Caracterización Morfológica y Bioquímica de Condrocitos in Vitro

Katiuska Pineda¹ ,Elizabeth Merentes² ,Rebeca Starosta²

¹ Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel", División de Producción de Vacunas Bacterianas, e-mail: kattypineda@hotmail.com.

² Instituto de Biología Experimental, Facultad de Ciencias, UCV.

Resumen

Actualmente los cultivos de condrocitos tienen una amplia aplicación clínica en el tratamiento de patologías del cartílago articular, así como también en la reconstrucción de cartílago auricular y nasal,utilizando sustratos naturales o sintéticos. En vista de la importancia de este tipo de cultivo, el siguiente trabajo tuvo como finalidad estandarizar la metodología para el establecimiento de los cultivos de condrocitos humanos y de pollo,evaluando el crecimiento de estas células en cultivos en monocapa y en matrices tridimensionales de colágeno tipo I, mediante técnicas histoquímicas, inmunohistoquímicas y bioquímicas. Los condrocitos humanos y de pollo cultivados sobre plástico a altas densidades mostraron un crecimiento en monocapa, destacándose una apariencia celular de tipo poliédrica con espacios prominentes entre ellas, donde se detectó la presencia de glicosaminoglicanos (GAG) componentes de la matriz extracelular, pero la producción de PG es baja y la mayor parte de éstos difunden al medio de cultivo debido a la falta de una matriz que los retenga. En cambio, en presencia de una matriz de colágeno tipo I, se le brinda a los condrocitos humanos y de pollo un espacio tri- dimensional que simula las condiciones en las que se encuentran in vivo, por lo cual los condrocitos mantienen su morfología esférica y sintetizan componentes de matriz característicos, como son GAG sulfatados y colágeno tipo II, que son marcadores de la estabilidad fenotípica de estas células.

Palabras claves: Condrocitos, proteoglicanos, matriz tridimensional, colágeno I.

Abstract

At the moment the chondrocytes culture have a wide clinical application in the treatment of pathologies of the articular cartilage,as well as in the reconstruction of auricular and nasal cartilage using natural or synthetic substrata. In view of the importance of this culture type, the following work had as purpose to standardize the methodology for the establishment of the cultures of human and chicken chondrocytes, evaluating the growth of these cells in culture in monocapa and in three-dimensional matrix of collagen type I, by means of histochemistry, inmunohistochemistry and bio- chemistry technical. The human and chicken chondrocytes cultivated on plastic to high densities they showed a growth in monocapa,standing out a cellular appearance of polyhedrical type with prominent spaces among them,where were de- tected components of the matrix extracelular such as glicosaminoglycans (GAG),but this production is low and most of these diffuse to culture medium due to the lack of a matrix that retains them.On the other hand,the matrix of collagen type I, offer to the human and chicken chondrocytes a three-dimensional space that simulates the "in vitro" conditions,and for that reason the chondrocytes maintains its spherical morphology and they synthesize characteristic matrix components such as sulfated GAG and collagen type II that are markers of the stability phenotypical of these cells.

Key words: Chondrocytes, Glicosaminoglycans, three-dimensional matrix, collagen I and II.

INTRODUCCIÓN

El cartílago hialino es un tejido conectivo especializado constituido por condrocitos, los cuales sintetizan componentes de la matriz extracelular. El mismo se encuentra rodeado por el pericondrio, el cual desempeña un importante papel en el crecimiento y mantenimiento del tejido. La matriz extracelular del cartílago está compuesta principalmente por proteoglicanos (PG) de tipo agrecán, los cuales están constituidos por glicosaminoglicanos (GAG) sulfatados (condroitín-4-sulfato,condroitín-6-sulfato y queratán sulfato) unidos de forma covalente a una proteína central. Además, esta matriz contiene fibras de colágeno tipo II, en menor proporción colágenos tipo IX,X y XI y una proteína de adhesión llamada condronectina que se une principalmente al colágeno tipo II, condroitin-4-sulfato,condroitin-6- sulfato y al ácido hialurónico (1). 

El cartílago es un tejido avascular al igual que la epidermis,por lo cual los nutrientes difunden a partir de los vasos sanguíneos del tejido conectivo que los circunda. Con base en esta característica, es posible establecer cultivos de condrocitos y reconstruir tejidos cartilaginosos in vitro, pero es importante tener en cuenta que la proliferación,expresión y mantenimiento del fenotipo característico de los condrocitos in vitro depende de las condiciones de cultivo, tales como suplementos del medio de cultivo (factores de crecimiento y otras sustancias), densidad de siembra, y tipo de sustrato utilizado (matrices naturales o sintéticas). La optimización de las técnicas in vitro utilizando estas condiciones ha permitido que los cultivos de condrocitos puedan ser usados para la restauración de daños en el cartílago articular humano, debido a la limitada capacidad de autorreparación que presenta este tejido (2). 

Basado en lo anteriormente expuesto,el siguiente trabajo tiene como finalidad el establecimiento de los cultivos de condrocitos humanos y de pollo en monocapa y en geles de colágeno tipo I, la caracterización morfológica por medio de técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicas y determinar bioquímicamente la presencia de agrecán en la matriz extracelular y en el medio de cultivo.

Materiales Y Metodos

Se utilizó cartílago proveniente del esternón de pollos jóvenes de 15 a 20 días de nacidos y muestras de cartílago nasal humano de diversas edades y sexo,provenientes de cirugías estéticas. Las muestras de cartílago se colocaron en P.B.S y se cortaron en trozos pequeños. Posteriormente se expusieron a un tratamiento enzimático realizado de forma secuencial. Primero se incubaron en una solución de tripsina a una concentración de 0,25%en medio Ham ’s F-12 sin suero durante 30 minutos en agitación a 37 ºC. Una vez transcurrido este tiempo se extrajo el sobrenadante y se incubaron los trozos en una solución de colagenasa tipo II (2 mg/ml) en medio Ham ’s F-12 suplementado con 10% de suero fetal de bovino (SFB) inactivado,durante 4 a 6 horas en agitación a 37 ºC.La suspensión celular obtenida, se centrifugó durante 10 minutos a 3500 rpm. 

Posteriormente se realizo el contaje celular en un hemocitómetro y las células del cartílago se sembraron en diferentes sustratos.

Establecimiento de los Cultivos de las Células del Cartílago

Las células obtenidas se resuspendieron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)y Ham F-12 mezclados en una proporción 3 a 1, y suplementado con 10% de SFB, ácido ascórbico 50 mg/ml, 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF),insulina 10 mg/ml, antibióticos y antimicóticos.

Posteriormente se determinó la viabilidad celular, usando el método del azul de tripano y se procedió a la siembra celular sobre plástico y en un sustrato tridimensional de colágeno tipo I obtenido de la cola de rata. 

Para preparar estos equivalentes de tejido,los condrocitos se mezclaron con el colágeno tipo I al 1%, a una densidad de 7 -9 x 10⁶ cel /ml y se mantuvieron en la estufa de CO₂ a 37 ºC durante 25 a 30 días, luego fueron procesados con las técnicas convencionales de histología y por técnicas bioquímicas para evaluar cualitativa y cuantitativamente la producción de componentes de la matriz extracelular por parte de estas células.

Caracterización Morfológica de los Cultivos

Para evaluar la presencia de componentes de la matriz extracelular, los cultivos en monocapa fueron fijados y posteriormente se realizaron las coloraciones con Safranina O para la determinación de glicosaminoglicanos sulfatados y Azul Alcian – PAS pH 2.5 para glicosaminoglicanos totales. En el caso de los condrocitos embebidos en el gel, se utilizaron las mismas coloraciones histoquímicas señaladas anteriormente, y también se determinó por inmunohistoquímica la presencia de los principales componentes de la matriz extracelular que son colágeno tipo II y agrecán.

Caracterización Bioquímica de los Cultivos

Los proteoglicanos (PG) y el ácido hialurónico (AH) fueron extraídos del tejido original, de las monocapas, de los equivalentes de colágeno por el método de Hascall y Sajdera (3), con modificaciones según Lauder y col.(4). 

Para obtener los glicosaminoglicanos y PG del medio de cultivo se utilizó una técnica de precipitación con cloruro de cetil piridinio. Una vez obtenidos los GAG y PG del medio de cultivo, monocapa,equivalentes, se procedió a cuantificar su contenido de ácidos urónicos (5). El agrecán fue identificado en estas muestras por su movilidad electroforética en agarosa, de baja electroendósmosis, al 0.75% en acetato de calcio 50 mM pH 6.8, y por el producto obtenido de su degradación con papaína, que es condroitín sulfato.

Resultados

Establecimiento y caracterización morfológica de los cultivos de condrocitos en monocapas y geles de colágeno 

Los condrocitos humanos y de pollo cultivados sobre plástico a altas densidades muestran un crecimiento en monocapa en los primeros días de cultivo, destacándose una apariencia celular de tipo poliédrica con espacios prominentes entre ellas (Fig.1A). Las células subcultivadas mantienen las mismas características morfológicas, incluso después del segundo subcultivo, y se observa una marcada proliferación celular. Se evaluó la presencia de GAG producidos por los condrocitos cultivados en monocapa y se pudo apreciar paspositividad en los agregados celulares más que en las células aisladas del cultivo, donde la región pericelular también se tiñe de azul (Fig.1B). 

Cuando los condrocitos humanos y de pollo fueron incluidos en geles tridimensionales se pudo apreciar que la mayoría de las células son esféricas, e inclusive algunas se encuentran en división a los 25 días de cultivo (Fig.2A). Así mismo, se observó que el gel adquiere una resistencia elástica y rigidez. 

En los cortes histológicos del gel de colágeno donde se ncluyeron los condrocitos humanos,se puede apreciar una intensa coloración naranja en toda la matriz con la safranina O (Fig.2B), mientras que en el equivalente de condrocitos de pollo se observó la tinción sólo en regiones limitadas de la matriz (Fig.2C). En el caso de la coloración con Azul Alcian pH 1, se pudo observar que las células con morfología esférica presentan una coloración azul intenso en la región pericelular o matriz territorial, lo cual indica la presencia de GAG altamente sulfatados en esa zona. En contraste, las células alargadas no presentan tinción alguna,mientras que el resto de la matriz se tiñe con menor intensidad (Fig.2D).

Cuando el anticuerpo contra colágeno tipo II fue ensayado sobre los cortes de equivalente de pollo se observó el marcaje positivo en ciertas regiones de la matriz, con una aparente organización paralela de las fibras en este último (Fig.3A). El anticuerpo contra proteoglicanos de condroitín sulfato fue ensayado sobre el tejido humano y de pollo, observándose el marcaje positivo en la mayoría de las células (Fig.3B).

Figura 1. A) Cultivo de condrocitos de pollo a siete días de cultivo primario en forma de monocapa, las células presentan morfología poliédrica con espacios prominentes entre ellas (flecha), además se observan muchas células en división (cabezas de flechas). 200X. B) Monocapa de condrocitos humanos. Se pueden observar agregados celulares PAS+ donde la región pericelular se tiñe de forma específica de color azul (flechas). Siete días de cultivo primario. 200X.

Caracterización Bioquímica

La cuantificación de ácidos urónicos permitió determinar la presencia de GAG y PG en el extracto de tejido original, en la matriz del equivalente y en los medios de cultivo.

Figura 2. A) Corte histológico del equivalente donde ser observan células en su mayoría esféricas (flechas sencillas), células en división (estrella) y células alargadas en menor proporción (cabeza de flecha). 20X, coloración H/E. B) Evaluación histoquímica con Safranina O del equivalente de condrocitos humanos, donde se aprecia la tinción de toda la matriz. 26 días de cultivo. 20X. C) Equivalente de condrocitos de pollo, donde se observa la tinción de algunas regiones de la matriz. 25 días de cultivo. 20X. D) Evaluación histoquímica con Azul alcian pH 1 del equivalente de condrocitos de pollo donde se observan células esféricas con una tinción azul intenso en la región pericelular (flechas), mientras que las células alargadas no presentan tinción alguna (cabezas de flechas). 25 días de cultivo. 20X.

Figura 3. A Evaluación inmunohistoquímica de los condrocitos de pollo incluidos en el gel, con un anticuerpo contra colágeno tipo II, donde se observan regiones de la matriz marcadas positivamente y una aparente organización de las fibras en forma paralela (flechas). 25 días de cultivo. 20X. B) Evaluación inmunohistoquímica del equivalente de condrocitos de pollo, con un anticuerpo contra proteoglicanos de condroitín sulfato, donde ser observan células de morfología esférica (flechas) y células alargadas (cabezas de flechas) marcadas positivamente. 25 días de cultivo. 40X.

En contraste, no se detectaron en el extracto de las monocapas celulares. 

En la Fig.4 se puede apreciar la diferencia en el comportamiento de los condrocitos de pollo y de humano incluidos en las matrices tridimensionales a los 25-26 días de cultivo. En el equivalente de pollo sólo una fracción de los ácidos urónicos queda retenida en el gel (49,5%) y otra similar  (50,5%) es liberada al medio, mientras que en el equivalente humano la mayor parte de los ácidos urónicos producidos (92%) permanecen retenidos en el gel y una fracción muy pequeña (8%) es liberada al medio a los 26 días de cultivo. Esto sugiere que a diferencia del cultivo en monocapa, cuando los condrocitos son incluidos en una matriz tridimensional de colágeno tipo I se estimula la producción de GAG y PG por parte de estas células. 

Cuando se determinaron las propiedades del agrecán en el medio de cultivo y equivalentes de muestras de pollo y humano se pudo observar una banda correspondiente al extracto equivalente humano (27 años,masculino), el cual presenta menor movilidad que el tejido. Cuando el EH es digerido con papaína (E_{H +pap}) se observa una banda estreha con igual movilidad que la del condroitín sulfato (Fig.5A). Esto demuestra que las células bajo esas condiciones de cultivo están produciendo agrecán, que al ser digerido con papaína da como producto de degradación condroitín sulfato. Por otra parte,en el análisis realizado a los medios de cultivo del equivalente de condrocitos de pollo se pudo observar la presencia de una banda a los 20 días de cultivo con movilidad similar a la del Tp. Una vez que el extracto de medio es digerido con papaína, se aprecia una banda estrecha con igual movilidad a la del Cs. (Fig.5B).

Figura 4. Cuantificación de ácidos urónicos en cultivos de condrocitos de pollo y humano. No se aprecian diferencias relevantes en el contenido de ácidos urónicos en el equivalente y en el medio de cultivo de condrocitos de pollo a los 25 días (25d), en comparación con el cultivo de condrocitos humanos a los 26 días (26d).

Figura 5. Electroforesis en agarosa de cultivos de condrocitos de cartílago nasal humano en geles de colágeno tipo I. A) Se aprecia una banda simple para el equivalente de condrocitos humanos (E_H ), con igual movilidad que el Cs una vez que éste es digerido con papaína (E_{H +pap}). La cabeza de flecha corresponde al ácido hialurónico. B) Cultivo de condrocitos de pollo en geles. Se aprecia una banda proveniente del medio de cultivo M₂₀ de igual movilidad que la del Tejido (Tp). Cuando el M₂₀ es digerido con papaína (M_{20 +pap}) se observa una banda que migra igual que el Cs.

Discusion

Actualmente el cultivo de condrocitos representa una alternativa terapéutica en la reparación de cartílago, el cual tiene una limitada capacidad de autorreparación. En este sentido, se han hecho esfuerzos en el establecimiento de las condiciones óptimas del cultivo que permitan la proliferación,expresión y mantenimiento del fenotipo característico de los condrocitos in vitro. Se ha determinado que esto depende de los diferentes suplementos del medio de cultivo, densidad de siembra y sustrato. En este trabajo se estableció la metodología para el cultivo de condrocitos humanos y de pollo, que hasta el momento, según nuestro conocimiento no había sido desarrollada en nuestro país. Principalmente se comparó el cultivo de condrocitos en monocapa con el cultivo en matrices tridimensionales de colágeno tipo I. 

El cultivo en monocapa es utilizado con la finalidad de estimular la proliferación de los condrocitos, ya que bajo estas condiciones éstos se dividen rápidamente. Actualmente se está utilizando este sistema para la implantación directa de células autologas para la restauración de daños en el cartílago articular humano.(6) 

La matriz de colágeno tipo I, brinda a los condrocitos humanos y de pollo un espacio tridimensional que simula las condiciones en las que se encuentran in vivo, por lo que la mayoría de las células mantiene su morfología esférica y sintetizan componentes de matriz característicos como son GAG sulfatados y colágeno tipo II. Como se mencionó anteriormente, estos componentes de la matriz extracelular han sido reportados como marcadores de la estabilidad fenotípica de condrocitos en cultivo (7), y que fueron evidenciados en este trabajo. 

Se conoce que el crecimiento, la morfología y la diferenciación celular están profundamente influenciados por la composición del ambiente extracelular y que agentes extracelulares tales como factores solubles y la matriz extracelular,entre otros, regulan la actividad catabólica y biosintética de los condrocitos in vivo (8,9), por lo cual es probable que la matriz de colágeno tipo I esté favoreciendo procesos anabólicos en los condrocitos, como son la producción de agrecán y colágeno tipo II. 

En los cultivos de pollo se libera una mayor cantidad de PG al medio debido probablemente a su incapacidad de formar agregados con el ácido hialurónico, debido a la menor producción de la proteína de unión que estabiliza la agregación de los monómeros de PG al ácido hialurónico, por lo cual éstos difunden al medio de cultivo. El agrecán del cartílago de pollo difiere del humano, tal como se espera, por tratarse de especies diferentes. Ambos constituyen una población heterogénea que migra como una banda ancha en la electroforesis, pero tiene como único producto de degradación detectable al condroitín sulfato. 

El agrecán sintetizado por las células en cultivo difiere del agrecán obtenido del tejido original, aun cuando las cadenas de condroitín sulfato parecen ser similares. Estas diferencias se podrían atribuir a cambios estructurales de los PG, tales como longitud y número de las cadenas de condroitín sulfato y keratán sulfato, longitud de la proteína central, cambios en los patrones de sulfatación, degradación por proteasas, entre otros. 

Cuando se analiza la morfología y la producción de componentes de matriz extracelular por los condrocitos en los diferentes sustratos utilizados en este trabajo, podemos destacar que el cultivo en la matriz tridimensional de colágeno tipo I tiene una serie de ventajas sobre el cultivo en monocapa, ya que se mantiene la morfología esférica de las células y la producción de componentes de matriz característicos del fenotipo de los condrocitos in vivo. Por otra parte,la matriz del equivalente de condrocitos humanos y de pollo presenta una gran resistencia elástica, que lo hace fácil de manipular. Con base en estos resultados podemos sugerir que bajo estas condiciones se obtiene un equivalente de tejido in vitro con ciertas características similares al cartílago in vivo. Antes de aplicar los condrocitos humanos cultivados en los geles de colágeno,c omo una alternativa terapéutica para reparar daños en cartílago nasal y articular humano, habría que realizar estudios de biocompatibilidad del sustrato para prevenir el rechazo inmunológico.

Bibliografía

1. Gartner, L., Hiatt, J. (1997). Histología texto y atlas. Primera edición. México. 114-120.        [ Links ]

2. Freed, L., Martin, I., and Vunjak-Novakovic (1999). Frontiers in tissue engineering. Clin.Orthop. 367S: 46-58.        [ Links ]

3. Hascall, V., Yanagishita, M., Calabro, A., Midura, R.,Rada, J., Charkravarti, S., Hassell, J. (1995). Isolation and characterization of proteoglycan core protein. Extracelular Matrix. Oxford University Press. 221-240.        [ Links ]

4. Lauder, R., Huckerby, T., Nieduszynski, I. (2000) Increased incidence of unsulphated and 4-sulphated residues in the chondroitin sulphated linkage region observed by high-pH anion-exchange chromatography. Biochem. J. 347: 339-348.        [ Links ]

5. Bitter, T., and Muir, M. (1962). A Modified Uronic Acid Carbazole Reaction. Biochem. Anal. 4: 330-334.        [ Links ]

6. Peterson L., Brittberg M., Kiviranta I., Akerlund E., y Lindahl A. (2002) Autologous chondrocyte ransplantation. Biomechanics and long-term durability. Am. J. Sports Med. 30(1): 2-12.        [ Links ]

7.Lemare, F., Steimberg, N., Griel, C., Demignot, S., Adolphe, M.(1998). Dedifferentiated chondrocytes cultured in alginate beads: restoration of the differentiated phenotype and of the metabolic responses to interleukin-1b. J. Cell. Physiol.176: 303-313.        [ Links ]

8. Perka, C., Spitzer, R., Lindenhayn, K., Sittinger, M., Schultz, O. (2000). Matrix-mixed culture: new methodology for chondrocyte culture and preparation of cartilage transplants. Biomed. Mater. Res. 49: 305-311.        [ Links ]

9. Hering, T.M.(1999). Regulation of chondrocyte gene expression. Frontiers in Bioscience. 4: 743-761.        [ Links ]