los Estados y provocando desagradables fricciones entre los países⁽²⁾.

    Entendemos por drogadicción al acto de consumir cualquier sustancia capaz de producir un cambio en la conducta del individuo y además de producir en éste una fuerte dependencia que incita al consumo continuo de la misma⁽²⁾.

    En los últimos años se ha observado un incremento en el consumo de drogas de abuso en países occidentales, como consecuencia se han creado un gran número de centros para el tratamiento de fármacodependientes. El análisis de estas drogas en fluidos biológicos como herramienta de terapia se ha incrementado⁽³⁾.

    El incremento en el consumo de drogas, especialmente de sustancias que conllevan al desarrollo de abuso y adicción, ha generado la necesidad de detección de estas sustancias por los laboratorios especializados⁽⁴⁾.

    Los métodos de ensayo utilizados para detectar, confirmar y cuantificar drogas son parte importante en el proceso de detección de drogas. La sensibilidad, precisión y especificidad son críticos para la generación de resultados válidos y confiables⁽⁵⁾.

    Con este trabajo nos proponemos comparar la validez actual y la viabilidad en cuanto a sensibilidad y especificidad de los métodos analíticos empleados en la Cátedra de Toxicología de la Escuela de Bioanálisis como son la Cromatografía en Capa Fina (CCF) y la Espectrofotometría en Luz Ultravioleta (LUV) con una metodología un poco más avanzada, como es el Ensayo Inmunoenzimático Heterogéneo (ELISA), con el fin de aprovechar las metodologías disponibles en el laboratorio de Toxicología, tomando en cuenta que se trata de técnicas sencillas, económicas y relativamente rápidas, ya que el ELISA no se encuentra a nuestro alcance por motivos presupuestarios, mucho menos las metodologías más sofisticadas y modernas que existen.

    Todo esto con el objeto de ofrecer determinaciones periódicas de drogas de abuso, en este caso cocaína, a pacientes que se encuentran en proceso de rehabilitación en el Centro Ambulatorio "Parque Miranda" de la "Fundación José Félix Ribas", en un principio y también a diferentes Centros o Instituciones relacionadas con este campo que no cuentan con un laboratorio propio, ni personal entrenado para tal fin.

MATERIALES Y MÉTODOS

    Para nuestro estudio se procesaron 124 muestras de orina provenientes de pacientes consumidores de drogas de abuso que se encuentran en período de rehabilitación en el Centro de Atención Ambulatoria Parque Miranda de la Fundación José Félix Ribas, siguiendo en todos los casos las recomendaciones de la Cadena de Custodia. Este Centro constituye una modalidad de tratamiento ambulatorio conformado por psiquiatras, psicólogos y trabajadores sociales, quienes atienden a una población integrada por personas de cualquier sexo, en edades que oscilan entre los 14 y 45 años (no limitante), que presentan consumo de drogas (legales e ilegales).

    Las muestras se procesaron en el Laboratorio de Toxicología de la Escuela de Bioanálisis de la Facultad de Medicina de la U.C.V. A todas se les determinó la densidad y el pH para comprobar la integridad de las mismas para el análisis. Posteriormente se les hizo determinaciones para cocaína por el método Inmunoenzimático Heterogéneo (ELISA), Cromatografía en Capa Fina (CCF) y Espectrofotometría en Luz Ultravioleta (LUV). Las mismas se separaron en dos porciones: Una alícuota de aproximadamente de 2 ml se congeló y el resto de la muestra se procesó por los métodos de ELISA, CCF y LUV.

    Para demostrar que no se obtuvieron resultados falsos positivos con CCF ni con LUV, se procesaron 10 muestras de orina obtenidas de sujetos no consumidores de drogas como grupo control, dichos resultados se compararon con el método ELISA.

    También se procesaron por CCF y LUV los calibradores comerciales de 0 ng/ml y 300 ng/ml empleados por el método de ELISA, y los patrones de clorhidrato de cocaína en concentraciones de 0,1 mg%, 200 ng/ml, 300 ng/ml y 500 ng/ml, preparados en el laboratorio.

    Las metodologías utilizadas fueron:

Método Inmunoenzimático Heterogéneo (ELISA)

    Para este método se utilizó el kit comercial específico para cocaína (Microzyme, Enzyme Inmunoassay Test Kit, Diatech Diagnostics inc), se aplicó es procedimiento visual.

Cromatografía en Capa Fina (CCF)

    Para este método procedimos a la extracción de la cocaína y su principal metabolito: la benzoilecgonina, para esto se alcalinizó la orina hasta alcanzar un pH entre 8 y 9, se agregó 10 ml de cloroformo en un embudo de separación; del extracto clorofórmico se tomó una alícuota de 6 ml, el cual se evaporó a sequedad para posteriormente retomarlo con 0,1 ml de ácido acético 2N para sembrarlo en la cromatoplaca y proceder a la migración de la muestra aplicando el sistema de CCF para bases nitrogenadas.

Espectrofotometría en Luz Ultravioleta (LUV)

    Para este se utilizaron 4 ml del extracto clorofórmico, el cual se evaporó a sequedad y se retomó con 2 ml de ácido clorhídrico 0,1 N, el cual se pasó a una cubeta de cuarzo y se procedió a realizar un barrido en el espectro de luz ultravioleta entre 200 y 300 nm, utilizando para la medición el Shimadzu UV-160.

ANALISIS ESTADÍSTICO

    El grado de concordancia entre la CCF, la LUV y el ELISA se realizó de acuerdo al número de resultados positivos y negativos obtenidos para las determinaciones de cocaína, el mismo se hizo aplicando la prueba Chi Cuadrado y el nivel de significación (p) seleccionado fue de 0,05. La prueba fue aplicada empleando el programa Graph PAD Stat (Gpis®).

RESULTADOS

    Al realizar las determinaciones para cocaína por CCF, LUV y ELISA obtuvimos 88 (70,96%) resultados positivos por ELISA y ninguno (0%) por CCF ni por LUV, 36 (29,03%) resultados negativos por ELISA, 124 (100%) por CCF y por LUV, (Figuras 1, 2 y 3). Al comparar los resultados positivos y negativos obtenidos por los tres métodos se encontró diferencia estadísticamente significativa (p<0,05), (Figura 4).

Figura 1

Comparación de los valores positivos y negativos para cocaína por el método ELISA ( n = 124)

En la figura 1 se resumen los resultados positivos y negativos para la cocaína obtenidos por el método de ELISA.

 

Figura 2

Comparación de los valores positivos

y negativos para cocaína

por el método CCF ( n = 124)

En la figura 2 se resumen los resultados positivos y negativos para la cocaína obtenidos por el método de CCF.

Figura 3

Comparación de los valores positivos

y negativos para cocaína

por el método LUV ( n = 124)

En la figura 3 se resumen los resultados positivos y negativos para la cocaína obtenidos por el método de LUV.

 

Figura 4

Comparación de los resultados obtenidos al analizar

las 124 muestras por los métodos ELISA, CCF y LUV

En la figura 4 se resumen los resultados positivos y negativos para la cocaína obtenidos por el método de ELISA, CCF y LUV.

 

    Con el objeto de demostrar que no se obtuvieron resultados falsos positivos con la CCF, la LUV y el ELISA se procesaron 10 muestras de orina de sujetos no consumidores de drogas, obteniéndose resultados negativos por los tres métodos, (Tabla 1).

Tabla 1

Comparación de los resultados obtenidos por los tres

métodos empleados con respecto a las muestras libres de droga

Negativos			Positivos
	CCF	LUV	ELISA	CCF	LUV	ELISA
Cocaína	10	10	10	0	0	0

      Por otra parte, cuando utilizamos los calibradores comerciales de 0 ng/ml y 300 ng/ml de benzoilecgonina empleados para el ELISA, tratados en las mismas condiciones que las muestras, se obtuvieron en ambos casos resultados negativos por el método CCF y LUV, (Tabla 2).

Tabla 2

Resultados obtenidos con la CCF y LUV

utilizando los calibradores de ELISA

Calibradores  (Benzoilecgonina)	CCF	LUV
0 ng/ml	Negativo	Negativo
300 ng/ml	Negativo	Negativo

    Posteriormente procedimos de la misma manera con los patrones de 0,1 mg%, 200, 300 y 500 ng/ml de Clorhidrato de Cocaína, preparados en el laboratorio, obteniéndose resultados positivos para el patrón de 0,1 mg% y para el de 500 ng/ml, dando negativo para el de 200 y 300 ng/ml, tanto para CCF como para LUV, (Tabla 3).

Tabla 3

Resultados obtenidos con CCF y LUV utilizando los patrones

de clorhidrato de cocaína

Patrones (Clorhidrato de Cocaína)	CCF	LUV
200 ng/ml	Negativo	Negativo
300 ng/ml	Negativo	Negativo
500 ng/ml	Positivo	Positivo
0,1 mg % ( 10.000 ng/ml )	Positivo	Positivo

DISCUSIÓN

    El constante incremento del consumo de drogas de abuso, va en paralelo con el incremento del compromiso por parte de los laboratorios de toxicología, en cuanto a que estos son llamados para satisfacer requerimientos epidemiológicos, terapéuticos, de diagnóstico, etc., todos ellos dentro de diferentes contextos, tales como sistemas legales, en los trabajos, en los deportes, centros de rehabilitación, etc., la importancia de esta tarea y en algunos casos las implicaciones legales que existen obligan a los laboratorios dedicados a la detección de drogas de abuso a que todas las técnicas analíticas que posee, bien sean presuntivas o de screening o confirmatorias, sean evaluadas constantemente⁽⁶⁾.

    El mayor reto para el laboratorio es la elección del procedimiento más apropiado para la detección preliminar o el screening de drogas de abuso. En este sentido, esto va a depender del número de muestras y analitos a determinar, el requerimiento de sensibilidad y especificidad del método, del personal con que se cuenta, de los equipos disponibles y del presupuesto del laboratorio⁽⁷⁾.

    Dentro de las técnicas analíticas, la CCF es un método ampliamente sugerido en la literatura por su sensibilidad y gran especificidad. En este sentido, Lillsunde y col.,⁽⁸⁾ establecieron que el límite de detección de la CCF para una gran variedad de drogas es de 1 mg/ml o menos, pero que para otro grupo dentro de las cuales se encuentra la cocaína es de 5 μg/ml, por su parte, Ferrara y col⁽⁶⁾ apuntan que el límite de detección para drogas de naturaleza ácida, básica y neutra es de al menos 1 μg/ml, mientras que Müeller y col⁽⁹⁾ establecieron que la CCF tiene una sensibilidad de 3 - 4 μg/ml para la benzoilecgonina en orina.

    En cuanto a la LUV, una de las aplicaciones de esta es que muchas drogas poseen un espectro de absorción ultravioleta único, lo cual es ampliamente utilizado en toxicología, es importante tomar en cuenta que la misma es más exacta a niveles de absorbancia entre 0,4 y 0,8 nm, si muy poca luz pasa a través de la muestra (alta absorbancia) la intensidad es muy difícil de medir, si mucha luz pasa a través de la muestra (baja absorbancia) es muy difícil distinguir la tramitancia de la muestra de la de referencia, lo cual está directamente relacionado con la concentración del analito⁽¹⁰⁾.

    Previa a la aplicación de ambos métodos debemos tener en cuenta que las muestras tienen que ser sometidas a un proceso de extracción, en este sentido Avendaño⁽¹¹⁾ señala que la determinación de fármacos en medios biológicos como orina y sangre, en las cuales los analitos están presentes en concentraciones muy bajas, requieren una preparación de la muestra más laboriosa mediante una extracción previa líquido-líquido por ejemplo de una fase acuosa a un solvente orgánico, o líquido-sólido, en cuyo caso un sólido (carbón activo, silica, alumina, resinas de intercambio iónico) retiene al compuesto en cuestión y deja pasar al resto, eluyéndose aquel posteriormente con el disolvente adecuado.

    Los resultados obtenidos en el presente análisis no reflejan la sensibilidad de la CCF y la LUV, lo que puede deberse entre otros factores, a diferencias en el método de extracción el cual puede variar de acuerdo a los reactivos empleados en su ejecución y la preparación de los mismos, más aún si se utilizan tubos de extracción comerciales fabricados para este fin, lo que permite realizar análisis con mayor grado de sensibilidad^{(6,8,12,13,14)}.

    Tal y como afirma Klaassen⁽¹⁵⁾, el método para separar un agente tóxico de la matriz en la cual está embebido está relacionado con las características del mismo, el desafío está en separar el agente tóxico con pureza y cantidad suficientes para permitir caracterizarlo y cuantificarlo. Los métodos para separación desde hace mucho han planteado un gran reto para los toxicólogos analíticos. El mismo autor sostiene, que las sustancias orgánicas no volátiles, tales como fármacos prescritos, sustancias ilegales, plaguicidas, productos naturales, etc., son sólidos o líquidos y los procedimientos de separación por lo general se fundamentan en extracciones diferenciales, sea líquido-líquido o sólido-líquido. Estas extracciones con frecuencia no son eficientes, y la recuperación de la sustancia tóxica desde la matriz puede ser inadecuada.

    En el caso concreto de la droga objeto de nuestro estudio, la cocaína, sabemos que es metabolizada en un gran porcentaje a benzoilecgonina, por esta razón, la mayoría de las veces en las orinas de pacientes consumidores de cocaína sólo se puede detectar benzoilecgonina, la droga original sólo se puede detectar en aquellos casos en que las concentraciones de benzoilecgonina son muy altas. Sin embargo, es muy importante emplear procedimientos en el proceso de extracción que aseguren la obtención de la benzoilecgonina. En este sentido, estos autores encontraron que añadiendo 7g de carbonato de potasio a la orina en lugar de amoníaco, para alcalinizar la muestra, se obtenía una mayor extracción de la benzoilecgonina⁽¹²⁾.

    Lillsunde y col⁽⁸⁾ someten la muestra de orina a un proceso de metilación para convertir la benzoilecgonina en cocaína, previo a la extracción y realizar esta última en tubos comerciales (Chem-Elut).

    Wallace y col⁽¹³⁾ demostraron que una mezcla al 20% de etanol en cloroformo (v/v) es excelente para la extracción tanto de la cocaína como de la benzoilecgonina.

    Para CCF, algunos autores emplean sistemas comerciales de elevada sensibilidad. Tal es el caso del sistema Toxi-Lab (Analytical System Division, Marion Laboratories, Irvine C.A.), el cual consta de Toxi-tubes A y B, en los que se realiza la extracción, cromatoplacas Toxi-Gram para la aplicación y corrida de la muestra y reactivos Toxi-Dip para preparar la cámara cromatográfica^(6,14).

    Otro factor relevante que pudiera haber afectado nuestro estudio, en el caso de la CCF, es que debido al límite de detección de la misma, entre 1 μg/ml y 5 μg/ml^(6,8,9), las cantidades de cocaína y/o benzoilecgonina en las muestras de orina procesadas por nosotros estuvieran por debajo del mismo, debido a que son muestras provenientes de pacientes farmacodependientes en proceso de rehabilitación, en los cuales la cantidad de droga excretada por la orina no alcanza concentraciones suficientemente altas como para ser detectadas por este método, pero sí por el ELISA, tomando en cuenta que el cutt-off de este último es muy inferior (300 ng/ml). Sin embargo, esto no descarta la utilidad de la CCF en nuestro laboratorio, ya que como lo afirma Sunshine⁽⁷⁾, este método tiene un potencial excelente cuando se espera que la droga se encuentra en la muestra en concentraciones relativamente altas.

    Por otra parte, hay que tomar en cuenta posibles fallas en el proceso de extracción, lo que impidió la recuperación total de la droga y por ende, su detección por CCF y por LUV.

CONCLUSIÓN

    A pesar que la CCF y la LUV nos han dado buenos resultados para detectar cocaína en muestras biológicas y no biológicas en las cuales las mismas se encuentra en concentraciones relativamente altas, los resultados obtenidos en nuestro estudio nos indican que estas metodologías, tal como las realizamos en nuestro laboratorio, no se pueden emplear para determinaciones presuntivas o de screening en muestras de orina provenientes de pacientes farmacodependientes en proceso de rehabilitación, en las cuales la droga se encuentra en concentraciones relativamente bajas.

AGRADECIMIENTO

Proyecto Individual financiado por el Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico (CDCH ).

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