ESTUDIOS INMUNOQUÍMICOS DE CEPAS DE ESCHERICHIA COLI ENTEROTOXIGÉNICAS DEL TIPO TERMOLÁBIL

Jenniffer J Gutiérrez A, Sandra Z García S, María A De Jesús, H Cristina Grassi^*,Efrén D J Andrade, Leonidas Urdaneta E

^* Sección de Biotecnología. Instituto de Investigaciones. Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Universidad de Los Andes,
Telf.: (0274) 240.35.56, e-mail: cocoa@etheron.net. Mérida-Venezuela.

RESUMEN

Escherichia coli enterotoxigénica termolábil (ECET-TL) ha ocasionado un aumento en la morbilidad y mortalidad en humanos, siendo los métodos de diagnóstico existentes, complejos y costosos. El propósito de este estudio fue realizar evaluaciones inmunoquímicas sencillas con diferentes inmunosueros, preparados con fracciones de la cepa ECET-TL 1022 y confrontados con cepas de E. coli enterotoxigénicas y no Enterotoxigénicas de diferentes orígenes, para determinar la capacidad de los sueros de detectar la toxina (TL). La Inmunodifusión Radial resultó ser la técnica más apropiada bajo las condiciones de este trabajo. La Contrainmunoelectroforesis dio buenos resultados al introducir la modificación de permitir la difusión por 18 horas posterior a la electroforesis. El suero anti-periplásmico (II) demostró ser muy reactivo y específico, mientras que el suero anti-SDS-EDTA-ß-Mercaptoetanol (IV) fue específico pero poco reactivo.

Palabras clave: Enterotoxina termolábil, Escherichia coli, diagnóstico.

ABSTRACT

Enterotoxigenic Escherichia coli, heat-labile toxin (ETEC-LT) has been the cause of an increase in the mortality and morbidity in humans, with the addition that the diagnostic procedures are complex and expensive. The purpose of this study was to use immunosera prepared against fractions of ETEC-TL 1022 and to determine their ability to react against enterotoxigenic and non-enterotoxigenic strains of  E. coli in immunochemical assays. Radial Immunodiffusion turned out to be the most appropiate technique, although Counterimmunelectrophoresis gave good results if it is modified by having an 18 hours diffusion period post-electrophoresis. The antiserum that was directed against the periplasm was reactive and specific while the antiserum named anti-SDS-EDTA-ß-Mercaptoetanol was specific but not very reactive.

Key words: Heat-Labile Toxin, Escherichia coli, diagnosis.

La Escherichia coli habita normalmente en el tracto gastrointestinal sin causar enfermedad, pero puede poseer factores de virulencia con potenciales de colonización, producción de enterotoxinas, citotoxicidad o capacidad invasiva, pudiéndose convertir en uno de los principales causantes de diarreas acuosas (Aitken y Hirst, 1993). El principal mecanismo de patogenicidad usado por ECET para causar enfermedad consiste en la elaboración de toxinas como la enterotoxina termolábil (TL) y la enterotoxina termoestable (TE) (Pizza y col., 1994). Se han descrito dos serogrupos principales de la enterotoxina TL, TL-I y TL-II, las cuales no presentan reacción cruzada (Nataro & Koper, 1998). TL-I ha sido encontrada en cepas aisladas de animales y humanos, mientras que TL-II se encuentra fundamentalmente en aislados de animales y muy rara vez de humanos y nunca se ha asociado con patologías. Además, estos serogrupos presentan un 55-57% de homología entre las subunidades A de LT-I y LT-II y ninguna homología entre las subunidades B (Fukuta y col., 1988). La mejor comprensión de las toxinas TL y TE de las cepas ECET, pudiera contribuir con una disminución de la morbilidad y mortalidad humana ocasionadas por estas cepas. Por lo tanto, para avanzar en los estudios con las cepas de ECET, se requiere disponer de metodologías que permitan detectar las toxinas en el laboratorio de investigación para luego trasladarlas al laboratorio clínico. Estas metodologías deben ser sencillas y de bajo costo, permitiendo así la utilización diaria sin tener que recurrir a pruebas tradicionales, las cuales son complejas y costosas (Nataro y Kaper, 1998). Con el fin de contribuir con el diagnóstico de la enfermedad diarreica, en este trabajo se realizaron evaluaciones inmunoquímicas sencillas para confrontar inmunosueros dirigidos contra ECET-TL con cepas de E. coli enterotoxigénicas y no Enterotoxigénicas de diferentes orígenes para determinar la capacidad de los sueros de detectar la toxina TL.

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Muestras biológicas: i.- Sueros: Control (I), suero producido con amortiguador Tris-HCl, EDTA 0,003M, sacarosa 20%; Anti-periplásmico (II), suero producido contra la fracción periplásmica; Anti-SDS-EDTA (III), suero producido contra la fracción extraída con SDS-EDTA; Anti-SDS-EDTA-b-Mercaptoetanol (IV), suero producido contra la fracción extraída con SDS-EDTA-b-Mercaptoetanol. Los antisueros para las diferentes fracciones bacterianas se produjeron en conejos usando la cepa ECET-TL 1022, según la metodología descrita por De Jesús y col. (2000).

ii.-Cepas bacterianas: Se utilizaron cepas de E. coli no enterotoxigénicas denominadas 356, 322 (provenientes del Laboratorio de Biología Experimental, Facultad de Ciencias, ULA) y GY5027 (Mamber y col., 1984), cepas ECET designadas 1022, 1026, LV (Laboratorio de Síndromes Urinarios y Diarréicos, Dpto. Microbiología, Esc. Bioanálisis, Fac. Farmacia y Bioanálisis, ULA), EC-5 (Sección Biotecnología, Instituto de Investigaciones, Fac. Farmacia, ULA) y cepas E. coli enteroinvasiva (ECEI-I) y enteropatogénica (ECEP-I, ambas del Laboratorio de Síndromes Urinarios y Diarréicos, Dpto. Microbiología, Esc. Bioanálisis, Fac. Farmacia y Bioanálisis, ULA).

2. Cultivos bacterianos: Cada una de las cepas de E. coli 356, 322, GY5027, ECEI-I, ECEP-I, ECET-TL (1022, 1026, LV, EC-5) fueron cultivadas en medio agar tripticasa soya con el fin de reactivarlas y se incubaron a 37ºC por 24 – 48 horas. Luego cada cepa fue repicada en caldo Tripticasa Soya e incubada a 37ºC durante 24 h en condiciones de aerobiosis parcial en tubos de ensayo con tapa de rosca, sin agitación. Al cabo de este tiempo se recolectaron las células por centrifugación y se resuspendieron en amortiguador fosfato de sodio 0,1M pH 7,6.

3. Ensayos inmunoquímicos: Para la Inmunodifusión radial (IDR) se tomaron 50 µL de cada una de las cepas, agregándole a cada una dos gotas de tolueno, se agitó por 5 min., se dejó reposar junto al mechero por 15 min. para evaporar todo el tolueno, después se agregó a cada preparación 800 µL de agarosa. (se empleó agarosa al 1% en agua). En cada pozo se colocó un total de 100 µL de suero, en cinco aplicaciones sucesivas, cada una de 20 µL en un intervalo de tiempo de 6 – 12 h. Se dejó difundir de 24 – 72 h. Luego las láminas se lavaron con agua y se colocaron en ácido tricloroacético (TCA) 15% por 30 min., se conservaron en cámara húmeda hasta evidenciar halos de precipitación (Nowotny, 1979).

En la contrainmunoelectroforesis (CIE) se utilizó agarosa de alta electroendosmosis al 1% en Barbital 40mM Acetato de sodio 50mM HCl pH 8,4. Se emplearon las cepas 322, 356, ECET-TL (1022, 1026, LV, EC-5), ECEP-I, ECEI-I, GY5027 toluenizadas igual que en la IDR, además de los sueros anti-periplásmico (II) y anti-SDS-EDTA-b-Mercaptoetanol (IV). Las láminas se sometieron a corriente continua de 50 voltios por 4 h y luego de detenida la corrida, se observó el resultado de la electroforesis y se dejó difundir por 18 h en la misma cámara de electroforesis. Las láminas se lavaron con NaCl 0,9%, cambiando esta solución cada 6 h. por un período de 24 h. totales y se agregó TCA 15% durante 1 h (Nowotny, 1979). Las láminas se observaron antes del lavado, antes de agregar TCA y luego de agregar TCA.

RESULTADOS

En la IDR (Tabla 1) se evidenció que con el suero (II) hubo buena reacción y especificidad demostrada con un marcado halo de precipitación con la cepa ECET-TL LV, mientras que con las cepas ECET-TL (1022 y 1026) se presentaron halos no muy marcados y con la cepa ECET-TL EC-5, el halo fue muy tenue. Se observó la presencia de halos más tenues alrededor del suero (IV) con las cepas ECET-TL (1026 y LV). Las cepas no enterotoxigénicas no presentaron halos de precipitación al ensayarlas con los sueros. En cuanto a la CIE (Tabla 2), el suero (II) reaccionó de igual manera con las cepas ECET-TL 1026 y EC-5 y con las cepas no enterotoxigénicas GY5027 y ECEP-I, mientras que demostró una reacción muy tenue con la cepa no enterotoxigénica 356. Las cepas ECET-TL EC-5, ECEP-I y ECEI-I reaccionaron con el suero (IV). En la difusión permitida después de finalizada la CIE, hubo una fuerte reacción entre el suero (II) y la cepa ECET-TL EC-5 y entre el suero (IV) frente a las cepas ECET-TL (1026, LV y EC-5). Al agregar ácido tricloroacético a las láminas, el suero (II) presentó precipitación con todas las cepas excepto con las cepas 322 y ECEP-I, mientras que el suero (IV) precipitó con todas las cepas menos con la cepa LV. Esto podría indicar que la precipitación evidenciada por el ácido tricloroacético, pudiera ser no muy específica.

DISCUSIÓN

En el presente trabajo se utilizaron cepas enterotoxigénicas de E. coli que, si bien han sido caracterizadas como productoras de la toxina TL, no han sido diferenciadas en los serogrupos I y II. En este trabajo las cepas ECET fueron aisladas de casos de diarrea aguda, en un laboratorio especializado en el área y, debido a que son patógenos de humanos, muy probablemente pertenezcan al grupo I, lo cual concuerda con los resultados de IDR. En esos experimentos (Tabla 1), el inmunosuero anti-SDS-EDTA (III) demostró ser poco reactivo, al igual que el suero control (I), indicando que esta fracción no representa un inmunógeno adecuado. El inmunosuero anti-periplásmico (II) demostró ser el más reactivo y específico, mientras que el inmunosuero anti-SDS-EDTA- b-Mercaptoetanol (IV) parece ser específico pero poco reactivo. Estos resultados coinciden con lo señalado por Hirst y col. (1984), quienes indican que las subunidades A y B se encuentran en el líquido periplásmico y también están asociadas a la membrana celular. Asimismo, Roth (1988) menciona que TL no es exportada al medio externo, ya que se acumula en el espacio periplásmico o se encuentra unida a la membrana después de la destrucción de la bacteria. Es por ello que estos dos últimos (II y IV) fueron ensayados con la técnica de CIE seguida de una difusión que permitiera revelar reacciones adicionales (Tabla 2). Es evidente, a partir de los resultados de estas tablas, que la CIE tiende a ser menos específica y más reactiva que la difusión permitida posteriormente y que la IDR (Tabla 1) en las condiciones impuestas en este trabajo. Una posible explicación para estas diferencias, es que en las células enteras toluenizadas están presentes la holotoxina, la subunidad A (fragmento A1, fragmento A2), los dímeros de A, el pentámero B, los monómeros B, todos los cuales podrían tener diferencias de comportamiento durante la CIE, debido a diferencias en los puntos isoeléctricos (pI) de cada uno de los componentes de la toxina o debido a la producción de nuevas formas por reasociación o disociación causada por el campo eléctrico impuesto, de tal manera que se modifique la constante de difusión de algunos de esos componentes o de todos ellos. De hecho, el pI de la holotoxina es 6,9 (Spangler, 1992), lo que pudiera conducir a que a un pH 8,4 la carga neta podría ser francamente negativa. Por el contrario, debido al pI del monómero B (pI= 7,8) (Spangler, 1992), que es más alto que el de la holotoxina, éste podría no migrar en el mismo sentido de la CIE, dadas las condiciones del ensayo. Por todo esto, pensamos que la holotoxina y la subunidad A migran en el sentido esperado de la CIE, mientras que los monómeros de B podrían migrar en sentido contrario y/o difundir en las 18 h. posteriores a la electroforesis, reaccionando con el suero (IV) con gran eficiencia (Tabla 2). Esto se ajusta al hecho de que este suero fue obtenido con un antígeno que se preparó con b-Mercaptoetanol (que separa los monómeros B) y en presencia de adyuvante incompleto de Freund que esconde la subunidad A (Pizza y col., 1994). Es decir, ese suero fue preparado principalmente contra los monómeros B (Tabla 2), lo que indicaría que la cepa 1022 pudiera presentar diferencias en esa subunidad. Por otra parte, es importante señalar que la CIE favorece el encuentro entre antígenos y anticuerpos al hacerlos migrar unos contra otros, dependiendo de las características electroendosmóticas de la agarosa utilizada y del pH del amortiguador. Esto permite resaltar reacciones muy débiles, pero al mismo tiempo es una técnica más proclive a promover reacciones inespecíficas, tales como las que se observan con cepas no enterotoxigénicas. En un reporte anterior (De Jesús y col., 2000) en el cual se trabajó con las mismas cepas y los mismos sueros, se utilizaron células intactas, células tratadas con lisozima y células tratadas con el extractante del método comercial PHADEBACT. Por el contrario, en el presente trabajo se utilizan solamente células toluenizadas. El tolueno, además de hacer más permeables a las membranas celulares (Miller, 1972), como muchas moléculas orgánicas, puede modificar las estructuras celulares y las macromoléculas. Esto puede explicar la diferencia en la precipitación que se encuentra en el trabajo anterior (De Jesús y col., 2000), donde la cepa 1022 da un resultado positivo por CIE, usando el suero (II). Por otra parte, el resultado que se muestra para IDR (Tabla 1) de las células toluenizadas 1022 y LV, frente al antisuero (II) y el resultado que se muestra para CIE (Tabla 2) de las mismas muestras, difiere en que en el primer caso el resultado positivo con ambas cepas se obtiene al revelar con TCA, mientras que en el segundo caso, el resultado negativo de la CIE (Tabla 2) se obtiene en ausencia de TCA y de cualquier otro agente revelador. Todas estas diferencias pueden ser explicadas por el uso de tolueno como permeabilizante, además de que el tratamiento con TCA potencia la visualización de las bandas por la desnaturalización y precipitación de proteínas; sin embargo, al mismo tiempo se exacerban aquellas proteínas que hayan precipitado de manera inespecífica o que se hayan desnaturalizado durante la CIE.

CONCLUSIONES

La Inmunodifusión radial, IDR, resultó ser la técnica más apropiada, aunque la contrainmunoelectroforesis también dio buenos resultados si se modifica permitiendo un período de difusión de 18 h posterior a la electroforesis, sin incluir el lavado ni el tratamiento con ácido tricloroacético. La señal derivada de esta última técnica es la recomendada si se usa CIE con células toluenizadas y suero tipo IV. En cuanto a los inmunosueros, los sueros control (I) y anti-SDS-EDTA (III) demostraron ser poco reactivos tanto con cepas de E. coli enterotoxigénicas como no enterotoxigénicas. El suero anti-periplásmico (II) demostró ser muy reactivo y específico, mientras que el suero anti-SDS-EDTA-b-Mercaptoetanol (IV), a pesar de que fue muy específico, fue poco reactivo. La utilización de células enteras toluenizadas y provenientes de cultivos líquidos, es la mejor condición para obtener reacciones específicas en la identificación de cepas de ECET-TL. Por todo esto, se sugiere la utilización de IDR con células toluenizadas y antisuero tipo anti-periplásmico (II) para identificación de rutina, mientras que se sugiere la utilización de CIE, permitiendo la difusión posterior a la electroforesis, sin utilizar lavado ni TCA, con células toluenizadas y antisuero tipo anti-SDS-EDTA-b-Mercaptoetanol (IV) para fines de investigación.

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