M Hernández¹, HJ Finol², JC López³, I Fernández⁴, H Scannone⁵ y A Rodríguez-Acosta⁶.

¹ Estudiante de Doctorado. Sección de Inmunoquímica, Instituto de Medicina Tropical, Facultad de Medicina.– ² Profesor Titular. Centro de Microscopía Electrónica, Facultad de Ciencias.– ³ Investigador. Instituto de Investigaciones Farmacéuticas, Facultad de Farmacia.– ⁴ Asistente de Investigación. Instituto de Investigaciones Farmacéuticas, Facultad de Farmacia.– ⁵ Profesor Titular. Instituto de Investigaciones Farmacéuticas, Facultad de Farmacia. ⁶ Profesor Titular. Sección de Inmunoquímica, Instituto de Medicina Tropical, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela. E-mail: rodriguf@ucv.ve

RESUMEN: El conjunto de signos y síntomas cardiotóxicos, tales como taquicardia, bradicardia, trastornos del ritmo, que se describen en algunos pacientes envenenados por C. d. cumanensis, hace pensar, que existe actividad del veneno sobre las estructuras cardíacas. El veneno total del cascabel Crótalus durissus cumanensis, procedente de Caruachi, Estado Bolívar, presentó una DL₅₀ de 0,140 mg/Kg de peso. Los resultados de microscopia electrónica reportaron en las primeras 6 horas desorganización, pérdida del sistema contráctil y sistema sarcotubular hinchado. Capilares con abundantes prolongaciones y la luz parcialmente ocluida, el grosor de la pared endotelial fue variable con una notable disminución de vesículas pinocíticas y cavéolas, las mitocondrias hinchadas y degeneradas. A las 24 horas se observaron áreas con fibrillas contraídas, áreas de necrosis, por pérdida de la membrana plasmática. A las 48 horas los capilares se mostraron ocluidos, con aumento en el grosor de la pared, ruptura de la pared de la célula muscular, mitocondrias degeneradas y un aumento marcado de polisomas libres. Se apreció infiltrado de macrófagos. El objetivo de este trabajo se basa en describir por primera vez en la literatura, las alteraciones ultraestructurales del músculo cardíaco de ratones tratados con veneno crudo de Crótalus durissus cumanensis.

Palabras Clave: Cascabel, Corazón, Crótalus durissus cumanensis, Ultraestructura, Veneno.

ABSTRACT: The assortment of cardiotoxic signs and symptoms, such as tachycardia, bradycardia, and pace disorders that are described in some patient envenomed by C. d. cumanensis, makes to think that exists activity of the venom on cardiac structures. The crude venom of rattlesnake Crotalus durissus cumanensis, from Caruachi, Bolivar state, presented an DL₅₀ of 0,140 mg/Kg of weight. The results of electron microscopy reported in the first 6 hours, disorganization, loss of the contractile system and sarcotubular system swollen. Capillary with abundant prolongations and the light partially occluded. The endotelial wall width was variable with a notable decrease of pinocytic vesicles and caveols, mitochondria were swollen and degenerated. At 24 hours areas with contracted fibrils, necrosis, and loss of the plasmatic membrane were observed. At 48 hours the capillary were occluded, with increase in the width of the wall, wall muscular cell broken, degenerated mitochondria and an increase of free polisomas. It was appreciated infiltration of macrophages. The objective of this work is based on describing for the first time in the literature, the ultrastructural alterations of the cardiac mice muscle treated with Crotalus durissus cumanensis crude venom.

Key Words: Crotalus durissus cumanensis, Rattlesnake, Ultrastructure, Venom.

Fecha de Recepción: 14/09/04     Fecha de Aprobación: 18/04/05

Para comprender los efectos biológicos del veneno de serpiente, se debe conocer que se trata de una mezcla compleja de enzimas, toxinas y otras proteínas, destinados a la digestión de sus presas, cuyo efecto se combina en función de sus propiedades y proporciones; por otra parte la composición de estos venenos varía considerablemente de una especie a otra, explicando ello la diversidad de sus efectos biológicos(1-4).

Las principales manifestaciones clínicas causadas por la mordedura de serpientes y en especial Crotalus durissus cumanensis, son generalmente atribuidas a los efectos neurotóxicos de su veneno, la miotoxicidad sistémica (ocasionada fundamentalmente por fosfolipasas A₂)(7) y a los efectos sobre la hemostasia(1,5,6).

Al inyectar el veneno a animales de experimentación se conduce a una serie de drásticos eventos destructivos que se inician en la membrana plasmática y terminan con necrosis total del músculo. El objetivo de este trabajo se basa en describir por primera vez en la literatura, las alteraciones ultraestructurales del músculo cardíaco de ratones tratados con veneno crudo de Crotalus durissus cumanensis, ya que hasta ahora solo se han descrito alteraciones químicas y enzimáticas, con repercusión electrofisiológica del corazón y alteraciones estructurales en el músculo cardiaco(5,6,8), vistas con microscopía de luz.

Se utilizó un pool de veneno liofilizado y conservado a menos 70°C, hasta el momento de su utilización, de serpientes Crotalus durissus cumanensis, procedente de la localidad de Caruachi, Edo. Bolívar, mantenidas en cautiverio en el Serpentario de la Facultad de Farmacia y de la Sección de Inmunoquímica del Instituto de Medicina Tropical, Universidad Central de Venezuela.

Para las pruebas de determinación de Dosis Letal 50 (DL₅₀) y de miotoxicidad, se utilizaron ratones albinos de la cepa NIH, de 18–20 g, sexo masculino, procedentes del Bioterio del Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel".

La DL₅₀ se determinó mediante el método de Spearman & Karber propuesto por la Organización Mundial de la Salud(9), modificado por el Instituto Clodomiro Picado de Costa Rica(10,11). Se inocularon ratones machos albinos, con peso entre 18 y 20 gramos, por vía intraperitoneal, en volúmenes de 0,2 mL de diluciones seriadas de veneno y controles inyectados con solución salina. Se usaron cuatro ratones por dosis. Los animales fueron observados durante un período de 48 horas.

Se determinó mediante la observación de preparaciones de microscopía electrónica de músculo cardíaco de ratón. Se establecieron cinco grupos de trabajo, de cuatro ratones cada grupo y se inyectaron intraperitonealmente con una dosis sub-letal de 0.09 mg/Kg de peso, de veneno crudo de Crotalus durissus cumanensis. La toma de muestras para microscopía electrónica se llevó a cabo a las 3, 6, 24 y 48 horas post-inyección.

Estas muestras fueron procesadas en el Centro de Microscopía Electrónica de la Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela. Se tomaron fragmentos de tejido cardíaco: septum interauricular y paredes de aurículas de 1 mm de diámetro, de ratones inoculados con veneno y controles inyectados con solución salina. Fueron fijados inmediatamente en glutaraldehido al 2% en tampón cacodilato y post-fijados en tetraóxido de osmio al 1%; se deshidrataron e incluyeron en mezcla de Epón-Araldita. Se realizaron cortes de 1 mm de espesor en todos los bloques, los cuales se colorearon con azul de toluidina y se escogieron las áreas de interés para ser examinadas en cortes finos teñidos con acetato de uranilo y citrato de plomo, en un microscopio electrónico Hitachi HS-500.

El veneno total de la serpiente de cascabel Crotalus durissus cumanensis, procedente de la localidad de Caruachi, Estado Bolívar, presentó una DL₅₀ de 0,140 mg/Kg de peso. Los signos clínicos observados, fueron los característicos de los venenos neurotóxicos: incoordinación motora, disnea, taquicardia, parálisis espástica, convulsiones tónico-clónicas y muerte a causa de parálisis de los músculos respiratorios(2).

Los resultados de las observaciones en el microscopio electrónico de las muestras de músculo cardíaco de ratones envenenados con veneno total de Crotalus durissus cumanensis reportaron:

En las primeras 6 horas post-inyección, se aprecia desorganización y espacios de pérdida del sistema contráctil, sistema sarcotubular hinchado. Los capilares se observan con abundantes prolongaciones y la luz parcialmente ocluida, el grosor de la pared endotelial es variable con una notable disminución de vesículas pinocíticas y cavéolas, las mitocondrias encuentran hinchadas y degeneradas (figuras 1 y 2).

Figura 1

Figura 2

A las 24 horas existen áreas con fibrillas contraídas, otras áreas de necrosis de miofibrillas, por pérdida de la membrana plasmática, con persistencia de la membrana basal. Los capilares con las paredes engrosadas, y su electrondensidad no es uniforme, abundantes prolongaciones hacia su luz. La envoltura nuclear está ampliada y alterada (figuras 3 y 4).

Figura 3

Figura 4

A las 48 horas los capilares se muestran ocluidos, con aumento en el grosor de la pared, pérdida de la arquitectura del cardiomiocito, con ruptura de la pared de la célula muscular, mostrando los elementos libres, mitocondrias degeneradas y un aumento marcado de polisomas libres. Se aprecia infiltrado de macrófagos (figuras 5 y 6).

El conjunto de signos y síntomas cardiotóxicos, tales como taquicardia, bradicardia, trastornos del ritmo, que se describen en algunos pacientes envenenados por C. d. cumanensis, podría hacer pensar, desde el punto de vista clínico, que existe actividad del veneno sobre las estructuras cardíacas. Esto, fundamenta esta investigación, para tratar de evidenciar posibles lesiones en tejido cardíaco, producidas por este veneno. Los resultados demostraron, que los animales de experimentación sufrieron profundos daños vasculares, miotóxicos, de estructuras subcelulares y edema causados fundamentalmente por la metaloproteinasas y fosfolipasas de Crotalus que afectan principalmente la estructura endotelial de los capilares(17), probablemente debido a la acción proteolítica sobre las proteínas de la membrana basal(18).

El daño vascular endotelial causado por las proteasas del veneno de Crotalus de Caruachi (estado Bolívar), seguramente ocasiona un intenso edema y fenómenos hipóxicos, y estos a su vez, a procesos isquémicos que generarían la muerte celular.

En cuanto a los hallazgos por microscopía electrónica de esta investigación se tiene que en los cardiomiocitos se observaron alteraciones variadas de leves a severas, con un sistema sarcotubular dilatado; así como la presencia de áreas con pérdida de miofilamentos y destrucción de miofibrillas, probablemente causados por la actividad proteolítica del veneno crudo. Ya otros autores(13), estudiando distintos venenos de serpientes (Pseudechis australis), con actividades de proteasa y fosfolipasa, describían en autopsias rabdomiólisis masiva, así como, numerosos focos de necrosis miocárdica involucrando principalmente al ventrículo izquierdo y al septum. Sin embargo, otros reportes anatomopatológicos de víctimas mordidas por serpientes, cuyo veneno tiene actividad miotóxica sistémica, han revelado ausencia o alteraciones relativamente ligeras en el miocardio, en contraste al daño extenso del músculo esquelético(14-16).

En Brasil, Siqueira y colaboradores(19) reportaron daño miocárdico después de envenenamiento fatal de Crotalus durissus terrificus. Los datos de autopsia revelaron edema y miocitolisis difusa del miocardio, y la extraña presencia de focos de microinfartos recientes.

En conclusión, con base en estos hallazgos experimentales, se debe considerar que pacientes mordidos por Crotalus durissus cumanensis, pero principalmente por variedades ecológicas, que tienen alta actividad proteolítica y hemorrágica, hay que descartar procesos que afectan gravemente al corazón, tomando todas las medidas que detecten precozmente, alteraciones del ritmo y de la función cardiaca.

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